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Biology

Ernte und Vorbereitung Drosophila Embryonen für die elektrophysiologische Ableitung und andere Verfahren

Published: May 20, 2009 doi: 10.3791/1347
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Biological Sciences, University of Illinois, 2Department of Biological Sciences, Vanderbilt University

Summary

Diese Technik macht die Drosophila embryonale neuromusculature für die Immunhistochemie oder elektrophysiologische Ableitung. Es ist für das Studium frühen Ereignisse in neuromuskulären Entwicklung oder Durchführung Elektrophysiologie in Mutanten, die nicht brüten können nützlich.

Abstract

Drosophila ist ein führender genetisches Modell für die Untersuchung der beiden embryonalen Entwicklung und funktionelle Neurowissenschaften. Traditionell sind diese Felder ganz von einander getrennt, mit weitgehend unabhängigen Geschichten und Wissenschaft. Allerdings ist die Schnittstelle zwischen diesen in der Regel unterschiedliche Felder der Entwicklungsprogramme zugrunde liegenden Erwerb von funktionellen elektrischen Signal-Eigenschaften und die Differenzierung von funktionellen chemischen Synapsen während der letzten Phasen der neuronalen Schaltkreis Bildung. Diese Schnittstelle ist ein äußerst wichtiges Gebiet für die Untersuchung. In Drosophila treten diese Phasen der funktionalen Entwicklung über einen Zeitraum von <8 Stunden (bei ​​25 ° C) während des letzten Drittels der Embryogenese. Diese späte Entwicklungsphase galt lange Zeit als unlösbar zu Ermittlungen wegen der Ablagerung von einem harten, undurchlässigen epidermale Kutikula. Ein Durchbruch Fortschritt war die Anwendung von Wasser-Polymerisation chirurgische Kleber, die lokal an der Nagelhaut kann angewendet werden, um kontrollierte Präparation des Late-Stage-Embryonen zu ermöglichen. Mit einem dorsalen Längsschnitt, kann der Embryo flach gelegt werden, Freilegung der Bauchmark und Körper Wand Muskulatur experimentelle Untersuchung. Dieses System wurde stark genutzt zu isolieren und zu charakterisieren genetische Mutanten, die embryonale Synapsenbildung beeinträchtigen und damit zeigen, die molekularen Mechanismen, über die Spezifikation und Differenzierung von Synapsen-Verbindungen und funktionelle synaptische Signalisierung Eigenschaften.

Protocol

Teil 1: Ausrüstung und Zubehör

  1. Eine gute Dissektionsmikroskop ist für den Embryo Dissektionen erforderlich; 40-facher Vergrößerung wird vorgeschlagen, mit 25X Okulare bis maximal die Vergrößerung zu erhöhen.
  2. Feine Pinzette (Nummer 5) sind für die manuelle Selektion von Embryonen und devitellinization von Embryonen erforderlich.
  3. Ausrüstung zu machen und zu ändern gutes Glas Nadeln erforderlich ist. Gezogen-Glas-Nadeln sind für die Präparation erforderlich. Wir bevorzugen massivem Glas für die Präparation (länger), aber Standard dickwandigen Glasröhren (Außendurchmesser 1-1,5 mm) arbeitet als gut. Einige Leute benutzen feinen Wolfram-Nadeln, elektrolysiert, um die gewünschte Schärfe in ein Bad von 1M NaOH mit einem 10 + Amp Spartransformator Batterie. Geschärft Wolfram Dissektion Nadeln haben den Vorteil, dass sie relativ robust und langlebig sind. Hohlglas Nadeln (gebildet ähnlich Klemmelektroden Patch) sind Kunststoffschlauch befestigt und verwendet bei der Präparation für Saug-und Ausweisung von Kochsalzlösung, sowie die kontrollierte Abgabe von Leim. Eine Vielzahl von Glas-Abzieher sind für die Herstellung von Glas Nadeln. Computer-Programmierung Abzieher kann voreingestellt werden, um eine Vielzahl von Formen und Größen zu ziehen. Die Brown-Flaming Modelle (Sutter Instrument Co.) sind weit verbreitet begünstigt. Ein zusammengesetztes Mikroskop (20-40fach Objektiv) zur Verfügung stehen sollte untersuchen und verändern Elektroden vor dem Gebrauch.
  4. Zwei Arten von Lösungen werden häufig verwendet, um die Bad embryonalen Gewebe während der Präparation: 1) "Standard" (Jan und Jan, 1976a) oder "modifizierten Standardtarif" (Broadie, 2000) Salinen, basierend auf Lösungen üblicherweise für die Aufnahme in andere wirbellose eingesetzt und 2) "Hämolymphe-like" (HL) Salinen (Stewart et al 1994), einen Kompromiss zwischen den Standard-Kochsalzlösung und die Ionenkonzentrationen in der Drosophila Hämolymphe gemessen. Es wird darauf hingewiesen, dass keines dieser Salinen genau imitieren die chemische Zusammensetzung der Hämolymphe in vivo (Broadie, 2000). Standard-Kochsalzlösung enthält (in mM): 135 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl 2, 1,8 CaCl 2, 72 Saccharose, 5 TES, pH 7,2. Experimentatoren möchten vielleicht auch kommerziell hergestellte Insekten Kochsalzlösung (z. B. Schneider Insect Media), die ungeeignet für die elektrophysiologische Ableitung aber wahrscheinlich für die Gesundheit der exponierten Gewebe zu schützen, ist zu prüfen.

