Summary
Alcançar alta qualidade e quantidade adequada de ilhotas humanas é um dos pré-requisitos importantes para o transplante de ilhotas bem sucedido. Neste vídeo, descrevemos passo a passo os procedimentos para o isolamento de ilhotas pancreáticas humanas (parte II: purificação e cultura de ilhotas humanas) utilizando um método modificado automatizado.
Abstract
Gestão da diabetes tipo 1 é onerosa, tanto para o indivíduo ea sociedade, custando mais de 100 bilhões de dólares anualmente. Apesar do uso generalizado de monitoramento de glicose e insulina novas formulações, muitas pessoas ainda desenvolvem devastadoras complicações secundárias. Transplante de ilhotas pancreáticas pode restaurar controle quase normais de glicose em pacientes diabéticos
Protocol
1. Purificação de ilhotas
- Para iniciar o processo de purificação de ilhotas, carregar o saco de COBE, braçadeira todos os tubos exceto o tubo verde, e defina a velocidade para 1.500 e os super fora a 0.
- Na capa configurar os copos bomba e gradiente e conectar o tubo de coleta para o tubo verde.
- Agora o carregamento do Ficoll 1,100 pode começar: push "spin" em seguida, adicione 110 ml de Ficoll 1,100 para o copo da frente, e começar a bomba, a fim de carregar o saco de COBE. Como o Ficoll é carregado, pressione super-out, parar a bomba, unclamp a cabeça da bomba e definir a velocidade com super 100.
- Quando o Ficoll atinge o copo e todo o ar é expulso da tubulação, re-braçadeira na cabeça da bomba. Definir a velocidade de rotação de 3.000, ea velocidade com super 0.
- Agora prepare-se para carregar os gradientes vertendo o gradiente pesado no copo da frente. Ligeiramente liberar o grampo entre os dois copos para remover qualquer ar. Em seguida, despeje o gradiente de luz para o copo de volta.
- Ligar o agitador magnético, pressione "spin" na máquina COBE, remova o grampo do tubo que conecta os dois copos, e verifique visualmente se os gradientes pesados e leves são a mistura.
- Uma vez iniciados os gradientes de mistura, ligar a centrífuga. Espere um minuto, e depois ligar a bomba para carregar os gradientes de mistura.
- Para carregar o tecido deixa o gradiente escassear no copo da frente, mas não baixa o suficiente para permitir que o ar a entrar no tubo de carga, então reclamp o tubo que liga os copos e carregar o tecido.
- Continue adicionando o resto do tecido. Em seguida, lave o tubo que mantinha o tecido com 50 ml de solução de lavagem, e usá-lo para lavar o copo da frente.
- Como o último do tecido entra no saco, simultaneamente parar a bomba, unclamp na cabeça da bomba e pinça tubagens acima do saco. Continuar a centrifugar por 5 minutos.
- Enquanto continua a centrifugação, trazer os 12 tubos de coleta para a capa e afrouxe suas tampas. Conecte o tubo de coleta para o tubo amarelo, e colocar a ponta de coleta estéril em um tubo cônico. Então unclamp o tubo amarelo, e prender o tubo verde.
- Quando termina a rodada, levante lentamente Superout a 100. Coletar em tubo de 150 ml 1. Em seguida, coletamos 30 ml em tubos de 2-12 (200-230 ml).
- Uma vez que coleção é completa, pressione "STOP" no COBE. Agora que terminou de purificação, as ilhotas podem ser avaliados e cultura.
2. Amostragem e cultura
- Depois de coletar as frações purificadas ilhotas, retirar uma amostra de cada um dos 12 tubos de coleta e mancha com Ditizona. A coloração vai mostrar quais são as camadas contêm ilhotas de alta pureza versus camadas com ilhotas de baixa pureza.
- Recolher as tecido de alta pureza e baixa e piscina de cada conjunto.
- Spin e lavar duas vezes. Depois da segunda lavagem, reduzir o volume de cada um para 250 ml com a mídia Wash Final.
- Para avaliar a frações pooled começar por tomar duas amostras de 1 ml do alto das frações agrupadas e uma amostra de 1 ml da baixa. Transferência de cada amostra de 1 ml para um tubo cônico contendo 9 ml de solução de lavagem.
- Em seguida, transferir 1 ml de cada tubo de 15 ml a um prato de contagem. Examinar e contar as células ao microscópio.
- Após a contagem das células calcular o número de frascos necessários à cultura das ilhotas usando a seguinte fórmula: (EIN total / pureza de ilhotas em decimal) / (30.000 EIN por frasco). Por exemplo, 100 mil ilhotas com pureza de 90% são cultivadas em 4 frascos.
- Transferir os ilhéus para T175 frascos e cultura num 37 ˚ C e 5% CO 2 incubadora.
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Discussion
Apesar de avanços significativos nas técnicas de isolamento de ilhotas humanas, o rendimento de ilhotas permanecem altamente variável e imprevisível. Purificação do tecido pancreático digeriu é crucial para recuperar uma massa isle suficiente após digestão enzimática de sucesso para transplante. O método de purificação UIC é recomendado porque uma recuperação superior de alta pureza ilhotas humanas foi demonstrada usando este método. Além disso, até 50 ml de tecido digerido pode ser carregado em uma única Cobe correr para a purificação, minimizando assim a isquemia associada lesão das ilhotas humanas, encurtando o tempo total utilizado no isolamento.
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Acknowledgments
Suportado pela fundação da Universidade de Illinois em Chicago, bem como celular Islet Resource Center NIH subvenção (RFA-RR 05-003), a Fundação Christopher, a Fundação Efroymson, ea Fundação Tellabs.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter Inc. | 424803 | |
| Cobe 2991 Cell Processor | equipment | Gambro. BCT | 2556 | islet purification |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Microsystems | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nalge Nunc international | 174926 | islet counting |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon Instruments | 217267 | |
| COBE bag | disposable equipment | O.R. Solution | 66707003 | |
| T175 culture flask | disposable equipment | Sarstedt Ltd | 83.1812.500 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-597-CM | |
| Ficoll 1.100 | reagent | Bichrom AG | L6155 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-784-CM | |
| Final wash/Culture Medium | reagent | Mediatech, Inc. | 99-785-CV | |
| Dithizone | reagent | Sigma-Aldrich | D5130 |
References
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