Summary
Uppnå hög kvalitet och lämplig mängd mänskliga skär är en av de framstående förutsättningarna för en framgångsrik ö-transplantation. I denna video beskriver vi steg för steg förfarandena för mänskliga bukspottkörteln holme isolering (del II: rening och kultur för mänskliga öar) med hjälp av en modifierad automatiserad metod.
Abstract
Hantering av typ 1 diabetes är betungande, både för individen och samhället, kostar över 100 miljarder dollar årligen. Trots den utbredda användningen av glukos övervakning och nya formuleringar insulin, många individer utvecklar fortfarande förödande sekundära komplikationer. Pankreas ö-transplantation kan återställa nära normal blodsockerkontroll hos diabetespatienter
Protocol
1. Rening av holmar
- För att starta holmen rening förfarande, ladda COBE väskan, klämma alla rör, utom de gröna rör, och ställ in hastigheten till 1500 och super ut till 0.
- I huven ställa in pumpen och lutning bägare och koppla insamlingen slangen till grön tunnelbanelinje.
- Nu lastningen av Ficoll 1,100 kan börja: tryck på "spin" tillsätt sedan 110 ml Ficoll 1,100 till fronten bägaren, och starta pumpen för att ladda COBE påsen. Som Ficoll är laddad, tryck super ut, stoppa pumpen, unclamp pumphuvudet och ställ in super ut hastigheten till 100.
- När Ficoll når bägaren och all luft pressas ur slangen, åter klämma på pumpen. Ställ in centrifugeringshastigheten till 3000, och super upp hastigheten till 0.
- Nu förbereder sig för att ladda gradienter genom att hälla den tunga lutning i den främre bägaren. Något släpp klämman mellan de två bägare att ta bort luft. Häll sedan ljuset lutning i ryggen bägaren.
- Slå på magnetomrörare, tryck på "spin" på COBE-maskinen, ta bort klämman från röret som förbinder två bägare, och visuellt kontrollera att tunga och lätta gradienter blandar.
- När gradienter började blanda, slå på centrifugen. Vänta en minut och slå sedan på pumpen för att ladda blandning lutningar.
- För att ladda vävnaden låt gradienten köra låg i främre bägaren, men inte tillräckligt låg för att släppa in luft lastning röret, sedan spänna röret som förbinder bägare och ladda vävnad.
- Fortsätt att lägga till resten av vävnaden. Tvätta sedan röret som höll vävnaden med 50 ml tvättlösning, och använda den för att tvätta fram bägaren.
- Som den sista av vävnad in i väskan, samtidigt stoppa pumpen, unclamp vid pumpen huvudet, och klämma slangen över påsen. Fortsätt att Centrifugera i 5 minuter.
- Medan centrifugering fortsätter föra 12 kollektionen rör till huven och lossa sina mössor. Fäst samlingen slangen till den gula slangen och placera den sterila samlingen spetsen i koniska rör 1. Sedan unclamp den gula tuben, och klämma den gröna slangen.
- När spin slutar, sakta höja Superout till 100. Samla 150 ml i rör 1. Sedan samlar 30 ml i rör 2-12 (200 till 230 ml).
- När insamlingen är klar, tryck på "STOP" på COBE. Nu när reningen har upphört, kan holmarna bedömas och odlade.
2. Provtagning och kultur
- Efter att samla den renade holmar fraktioner, ta bort ett prov från varje av de 12 kollektionen rör och fläcken med Dithizone. Färgningen kommer att visa vilka lager innehåller hög renhet holmar vs lager med låg renhetsgrad holmar.
- Samla hög och låg renhet vävnad och poolen var tillsammans.
- Spin och tvätta två gånger. Efter den andra tvätta, ta volymen av varje till 250 ml med sista tvätten medier.
- För att bedöma den poolade fraktionerna börja med att ta två 1 ml-prover från de höga av poolade fraktioner och en 1 ml prov från låga. Överför varje 1ml provet i en konisk tub innehåller 9 ml tvättlösning.
- Sedan överför 1 ml från varje 15 ml rör till en räkna maträtt. Undersök och räkna cellerna under mikroskop.
- Efter att ha räknat cellerna beräkna antalet flaskor som behövs för att kulturen holmarna med följande formel: (totalt EIN / renhet holmar i decimal) / (30.000 EIN per flaska). Till exempel är 100 tusen holmar med 90% renhet odlade i 4 kolvar.
- Överför holmar att T175 kolvar och kultur i ett 37 ˚ C och 5% CO 2 inkubator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trots betydande framsteg inom tekniken för mänskliga holmen isolering, holme ger fortfarande är mycket varierande och oförutsägbar. Rening av smält bukspottskörteln vävnad är avgörande för att återställa en tillräcklig isle massa efter framgångsrik enzymatisk spjälkning för transplantation. UIC rening metod rekommenderas eftersom en överlägsen återhämtning av mycket rent mänskligt holmar visades med hjälp av denna metod. Dessutom kan upp till 50 ml smält vävnad laddas i en enda Cobe köra för rening, vilket minimerar ischemi-associerade skada av det mänskliga holmar genom att korta den sammanlagda tiden på isolering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Med stöd av grundarna från University of Illinois i Chicago samt Islet Cell Resource Center NIH bidrag (RFA-RR 05-003), den Christopher Foundation, Efroymson Foundation och Tellabs stiftelsen.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter Inc. | 424803 | |
| Cobe 2991 Cell Processor | equipment | Gambro. BCT | 2556 | islet purification |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Microsystems | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nalge Nunc international | 174926 | islet counting |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon Instruments | 217267 | |
| COBE bag | disposable equipment | O.R. Solution | 66707003 | |
| T175 culture flask | disposable equipment | Sarstedt Ltd | 83.1812.500 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-597-CM | |
| Ficoll 1.100 | reagent | Bichrom AG | L6155 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-784-CM | |
| Final wash/Culture Medium | reagent | Mediatech, Inc. | 99-785-CV | |
| Dithizone | reagent | Sigma-Aldrich | D5130 |
References
- Shapiro, A. M. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Nano, R. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
- Barbaro, B. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).
- Ricordi, C. Islet isolation assessment in man and large animals. Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).
