Summary
Esta técnica expõe a Drosophila neuromusculature embrionárias para imuno-histoquímica ou gravação eletrofisiológico. É útil para o estudo de eventos no início do desenvolvimento neuromuscular ou a realização de eletrofisiologia em mutantes que não podem eclodir.
Abstract
Drosophila é um modelo premier genética para o estudo de ambos o desenvolvimento embrionário e neurociência funcional. Tradicionalmente, esses campos são muito afastadas umas das outras, com histórias em grande parte independentes e comunidades científicas. No entanto, a interface entre esses campos normalmente díspares são os programas de desenvolvimento subjacente aquisição de propriedades funcionais elétricos de sinalização e diferenciação das sinapses químicas funcionais durante as fases finais da formação de circuitos neurais. Esta interface é uma área extremamente importante para a investigação. Em Drosophila, estas fases de desenvolvimento funcional ocorrem durante um período de <8 horas (a 25 ° C) durante o último terço da embriogênese. Este período final de desenvolvimento foi considerado por muito tempo intratáveis devido a investigação para a deposição de um resistente, impermeável cutícula epidérmica. Um avanço de avanço foi a aplicação de cola de água polimerização cirúrgica que pode ser aplicado localmente para a cutícula para que a dissecção controlada de embriões em estágio avançado. Com uma incisão dorsal longitudinal, o embrião pode ser deitadas, expondo o cordão nervoso ventral e musculatura da parede do corpo à investigação experimental. Este sistema tem sido fortemente usada para isolar e caracterizar mutantes genéticos que impedem a formação da sinapse embrionárias e, assim, revelar os mecanismos moleculares que regem a especificação e diferenciação das conexões sinápticas funcionais sinapse e propriedades de sinalização.
Protocol
Parte 1: Equipamentos e Suprimentos
- Um microscópio de dissecção bom é necessário para dissecção embrião; aumento de 40 vezes é sugerido, com 25X de olhos pedaços ao máximo aumentar a ampliação.
- Forceps multa (número 5) são necessários para a seleção manual de embriões e devitellinization de embriões.
- Equipamentos para fazer e modificar agulhas finas de vidro é necessário. Puxado vidro agulhas são necessários para a dissecção. Nós preferimos vidro sólido para dissecção (duram mais), mas tubos de vidro padrão de paredes espessas (diâmetro externo 1-1,5 mm) funciona tão bem. Algumas pessoas usam agulhas de tungstênio fino, eletrolítica para a nitidez desejada em um banho de 1M NaOH utilizando uma bateria de 10 + autotransformador Amp. Agulhas dissecção afiada de tungstênio têm o benefício que eles são relativamente resistentes e de longa duração. Agulhas de vidro oco (formada semelhante a correção eletrodos grampo) estão ligados a tubos de plástico e usado durante a dissecção para sucção e expulsão de solução salina, bem como a liberação controlada de cola. Uma variedade de puxadores de vidro estão disponíveis para a fabricação de agulhas de vidro. Computador programado extratores podem ser predefinidos para puxar uma variedade de formas e tamanhos. A Brown-Flaming modelos (Sutter Instrument Co.) são amplamente favorecidos. Um microscópio composto (20-40X objetivo) deve estar disponível para inspecionar e modificar eletrodos antes do uso.
- Dois tipos de soluções são comumente usados para o banho de tecidos embrionários durante a dissecção: 1) "standard" (Jan e Jan, 1976a) ou "padrão modificado" (Broadie, 2000) salinas, com base em soluções comumente utilizadas para a gravação em outros sistemas de invertebrados e 2) "hemolinfa-like" (HL) salinas (Stewart et al 1994), um compromisso entre a solução salina padrão e as concentrações iónicas medidas na hemolinfa Drosophila. Note-se que nenhuma dessas salinas imitar com precisão a composição química da hemolinfa in vivo (Broadie, 2000). Padrão de solução salina contém (em mM): 135 NaCl, KCl 5, 4 MgCl 2, CaCl 2 1,8, 72 de sacarose, 5 TES, pH 7.2. Experimentadores também pode querer considerar salina inseto comercialmente preparado (Media Insect por exemplo Schneider), que é inadequado para a gravação eletrofisiológicas mas muito provavelmente para proteger a saúde dos tecidos expostos.