Teil 2: Embryo Staging und Dissection

  1. Für eine optimale Eiersammlung, halten jung (<7 Tage), gesunde männliche und weibliche Fliegen (20-40) auf frischen Verlegung Töpfe für 2-3 Tage. Legen Töpfen häufig bestehen aus 100 ml Kunststoffbecher (Tri-Pour) perforiert, um eine ausreichende Luftzirkulation, für eine 60 mm-Agar-Platte geben. Agar-Platten enthalten Apfel-oder Traubensaft mit Agar gehärtet. Einige Rezepte gibt, aber ein Beispiel ist wie folgt: 700 ml Wasser, 25-30 g Agar, 300 ml Saft-Konzentrat (Trauben-oder Apfel), 0,5 g Methylparaben (p-hydroxymethylbenzoate) und 30g Zucker. Autoclave das Wasser und Agar-Agar, und separat kochen p-hydroxymethylbenzoate mit dem Zucker und Saft. Mix der Agar-und Saft-Lösungen und schnell in 60 mm-Platten zu gießen, Entfernung von Blasen.
  2. Vor Entnahme der Eizellen, sind Fliegen mit Hefepaste (7 Gramm Bäckerhefe in 9 ml Wasser bei 4 ° C gelagert) auf frische Platten, mindestens zweimal täglich für mindestens zwei Tage gewechselt zugeführt. Am Tag 3, sollte ein guter Topf produzieren 100-200 Eier pro Stunde. Bessere Eiablage befindet sich auf einem Topf auf die Seite mit dem Agar in eine Metallplatte geritzt gepflegt beobachtet. Viele Embryonen werden in gelegt werden oder neben dem Kratzer.
  3. Zum Sammeln einer großen Anzahl von Embryonen, sanft Transfer der Embryonen von der Agarplatte in einen Korb mit einem Pinsel. Ein Korb kann mit einem 15 oder 50 ml Zentrifugenröhrchen erfolgen. Schneiden Sie den unteren, wobei genügend Fläche, um einen Bildschirm (70 um Maschenweite) zwischen dem Deckel und dem oberen Ende des Röhrchens Falle. Spülen Sie die Embryonen mit dH 2 0 und in einer Petrischale mit frischem 50% bis 100% Bleichmittel auf die äußere Chorion zu entfernen. Alternativ können Eier einzeln gesammelt werden mit feinen Pinzetten und dechorionated, indem man sie manuell in einen Tropfen Bleichmittel. De-chorionation kann von 30 Sekunden bis 2 Minuten (frische Bleiche ist viel schneller) zu nehmen, und sollte unter der Dissektionsmikroskop überwacht werden. Die Entfernung des Chorion macht die glänzenden, transparent Dotterhaut. Dechorionated Eier sollten kurz abgespült werden, oder die in Kochsalzlösung, als Bleichmittel schnell zerstört devitellinized Gewebe.
  4. Es ist wichtig, sorgfältig zu Embryonen, um die gewünschte Entwicklungsalter. Die definierten Drosophila Embryonalstadien (1-17; Campos-Ortega und Hartenstein, 1985) sind nicht sinnvoll, da alle funktionellen neuromuskulären Entwicklung tritt im späten Stadium 16 oder Stufe 17. So Embryonen werden von Entwicklungs-Stunden inszeniert bei 25 ° C in einem befeuchteten Inkubator, in Stunden nach der Befruchtung oder, häufiger, nach der Eiablage (AEL). Unter diesen Bedingungen dauert der Embryogenese 21 + / - 1 Stunde bei 25 ° C.
