Summary
, Yüksek kalite ve insan adacıklar uygun miktarda sağlamak başarılı bir adacık nakli için önemli önkoşullar biridir. Bu video, adım adım tarif insan pankreas adacık izolasyonu (Bölüm II: insan adacıklar arıtma ve kültür) için prosedürleri değiştirilmiş bir otomatik yöntemi kullanarak.
Abstract
Tip 1 diyabet Yönetimi, yıl içinde 100 milyar dolar maliyet, hem birey ve toplum, külfetli. Glikoz izleme ve yeni insülin formülasyonları yaygın kullanımına rağmen birçok kişi hala yıkıcı ikincil komplikasyonlar gelişir. Pankreas adacık nakli, diyabetik hastalarda normal glukoz kontrolü yakın geri yükleyebilirsiniz
Protocol
1. Adacık saflaştırılması
- Adacık arıtma işlemi başlatmak için, COBE çanta yüklemek yeşil tüp hariç tüm tüpler kelepçe ve 0 1.500 için hızını ayarlamak ve süper.
- Kaputun pompa ve degrade bardak kurma ve toplama boru yeşil tüpüne bağlamak.
- : "Spin" sonra ön behere 110 ml Ficoll 1.100 itin ve COBE çanta yüklemek için pompa start Şimdi Ficoll 1.100 yükleme başlayabilirsiniz. Ficoll yüklü olduğundan, süper dışarı basın durdurmak pompa, pompa kafası çözülme ve 100 süper çıkış hızını ayarlamak.
- Ficoll beher ulaşır ve boru, pompa başında yeniden-klemp tüm hava dışarı atılır. 3.000 spin hız ve süper çıkış hızı 0 olarak ayarlayın.
- Şimdi ön behere ağır degrade dökerek gradyanlar yüklemek için hazırlar. Hafif herhangi bir havayı çıkarmak için iki bardak arasındaki kelepçe bırakın. Sonra ışık degrade arka behere dökün.
- Manyetik karıştırıcı açın, COBE makine "spin" tuşuna basın, iki bardak bağlayan tüp kelepçe kaldırmak ve görsel olarak, ağır ve hafif gradyanlar karıştırma olduğundan emin olun.
- Gradyanlar karıştırma başladıktan sonra, santrifüj açmak. Bir dakika bekleyin ve sonra karıştırma gradyanlar yüklemek için pompa açın.
- Doku degrade ön beher düşük çalıştırmak yük, ancak hava yükleme tüp girmek için yetecek kadar düşük, daha sonra bardak bağlayan tüp reclamp ve doku yüklemek için.
- Dokusunun geri kalanını eklemeye devam edin. Daha sonra 50 ml yıkama solüsyonu ile doku düzenlenen tüp yıkama ve ön beher yıkamak için kullanın.
- Doku son çanta girerken, aynı anda, pompa durdurmak pompa başındaki çözülme ve yastığının üzerine boru kelepçe. 5 dakika santrifüj devam edin.
- Santrifüj devam ederken, kaput için 12 toplama tüpleri getirmek ve onların kapakları gevşetin. Sarı tüp toplama boru takın ve steril toplama ucu konik tüp 1 içine yerleştirin. Sonra sarı tüp çözülme ve yeşil tüp kelepçe.
- Spin sona erdiğinde, yavaş yavaş 100 Superout yükseltmek. 1 tüp 150 ml toplayın. Sonra (200-230 ml) 30 ml tüpler 2-12 toplamak.
- Koleksiyonu tamamlamak, COBE "DUR" itin. Şimdi bu arıtma sona erdi, adacıklar değerlendirilmeli ve kültür olabilir.
2. Örnekleme ve kültür
- Saflaştırılmış adacıklar kesirler topladıktan sonra, her biri 12 toplama tüpleri bir örnek çıkarın ve Dithizone ile leke. Boyama katmanları düşük saflık adacıklar yüksek saflıkta adacıklar vs katmanları içeren gösterecektir.
- Yüksek ve düşük saflıkta doku ve havuz her bir araya toplayın.
- Spin ve iki kez yıkayın. Final Yıkama medya ile ikinci yıkamadan sonra, her birinin hacmi 250 ml getirmek.
- Değerlendirmek için toplanmış fraksiyonları düşük havuzlanmış kesirler ve bir 1 ml örnek yüksek iki 1 ml örnek alarak başlar. Her 1 ml örnek 9 ml yıkama solüsyonu içeren konik bir tüp içine aktarın.
- Daha sonra, her 15 ml tüp sayma çanak 1 ml transfer. Hücrelerin mikroskop altında incelemek ve saymak.
- (Ondalık adacıklar toplam EIN / saflık) / (şişesi ortalama 30.000 EIN): hücreler, kültür, aşağıdaki formül kullanılarak adacıklar için gerekli şişe sayısını hesaplamak sayımından sonra. Örneğin, 100.000 adacıklar% 90 saflıkta 4 şişeler kültür.
- 37 T175 matara ve kültür adacıkları transfer ˚ C ve% 5 CO 2 inkübatör.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Insan adacık izolasyon teknikleri konusunda önemli gelişmeler olmasına rağmen, adacık verimi son derece değişken ve öngörülemez kalır. Arıtma sindirilir pankreas dokusu nakli başarılı enzimatik sindirim sonra yeterli bir isle kütlesi kurtarmak için çok önemlidir. Bu yöntemi kullanarak, son derece saf bir insan adacıklar üstün bir kurtarma gösterildi, çünkü UIC arıtma yöntemi tavsiye edilir. Ayrıca, 50 ml kadar sindirilmiş doku böylece insan adacıklar iskemi ile ilişkili yaralanma izolasyon kullanılan toplam süre kısaltarak en aza indirmek, arıtma için işletilen bir tek COBE yüklenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Adacık Hücre Kaynak Merkezi NIH hibe (RFA-RR 05-003), Christopher Vakfı Efroymson Vakfı ve Tellabs Vakfı olarak, Chicago Illinois Üniversitesi kurucu olarak tarafından desteklenen.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter Inc. | 424803 | |
| Cobe 2991 Cell Processor | equipment | Gambro. BCT | 2556 | islet purification |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Microsystems | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nalge Nunc international | 174926 | islet counting |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon Instruments | 217267 | |
| COBE bag | disposable equipment | O.R. Solution | 66707003 | |
| T175 culture flask | disposable equipment | Sarstedt Ltd | 83.1812.500 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-597-CM | |
| Ficoll 1.100 | reagent | Bichrom AG | L6155 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-784-CM | |
| Final wash/Culture Medium | reagent | Mediatech, Inc. | 99-785-CV | |
| Dithizone | reagent | Sigma-Aldrich | D5130 |
References
- Shapiro, A. M. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Nano, R. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
- Barbaro, B. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).
- Ricordi, C. Islet isolation assessment in man and large animals. Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).