Parte 2: Estadiamento Embrião e Dissection
- Para coleta de ovos ideal, manter jovens (<7 dias), do sexo masculino saudáveis e moscas fêmeas (20-40) em potes de doce, que por 2-3 dias. Deitado potes comumente consistem em copos de 100 ml de plástico (Tri-Pour) perfurada para proporcionar a circulação de ar adequada, cobrindo uma placa de agar 60 mm. Placas de ágar contém maçã ou suco de uva temperado com agar. Existem várias receitas, mas um exemplo é a seguinte: 700 ml de água, 25-30 agar gramas, 300 ml de suco concentrado (uva ou maçã), 0,5 g metil paraben (p-hydroxymethylbenzoate), e 30g de açúcar. Autoclave da água e ágar, e, separadamente, ferver a p-hydroxymethylbenzoate com o açúcar e suco. Misture o suco de agar e soluções e rapidamente despeje em placas de 60 mm, removendo as bolhas.
- Antes da coleta de ovos, as moscas são alimentados com pasta de levedura (7 gramas de fermento de padeiro em 9 ml de água armazenada a 4 ° C) em placas fresca, trocada pelo menos duas vezes por dia durante pelo menos dois dias. De dia 3, um bom vaso deve produzir 100-200 ovos por hora. Postura melhor ovo é observado em um pote mantido em seu lado com o agar na placa riscada. Muitos embriões serão colocados dentro ou ao lado da arranhões.
- Para coletar um grande número de embriões, delicadamente a transferência dos embriões a partir da placa de ágar em uma cesta usando um pincel. A cesta pode ser feita com um tubo de centrífuga de 15 ou 50 ml. Cortar o fundo deixando área de superfície suficiente para prender uma tela (70 mesh mm) entre a tampa ea parte superior do tubo. Enxágüe os embriões com dH 2 0 e colocar em uma placa de Petri de lixívia 50% a 100% fresca para remover o córion exterior. Alternativamente, os ovos podem ser recolhidos individualmente usando uma pinça fina, e dechorionated, colocando-os manualmente em uma gota de água sanitária. De-chorionation pode levar de 30 segundos a dois minutos (lixívia fresca é muito mais rápido), e devem ser monitorizados sob o microscópio de dissecação. Remoção do córion expõe a brilhante, membrana vitelina transparente. Dechorionated ovos deverão ser lavados brevemente, ou colocados em solução salina, como alvejantes destrói rapidamente os tecidos devitellinized.
- É fundamental cuidadosamente estágio embriões para a idade desejada de desenvolvimento. Os estágios definidos Drosophila embrionárias (1-17; Campos-Ortega e Hartenstein, 1985) não são úteis, como todo o desenvolvimento funcional neuromuscular ocorre em 16 fase tardia ou estágio 17. Assim, os embriões são encenadas por hora de desenvolvimento a 25 ° C em uma incubadora umidificada, em horas após a fecundação ou, mais comumente, após a postura de ovos (AEL). Sob essas condições, a embriogênese dura 21 + / - 1 hr a 25 ° C.
- Ovos de uma cronometrado ovo-lay (1-2 hrs) que estão devidamente idosos são vistas próximas de critérios morfológicos. Após a lavagem extensiva em dH 2 O, os ovos dechorionated são colocados em uma placa de cultura de plástico (sob dH 2 O) para visualização. Preparação correta pode ser confirmada com a critérios morfológicos usando luz refletida com um microscópio de dissecção (Campos-Ortega e Hartenstein, 1985). Madura fase final de embriões (22-24h AEL) à beira de incubação são geralmente reconhecidos pela segmentação da cutícula e traquéia inflado. Embriões também podem ser genotipados utilizando GFP balanceadores e um microscópio de fluorescência dissecção com filtros adequados.
- Para dissecção, embriões e dechorionated developmentally encenado estão ligados (lado dorsal para cima) em uma lamela em uma gota de solução salina (veja o passo 1.5). Embriões são retirados da membrana vitelina por punção da membrana perto da extremidade anterior ou posterior com uma micropipeta de vidro ou a agulha de tungstênio, e, em seguida, suavemente libertando o embrião da membrana. Em preparação para a dissecação, o embrião deve ser posicionado sobre a lamela com a superfície até dorsal (face dorsal até dissecção irá expor o sistema nervoso e ventral neuromusculature para experimentos. No entanto, o embrião pode, obviamente, ser posicionados em outras maneiras de facilitar o acesso a outros tecidos.)