  5. Eier von einer zeitlich Ei-lay (1-2 Std.s), die entsprechend gealtert sind als nächstes für morphologischen Kriterien angesehen. Nach gründlichem Waschen in dH 2 O, sind die dechorionated Eier in einer Kunststoff-Petrischale (unter dH 2 O) für die Anzeige platziert. Richtig Inszenierung kann mit morphologischen Kriterien mit reflektierte Licht mit einem Dissektionsmikroskop (Campos-Ortega und Hartenstein, 1985) bestätigt werden. Ältere im Spätstadium Embryonen (22-24h AEL) am Rande der Schlupf in der Regel durch die Segmentierung der Kutikula und aufgeblasen Luftröhre anerkannt. Embryonen können auch genotypisiert mit GFP-Balancer und ein Fluoreszenz-Dissektionsmikroskop mit geeigneten Filtern werden.
  6. Für Dissektion sind dechorionated und entwicklungspolitisch inszeniert Embryonen beigefügt (Rückenseite nach oben) auf einem Deckglas unter einem Tropfen Kochsalzlösung (siehe Schritt 1.5). Die Embryonen werden von der Dotterhaut durch Punktion der Membran in der Nähe der vorderen oder hinteren Ende mit einem Glas-Mikropipette oder Wolfram Nadel, und dann vorsichtig die Befreiung der Embryo aus der Membran entfernt. In Vorbereitung für die Präparation, sollte der Embryo auf dem Deckglas mit der dorsalen Fläche nach oben (dorsal bis Dissektion wird das ventrale Nervensystem und neuromusculature für Experimente aussetzen positioniert werden. Doch der Embryo kann natürlich auch auf andere Weise positioniert werden, um Zugang zu anderen zu erleichtern Gewebe.)
  7. Embryonen im Frühstadium (<16 Stunden AEL) direkt an Glas oder Glas mit Polylysin (Poly-L-Lysin-Hydrobromid; Broadie und Bate, 1993a, b) beschichtet reinigen. Ältere Embryonen (> 16 Stunden AEL), folgende Nagelhaut Bildung muss geklebt werden, ideal für Sylgard-beschichtet (Dow Corning) Deckgläser. Ein Wasser-Polymerisation von Cyanacrylat chirurgische oder tierärztliche Klebstoff verwendet wird (Broadie und Bate, 1993c, d). Der Leim wird durch einen kleinen Glaselektrode Pipette (10-20 Mikrometer Innendurchmesser Spitze) an einen Gummischlauch mit dem Leimfluss durch den Mund Druck gesteuert ausgeliefert. Es muss während der Leim Lieferung genommen werden, da der Kleber polymerisiert schnell bei Kontakt mit der Salzlösung. Beachten Sie auch, dass Kleben nicht in Kochsalzlösung mit keinen oder geringen zweiwertigen Ionen-Konzentrationen durchgeführt werden, wie der Klebstoff erfordert zweiwertige Ionen zu polymerisieren. Kleine Mengen von Klebstoff werden zuerst verwendet werden, um fest an den Kopf und Schwanz.
  8. Nachdem die Enden der Embryo in die Deckglas geklebt wird ein Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie mit einer Glaselektrode oder geschärft Wolframnadel gemacht. Dies wird dadurch erleichtert, indem Sie vorsichtig Perforieren der Schnittführung vor dem endgültigen Schnitt. Die Seiten des Einschnitts werden dann auf das Deckglas mit mehr geklebt, sanft verteilen Embryo flach. Die inneren Organe einschließlich des Darms, Fettkörper und, optional, Luftröhre werden dann durch Absaugen mittels einer Glaspipette an Gummischlauch (Broadie und Bate 1993a-c) entfernt. Der Embryo ist jetzt angebracht flach auf dem Deckglas werden, Epidermis sich mit der Bauchseite des zentralen Nervensystems, der peripheren Nerven und somatische Muskulatur für Experimente ausgesetzt.

