Summary
تحقيق الجودة العالية وكمية مناسبة من الجزر الإنسان هي واحدة من أبرز الشروط لنجاح زرع جزيرة. في هذا الفيديو ، ونحن تصف خطوة بخطوة لإجراءات العزل جزيرة البنكرياس الإنسان (الجزء الثاني : تنقية الثقافة والجزر البشرية) باستخدام أسلوب تعديل الآلي.
Abstract
إدارة مرض السكري نوع 1 هو مرهقة ، سواء على الفرد والمجتمع ، وتكلف أكثر من 100 مليار دولار سنويا. على الرغم من الاستخدام الواسع النطاق للرصد الغلوكوز والانسولين صياغات جديدة ، وتطوير العديد من الأفراد لا تزال مضاعفات ثانوية مدمرة. ويمكن زرع البنكرياس جزيرة بالقرب من استعادة السيطرة على مستويات الجلوكوز الطبيعي في مرضى السكري
Protocol
1. تنقية الجزر
- لبدء إجراءات تنقية جزيرة ، تحميل الحقيبة كوبي ، المشبك جميع الأنابيب عدا أنبوب الخضراء ، وضبط السرعة إلى 1500 والسوبر خارج إلى 0.
- هود في إعداد الأكواب المضخة والانحدار وتوصيل أنابيب جمع في أنبوب الخضراء.
- الآن يمكن التحميل من ficoll 1،100 تبدأ : دفع "تدور" ثم يضاف 110 مل من Ficoll 1،100 إلى الدورق الجبهة ، وبدء ضخ لتحميل الحقيبة كوبي. كما يتم تحميل Ficoll ، اضغط عظمى خارج ، ووقف ضخ ، unclamp رئيس المضخة وضبط السرعة من السوبر إلى 100.
- عندما يصل ficoll الدورق ويطرد كل الهواء من الأنابيب ، المشبك في إعادة رأس المضخة. تعيين سرعة الدوران إلى 3000 ، وسرعة فائقة إلى 0.
- الآن التحضير لتحميل التدرجات بصب التدرج الثقيلة في دورق الجبهة. الافراج قليلا المشبك بين الأكواب اثنين إلى إزالة أي الهواء. ثم يسكب الضوء التدرج في الدورق الى الوراء.
- بدوره على النمام المغناطيسي ، واضغط على "تدور" على الجهاز كوبي ، إزالة المشبك من الأنبوب الذي يربط بين الأكواب اثنين ، والتحقق بصريا أن التدرجات الثقيلة والخفيفة والاختلاط.
- بمجرد أن بدأ خلط التدرجات ، بدوره على جهاز الطرد المركزي. الانتظار دقيقة واحدة ، ثم تشغيل المضخة لتحميل التدرجات الاختلاط.
- لتحميل الأنسجة اسمحوا التدرج تشغيل منخفضة في الدورق الجبهة ، لكنه ليس ضعيفا بما يكفي للسماح بدخول الهواء في أنبوب التحميل ، ثم reclamp الأنبوب الذي يربط بين الأكواب وتحميل الأنسجة.
- واضاف ان يستمر بقية الأنسجة. ثم يغسل الأنبوب الذي عقد في النسيج مع 50 مل من محلول الغسيل ، واستخدامه لغسل الدورق الجبهة.
- وكان آخر من يدخل نسيج كيس ، في وقت واحد وقف ضخ ، unclamp على رأس المضخة ، وأنابيب المشبك فوق الحقيبة. تواصل أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق.
- في حين لا يزال الطرد المركزي ، ليصبح أنابيب جمع 12 إلى غطاء محرك السيارة وتخفيف قبعاتهم. إرفاق أنابيب جمع إلى أنبوب الصفراء ، ومكان غيض جمع العقيمة في أنبوب مخروطي الشكل 1. unclamp ثم الأنبوب الأصفر ، والمشبك أنبوب الخضراء.