- Embriões em estágio precoce (<16 hrs AEL) atribuem directamente para limpar o vidro ou o vidro revestido com polilisina (poli-L-lisina hydrobromide; Broadie e Bate, 1993a, b). Embriões mais velhos (> 16 hrs AEL), após a formação da cutícula, deve ser colado, de preferência para Sylgard revestido (Dow Corning) lamínulas. A água-polimerização cola de cianoacrilato cirúrgicos ou veterinários é usado (Broadie e Bate, 1993c, d). A cola é entregue através de uma pipeta de vidro pequeno eletrodo (10-20 micrômetros ponta diâmetro interno) anexado a um tubo de borracha com o fluxo de cola controlado por pressão na boca. Cuidados devem ser tomados durante a entrega de cola, como a cola polimeriza rapidamente, ao contatar a solução salina. Note também que a colagem não pode ser realizada em solução salina sem ou com baixas concentrações de íons bivalentes, como a cola exige íons divalentes para polimerizar. Pequenas quantidades de cola são utilizados pela primeira vez para anexar firmemente a cabeça ea cauda.
- Uma vez que as extremidades do embrião são colados à lamela, uma incisão é feita no dorso com um eletrodo de vidro ou a agulha de tungstênio afiadas. Isso é facilitado pelo cuidado perfurantes da linha de incisão antes de fazer o corte final. Os lados da incisão são, então, ligado à lamela com mais cola, para delicadamente espalhar o apartamento embrião. Os órgãos internos, incluindo o intestino, órgãos de gordura e, opcionalmente, traquéia são então removidas por sucção usando uma pipeta de vidro ligado a tubos de borracha (Broadie eo Bate 1993a-c). O embrião agora deve ser anexado plana para as lamelas, epiderme para baixo com o sistema central nervoso ventral, nervos periféricos, e somáticas musculatura expostos para a experimentação.
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Discussion
Encenação precisa de embriões é crítica devido à maturação rápida de propriedades funcionais ao longo do tempo de apenas algumas horas. Várias questões complicar este teste. Primeiro, a maioria dos pesquisadores usa ovo cronometrado estabelece a fase de embriões, mas o tempo de postura pode variar enormemente de animal para animal em diferentes condições (Broadie et al. 1992). Em particular, as fêmeas em uma dieta limitada tendem a reter ovos fertilizados por períodos prolongados antes do assentamento. Portanto, é fundamental para "limpar" as fêmeas pela alimentação em uma dieta de levedura rica por pelo menos 2 dias antes da coleta de ovos (Broadie et al. 1992). Além disso, as fêmeas mais velhas também manter os ovos por um longo período antes do assentamento. Uma fêmea mais velha pode rotineiramente colocam ovos apenas um par de horas antes de sua eclosão. Portanto, é importante o uso de fêmeas jovens (<7 dias) para os tempos mais consistente postura (Broadie et al. 1992). Segundo, durante os estágios do embrião tarde, é difícil estágio embriões unicamente por critérios morfológicos. Características de estadiamento mais claras estiverem completos <16 hrs AEL (Campos-Ortega e Hartenstein, 1985), mas o desenvolvimento mais funcional ocorre> 16 hrs AEL. Final características de desenvolvimento (por exemplo, o ar enchendo-traqueal, curtimento de cutícula) são poucos e tendem a ser menos temporalmente restrita. Por esses motivos, recomendamos uma abordagem combinatória: recolher ovos 1-2 hr cronometrado estabelece, palco bem definidos no início eventos morfológicos de <30 minutos de duração (por exemplo, a gastrulação fechamento, dorsal, 3-parte do intestino; Campos-Ortega e Hartenstein, 1985) e, em seguida, incube com a idade desejada em um bem controlados 25 ° C incubadora.
A dissecção manual e aplicação de cola requerem habilidades motoras finas sob um microscópio que poucas pessoas possuem inicialmente. Essas habilidades devem ser desenvolvidas ao longo do tempo. Experimentadores devem estar dispostos a cometer um mínimo de várias semanas de prática diária dedicada antes de esperar uma alta freqüência de sucesso. Preparações adequadas para exame microscópico do SNC e algumas junções neuromusculares ventral deve ser realizáveis relativamente rápido, enquanto as preparações saudáveis adequado para eletrofisiologia normalmente requerem mais esforço.
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Acknowledgments
KB é suportado pelo NIH conceder GM54544.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 (for 60 mm dish; other sizes available) | Cages can also be home made using punctured tri-pour beakers, as shown in video |
| Sylgard 184 | Dow Corning | Available from various companies | Surgical glue adheres better to sylgard-coated coverslips |
| Fine glass tubing, outer diameter 1.0-1.5 mm | Various | For pulling into fine glass needles for dissection and tubes for glue delivery | |
| Plastic tubing, to attach to glass pipette for mouth suction and glue application | Tygon | Tubing inner diameter needs to match glass outer diameter. |
References
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