Summary
Das Erreichen hoher Qualität und ausreichender Menge menschlicher Inselchen ist einer der führenden Voraussetzungen für eine erfolgreiche Inseltransplantation. In diesem Video, beschreiben wir Schritt für Schritt die Verfahren für die menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation (Teil II: Reinigung und Kultur der menschlichen Inseln) mit einer modifizierten automatisierte Methode.
Abstract
Management von Typ 1 Diabetes ist belastend, sowohl für den Einzelnen und die Gesellschaft, im Wert von über 100 Milliarden Dollar jährlich. Trotz der weit verbreiteten Verwendung von Glukose-Monitoring und neue Insulin-Formulierungen, viele Menschen immer noch zu entwickeln verheerenden Folgekomplikationen. Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Transplantation kann bei normalen Blutzuckerspiegels bei Diabetes-Patienten wiederherstellen
Protocol
1. Reinigung von kleinen Inseln
- So starten Sie die Insel Reinigungsverfahren, laden Sie die COBE Tasche, klemmen alle Rohre mit Ausnahme der grünen Röhre, und die Geschwindigkeit auf 1.500 und der Super-out auf 0 gesetzt.
- In der Haube Einrichten der Pumpe und Gradienten Bechern und verbinden Sie die Sammlung Schlauch an die grüne Röhre.
- Nun ist die Belastung des Ficoll 1,100 kann beginnen: push "spin" fügen Sie dann 110 ml Ficoll 1,100 bis vorne Becher, und starten Sie die Pumpe, um die COBE Tasche zu laden. Da die Ficoll eingelegt ist, drücken Super Out, stoppen Sie die Pumpe, ausspannen Pumpenkopf und stellen Sie die Super-out Geschwindigkeit auf 100.
- Wenn die Ficoll das Becherglas erreicht und alle Luft aus dem Schlauch, re-Klemme am Pumpenkopf vertrieben. Stellen Sie die Schleuderdrehzahl bis 3.000, und der Super-out zu 0 aus.
- Nun bereiten die Gradienten durch Eingießen der schweren Steigung in den vorderen Becher zu laden. Leicht Release der Klemme zwischen den beiden Bechern, um die Luft zu entfernen. Dann gießen Sie den leichten Steigung in den Rücken Becher.
- Schalten Sie den Magnetrührer, drücken Sie auf "Spin" auf dem COBE-Maschine, entnehmen Sie die Klemme den Schlauch zwischen den beiden Bechern und visuell überprüfen, ob die schweren und leichten Steigungen mischen.
- Sobald die Gradienten begonnen Mischen, auf der Zentrifuge drehen. Warten Sie eine Minute, und dann an der Pumpe drehen, um die Vermischung Gradienten zu laden.
- So laden Sie das Gewebe lassen die Steigung gering laufen in den vorderen Becher, aber nicht niedrig genug, damit die Luft, um das Laden Rohr geben, dann umzuspannen das Verbindungsrohr die Becher und laden das Gewebe.
- Weiter Hinzufügen der Rest des Gewebes. Dann waschen die Röhre, die das Gewebe mit 50 ml Waschlösung gehalten, und es verwenden, um den vorderen Becher zu waschen.
- Als letzter des Gewebes in die Tasche, stop gleichzeitig die Pumpe, Ausspannen am Pumpenkopf, und klemmen Schlauch über der Tasche. Weiterhin für 5 Minuten zentrifugiert.
- Während der Zentrifugation weiter, bringen den 12-Röhrchen auf der Motorhaube und lockern ihre Mützen. Bringen Sie die Sammlung Schlauch an den gelben Schlauch, und legen Sie die sterile Sammlung Spitze in konischen Rohr 1. Dann Ausspannen den gelben Schlauch, und klemmen Sie die grüne Röhre.
- Am Ende der Spin, langsam erhöhen Superout bis 100 auf. Sammeln Sie 150 ml in Röhrchen 1. Dann sammeln 30 ml in Röhrchen 2-12 (von 200 bis 230 ml).
- Nach der vollständigen Erfassung abgeschlossen ist, drücken Sie "STOP" auf dem COBE. Jetzt, Reinigung beendet ist, können die kleinen Inseln beurteilt und kultiviert werden.
2. Sampling und Kultur
- Nach dem Sammeln der gereinigten Inseln Fraktionen, entfernen Sie eine Probe aus jedem der 12 Sammelröhrchen und Fleck mit Dithizon. Die Färbung wird zeigen, welche Schichten enthalten hochreine Inseln vs Schichten mit geringer Reinheit Inselchen.
- Sammeln Sie die hohen und niedrigen Reinheit Gewebe und Pool jeweils zusammen.
- Spin und waschen zweimal. Nach dem zweiten Waschen, bringen die Lautstärke der einzelnen zu 250 ml mit Final Wash Medien.
- Zur Beurteilung der gepoolten Fraktionen beginnen, indem sie zwei 1 ml-Proben aus dem hohen der vereinigten Fraktionen und einer 1 ml Probe aus dem niedrig. Übertragen Sie jede 1ml Probe in einem konischen Rohr mit 9 ml Waschlösung.
- Dann je 1 ml von je 15 ml Tube zu einem Zählschale. Untersuchen und zählen Sie die Zellen unter dem Mikroskop.
- Nach Auszählung der Zellen zu berechnen die Anzahl der Flaschen benötigt, um Kultur der Inseln mit folgender Formel: (insgesamt EIN / Reinheit der Inseln in dezimal) / (30.000 EIN pro Flasche). Zum Beispiel sind 100.000 Inseln mit 90% Reinheit in 4-Kolben kultiviert.
- Übertragen Sie die Inseln zu T175 Flaschen und Kultur in einem 37 ˚ C und 5% CO 2-Inkubator.
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Discussion
Trotz erheblicher Fortschritte in der Technik der menschlichen Inselzellen isoliert bleiben Insel Ertrag sehr variabel und unvorhersehbar. Die Reinigung der verdauten Pankreasgewebe ist entscheidend, um eine ausreichende Insel Masse nach erfolgreicher enzymatische Verdauung für die Transplantation zu erholen. Die UIC Reinigungsverfahren wird empfohlen, da eine höhere Gewinnung von hochreiner menschlichen Inselchen mit dieser Methode nachgewiesen wurde. Darüber hinaus können bis zu 50 ml verdaute Gewebe in einem einzigen Cobe zur Reinigung laufen geladen werden, damit die Minimierung der Ischämie-assoziierte Verletzungen der menschlichen Inseln durch eine Verkürzung der Gesamtzeit auf Isolierung verwendet.
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Acknowledgments
Unterstützt von der Gründung an der University of Illinois at Chicago sowie Inselzell Resource Center NIH (RFA-RR 05 bis 003), der Christopher-Stiftung, die Efroymson Foundation, und die Tellabs-Stiftung.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter Inc. | 424803 | |
| Cobe 2991 Cell Processor | equipment | Gambro. BCT | 2556 | islet purification |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Microsystems | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nalge Nunc international | 174926 | islet counting |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon Instruments | 217267 | |
| COBE bag | disposable equipment | O.R. Solution | 66707003 | |
| T175 culture flask | disposable equipment | Sarstedt Ltd | 83.1812.500 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-597-CM | |
| Ficoll 1.100 | reagent | Bichrom AG | L6155 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-784-CM | |
| Final wash/Culture Medium | reagent | Mediatech, Inc. | 99-785-CV | |
| Dithizone | reagent | Sigma-Aldrich | D5130 |
References
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