Summary
Het bereiken van hoge kwaliteit en de juiste hoeveelheid van de menselijke eilandjes is een van de prominente voorwaarden voor een succesvolle transplantatie eilandjes van Langerhans. In deze video, beschrijven we stap voor stap de procedures voor de menselijke eilandjes van Langerhans isolatie (deel II: zuivering en cultuur van de menselijke eilandjes) met behulp van een aangepaste automatische methode.
Abstract
Het beheer van type 1 diabetes is belastend, zowel voor het individu en de samenleving, voor meer dan 100 miljard dollar per jaar. Ondanks het wijdverbreide gebruik van glucose monitoring en nieuwe insuline-formuleringen, veel mensen nog steeds te ontwikkelen verwoestende secundaire complicaties. Eilandjes van Langerhans transplantatie kan herstellen in de buurt van normale glucose-controle bij patiënten met diabetes
Protocol
1. Zuivering van eilandjes
- Om te beginnen het eilandje zuivering procedure, laadt u de COBE zak, klem alle buizen, behalve de groene buis, en zet de snelheid op 1500 en de super uit op 0.
- In de kap het opzetten van de pomp en de gradiënt bekers en sluit de collectie slang aan op de groene buis.
- Nu het laden van de Ficoll 1.100 kan beginnen: druk op "spin" dan 110 ml Ficoll 1.100 toe te voegen aan de voorkant beker, en start de pomp om de COBE zak te laden. Omdat de Ficoll is geladen, drukt u op super uit, stop de pomp, ontspan de pomp hoofd en zet de super uit snelheid naar 100.
- Wanneer de Ficoll de beker bereikt en alle lucht uit de slang, re-klem aan de pomp hoofd. Stel het toerental tot 3000, en de super uit snelheid naar 0.
- Nu voor te bereiden op de hellingen belasting door het gieten van de zware helling in de voorkant beker. Iets laat de klem tussen de twee bekers om de lucht te verwijderen. Giet vervolgens het licht helling in de rug beker.
- Zet de magneetroerder, drukt u op "spin" op de COBE machine, verwijder de klem van de buis die de twee bekers, en visueel te controleren of de zware en lichte hellingen zijn mixen.
- Zodra de hellingen begonnen met het mengen, zet de centrifuge. Wacht een minuut, en zet vervolgens de pomp aan het mengen gradiënten te laden.
- Voor het laden van het weefsel laat de gradiënt lage uitgevoerd in de front beker, maar niet laag genoeg zodat de lucht naar de laad-buis in te voeren en Span de buis die de bekers en de belasting van het weefsel.
- Ga door het toevoegen van de rest van het weefsel. Was daarna de buis die het weefsel gehouden met 50 ml wasoplossing, en gebruik deze om de voorkant beker te wassen.
- Als laatste van het weefsel komt in de zak, stop tegelijkertijd de pomp, ontspan aan de pomp hoofd, en klem slangen boven de zak. Blijf centrifuge gedurende 5 minuten.
- Tijdens het centrifugeren blijft, brengt de 12 collectie buizen aan de motorkap en los te maken van hun petten. Bevestig de collectie slang aan op de gele buis, en plaats de steriele collectie punt in een conische buis. Dan ontspan de gele buis, en klem de groene buis.
- Wanneer de spin is afgelopen, langzaam verhogen Superout tot 100. Verzamel 150 ml in een buis. Dan verzamel 30 ml in tubes 2-12 (200-230 ml).
- Zodra collectie is compleet, druk op "STOP" op de COBE. Nu dat zuivering is beëindigd, kan de eilandjes worden beoordeeld en gekweekt.
2. Sampling en cultuur
- Na het verzamelen van de gezuiverde fracties eilandjes, verwijderen van een monster uit elk van de twaalf collectie buizen en vlek met Dithizone. De kleuring zal blijken welke lagen bevatten hoge zuiverheid eilandjes vs lagen met een lage zuiverheid eilandjes.
- Verzamel de hoge en lage zuiverheid weefsel en het zwembad elke samen.
- Spin en was twee keer. Na de tweede wasbeurt, breng het volume van elk 250 ml met Final Wash media.
- Voor de beoordeling van de verzamelde fracties te beginnen door het nemen van twee 1 ml monsters van het hoogtepunt van de samengevoegde fracties en een 1 ml monster uit de laag. Overdracht elk 1ml monster in een conische buis met 9 ml wasoplossing.
- Dan breng 1 ml van elk 15 ml buis tot een tellen schotel. Onderzoek en tellen van de cellen onder de microscoop.
- Na het tellen van de cellen te berekenen van het aantal kolven nodig is om de cultuur van de eilandjes met de volgende formule: (totaal EIN / zuiverheid van de eilandjes in decimalen) / (30000 EIN per fles). Bijvoorbeeld, zijn 100.000 eilandjes met 90% zuiverheid gekweekt in vier kolven.
- Breng de eilandjes voor T175 kolven en cultuur in een 37 ˚ C en 5% CO 2 incubator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ondanks de aanzienlijke vooruitgang in de technieken van de menselijke eilandje isolatie, eilandje opbrengst blijven zeer variabel en onvoorspelbaar. Zuivering van verteerd pancreas weefsel is van cruciaal belang om voldoende massa eiland te herstellen na de succesvolle enzymatische vertering voor transplantatie. De UIC zuiveringsmethode is aanbevolen omdat een superieur herstel van zeer zuivere menselijke eilandjes werd aangetoond met behulp van deze methode. Bovendien kan tot 50 ml van verteerd weefsel worden geladen in een enkele run Cobe voor de zuivering, waardoor het minimaliseren van de ischemie-geassocieerde letsels van de menselijke eilandjes door verkorting van de totale tijd op isolatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Ondersteund door de oprichting van de Universiteit van Illinois in Chicago als Islet Cell Resource Center NIH-subsidie (RFA-RR 05-003), de Christopher Foundation, de Efroymson Foundation, en de Tellabs Foundation.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter Inc. | 424803 | |
| Cobe 2991 Cell Processor | equipment | Gambro. BCT | 2556 | islet purification |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Microsystems | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nalge Nunc international | 174926 | islet counting |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon Instruments | 217267 | |
| COBE bag | disposable equipment | O.R. Solution | 66707003 | |
| T175 culture flask | disposable equipment | Sarstedt Ltd | 83.1812.500 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-597-CM | |
| Ficoll 1.100 | reagent | Bichrom AG | L6155 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-784-CM | |
| Final wash/Culture Medium | reagent | Mediatech, Inc. | 99-785-CV | |
| Dithizone | reagent | Sigma-Aldrich | D5130 |
References
- Shapiro, A. M. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Nano, R. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
- Barbaro, B. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).
- Ricordi, C. Islet isolation assessment in man and large animals. Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).