- عندما تدور تنتهي ، ورفع ببطء Superout إلى 100. جمع 150 مل في أنبوب 1. ثم جمع 30 مل في أنابيب 12/02 (200-230 مل).
- بمجرد اكتمال جمع ، ودفع "إيقاف" في كوبي. الآن بعد أن انتهت تنقية ، يمكن تقييم الجزر والمثقفين.
2. أخذ العينات والثقافة
- بعد جمع الكسور الجزر منقى ، أخذ عينة من كل من أنابيب جمع 12 وصمة عار مع Dithizone. سوف تظهر البقع التي تحتوي على طبقات عالية النقاء الجزر مقابل طبقات مع نقاء الجزر المنخفضة.
- جمع الأنسجة النقاوة العالية والمنخفضة وتجمع كل معا.
- تدور ويغسل مرتين. بعد غسل الثاني ، جعل حجم كل منها 250 مل مع وسائل الاعلام اغسل النهائي.
- لتقييم الكسور المجمعة تبدأ أخذ اثنين من عينات 1 مل من المستوى العالي من الكسور المجمعة وعينة واحدة 1 مل من منخفضة. نقل كل عينة 1ml في أنبوب مخروطي يحتوي على 9 مل من محلول الغسيل.
- ثم نقل 1 مل من كل أنبوب 15 مل إلى طبق العد. فحص وفرز الخلايا تحت المجهر.
- بعد عد الخلايا حساب عدد القوارير اللازمة لثقافة الجزر باستخدام الصيغة التالية : (EIN الكل / نقاء من الجزر في العشرية) / (30000 EIN في قارورة). على سبيل المثال ، يتم تربيتها 100000 الجزر مع نقاء 90 ٪ في 4 القوارير.
- نقل إلى الجزر T175 القوارير والثقافة في 37 ˚ C و 5 ٪ CO 2 الحاضنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من التقدم الكبير في تقنيات العزل جزيرة الإنسان ، جزيرة الغلة يبقى متغير بدرجة كبيرة وغير متوقعة. تنقية نسيج البنكرياس هضمها أمر حاسم لاستعادة جزيرة كتلة كافية بعد الهضم الأنزيمي ناجحة لزرع الأعضاء. ويوصى الأسلوب لأن تنقية UIC وقد تجلى انتعاش متفوقة من الجزر الإنسان نقية للغاية باستخدام هذا الأسلوب. وعلاوة على ذلك ، يمكن تحميل ما يصل الى 50 مل من الأنسجة هضمها في كوب واحد الترشح للتنقية ، والتقليل بالتالي نقص تروية المرتبطة إصابة الجزر الإنسان عن طريق اختصار الوقت الإجمالي المستخدمة في العزل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
بدعم من المؤسسين من جامعة إلينوي في شيكاغو ، وكذلك جزيرة خلية منح مركز الموارد المعاهد الوطنية للصحة (RFA - RR 05-003) ، ومؤسسة كريستوفر ، ومؤسسة Efroymson ، ومؤسسة Tellabs.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter Inc. | 424803 | |
| Cobe 2991 Cell Processor | equipment | Gambro. BCT | 2556 | islet purification |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Microsystems | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nalge Nunc international | 174926 | islet counting |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon Instruments | 217267 | |
| COBE bag | disposable equipment | O.R. Solution | 66707003 | |
| T175 culture flask | disposable equipment | Sarstedt Ltd | 83.1812.500 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-597-CM | |
| Ficoll 1.100 | reagent | Bichrom AG | L6155 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-784-CM | |
| Final wash/Culture Medium | reagent | Mediatech, Inc. | 99-785-CV | |
| Dithizone | reagent | Sigma-Aldrich | D5130 |
References
- Shapiro, A. M. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Nano, R. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
- Barbaro, B. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).
- Ricordi, C. Islet isolation assessment in man and large animals. Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).