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Discussion

Präzise Inszenierung von Embryonen ist kritisch aufgrund der schnellen Reifung der funktionellen Eigenschaften über den zeitlichen Verlauf von nur einigen Stunden. Mehrere Probleme erschweren diese Inszenierung. Erstens verwenden die meisten Forscher timed Eier legt, um Embryonen, sondern die Eiablage Zeit enorm variieren von Tier zu Tier unter verschiedenen Bedingungen (Broadie et al. 1992). Insbesondere neigen Frauen auf eine begrenzte Diät, um befruchtete Eier über einen längeren Zeitraum vor der Verlegung zu behalten. Es ist daher wichtig, "klar" Frauen durch die Fütterung auf eine reiche Hefe Ernährung für mindestens 2 Tage vor dem Sammeln von Eiern (Broadie et al. 1992). Darüber hinaus ältere Frauen behalten auch Eier für einen längeren Zeitraum vor der Verlegung. Eine ältere Frau kann routinemäßig Eier legen nur ein paar Stunden vor ihrer Brut. Es ist daher wichtig, dass junge Frauen (<7 Tage) für die konsequente Verlegung Zeiten (Broadie et al. 1992) zu verwenden. Zweitens, während der späten embryonalen Stadien, ist es schwierig, Embryonen ausschließlich durch morphologische Kriterien der Bühne. Die meisten klar Inszenierung Funktionen sind vollständig von <16 Stunden AEL (Campos-Ortega und Hartenstein, 1985), aber die meisten funktionalen Entwicklung erfolgt> 16 Stunden AEL. Am späten Entwicklungs-Features (zB tracheale Luft-Füllung, Gerben von Kutikula) sind wenige und eher weniger zeitlich beschränkt. Aus diesen Gründen empfehlen wir einen kombinatorischen Ansatz: collect Eier von 1-2 Stunden zeitlich legt, Bühne, um wohldefinierte frühen morphologischen Ereignisse von <30 Minuten Dauer (zB Gastrulation dorsalen Verschluss, 3-teilig gut; Campos-Ortega und Hartenstein, 1985) und anschließend auf die gewünschte Zeit in einer gut kontrollierten 25 ° C Inkubator inkubieren.

Die manuelle Zerlegung und Leimauftrag erfordern Feinmotorik unter dem Mikroskop, dass nur wenige Menschen zunächst zu besitzen. Diese Fähigkeiten müssen im Laufe der Zeit entwickelt werden. Experimentatoren sollten bereit sein, mindestens mehrere Wochen lang täglich gewidmet üben, bevor erwarten eine hohe Frequenz von Erfolg zu begehen. Die Vorbereitungen für die mikroskopische Untersuchung des ZNS und einige ventralen motorischen Endplatten sollte möglich sein, relativ schnell, während gesunde Vorbereitungen für Elektrophysiologie erfordern in der Regel mehr Aufwand.

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Acknowledgments

KB wird durch NIH GM54544 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Embryo Collection Cages Genesee Scientific 59-100 (for 60 mm dish; other sizes available) Cages can also be home made using punctured tri-pour beakers, as shown in video
Sylgard 184 Dow Corning Available from various companies Surgical glue adheres better to sylgard-coated coverslips
Fine glass tubing, outer diameter 1.0-1.5 mm Various For pulling into fine glass needles for dissection and tubes for glue delivery
Plastic tubing, to attach to glass pipette for mouth suction and glue application Tygon Tubing inner diameter needs to match glass outer diameter.

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