Summary
Cette technique expose les neuromusculaire Drosophila embryonnaire pour l'immunohistochimie ou l'enregistrement électrophysiologiques. Il est utile pour étudier les événements précoces de développement neuromusculaire ou d'effectuer l'électrophysiologie dans des mutants qui ne peuvent pas éclore.
Abstract
Drosophile est un modèle de premier génétique pour l'étude du développement embryonnaire et à la fois fonctionnelles en neurosciences. Traditionnellement, ces champs sont assez isolées les unes des autres, avec des histoires largement indépendantes et les communautés scientifiques. Cependant, l'interface entre ces domaines généralement disparates sont les programmes de développement qui sous-tendent l'acquisition de propriétés fonctionnelles électriques de signalisation et de la différenciation des synapses chimiques fonctionnels pendant les phases finales de la formation des circuits neuronaux. Cette interface est une zone cruciale pour l'enquête. Chez la drosophile, ces phases de développement fonctionnel se produisent pendant une période de <8 heures (à 25 ° C) pendant le dernier tiers de l'embryogenèse. Cette période tardive de développement a été longtemps considérés comme insurmontables à cause enquête pour le dépôt d'un dur, la cuticule épidermique imperméable. Une percée a été l'avance de l'application de l'eau-de polymérisation de la colle chirurgicale qui peut être appliqué localement à la cuticule pour permettre une dissection contrôlée des embryons à un stade avancé. Avec une incision dorsale longitudinale, l'embryon peut être posé à plat, ce qui expose la corde nerveuse ventrale et la musculature paroi du corps d'une enquête expérimentale. Ce système a été largement utilisé pour isoler et caractériser des mutants génétiques qui altèrent la formation des synapses embryonnaire, et révéler ainsi les mécanismes moléculaires qui régissent la spécification et la différenciation des connexions synaptiques fonctionnelles synapse et propriétés de signalisation.
Protocol
Partie 1: matériel et fournitures
- Un microscope de dissection est nécessaire pour une bonne dissections embryon; grossissement 40X est suggéré, avec oculaires 25X au maximum à augmenter le grossissement.
- Pinces fines (numéro 5) sont requis pour la sélection manuelle des embryons et des devitellinization d'embryons.
- Équipement pour faire et modifier des aiguilles de verre fine est nécessaire. Tiré de verre aiguilles sont nécessaires pour la dissection. Nous préférons le verre solide pour la dissection (durent plus longtemps), mais la norme de tubes de verre à parois épaisses (diamètre extérieur 1-1,5 mm) fonctionne aussi bien. Certaines personnes utilisent des aiguilles de tungstène fine, électrolysée à la netteté voulue dans un bain de NaOH 1M en utilisant une batterie 10 Amp + autotransformateur. Aiguisé aiguilles de dissection de tungstène ont l'avantage qu'ils sont relativement résistants et durables. Aiguilles de verre creux (formé similaires à patcher électrodes pince) sont attachés aux tuyaux de plastique et utilisées lors de la dissection pour l'aspiration et l'expulsion des salines, ainsi que la livraison contrôlée de colle. Une variété d'extracteurs de verre sont disponibles pour la fabrication d'aiguilles de verre. Ordinateur programmé extracteurs peut être préréglé pour tirer une variété de formes et tailles. Le Brun-Flaming modèles (Sutter Instrument Co.) sont largement favorisées. Un microscope composé (20-40X objectif) devrait être disponible pour inspecter et modifier des électrodes avant d'utiliser.
- Deux types de solutions sont couramment utilisées pour le bain du tissus embryonnaires lors de la dissection: 1) «standard» (Jan et Jan, 1976a) ou "standard modifié" (Broadie, 2000) Salines, basée sur des solutions couramment utilisés pour l'enregistrement dans d'autres systèmes d'invertébrés , et 2) "hémolymphe-like» (HL) Salines (Stewart et al 1994), un compromis entre la solution saline standard et les concentrations ioniques mesurés dans l'hémolymphe de drosophile. Il est à noter qu'aucun de ces salines précisément imiter la composition chimique de l'hémolymphe in vivo (Broadie, 2000). Salines standard contient (en mM): 135 NaCl, KCl 5, 4 MgCl 2, 1,8 CaCl2, 72 sucrose, 5 TES, pH 7,2. Les expérimentateurs peuvent également envisager une solution saline insectes préparés commercialement (insectes par exemple médias Schneider), qui est impropre à l'enregistrement électrophysiologique, mais les plus susceptibles de protéger la santé des tissus exposés.
Partie 2: Mise en scène de l'embryon et dissection
- Pour la collecte d'œufs optimale, de maintenir les jeunes (<7 jours), de sexe masculin en bonne santé et mouches femelles (20-40) sur les frais des pots de pose de 2-3 jours. Pose des pots se composent généralement de 100 gobelets en plastique ml (Tri-Verser) perforé pour assurer une circulation d'air suffisante, couvrant une plaque de gélose à 60 mm. Plaques de gélose contenant de pomme ou de jus de raisin trempé avec de l'agar. Plusieurs recettes existent, mais un exemple est la suivante: 700 ml d'eau, 25-30 grammes d'agar, 300 ml de concentré de jus (de raisin ou de pomme), 0.5g méthyl paraben (p-hydroxymethylbenzoate), et le sucre 30g. Autoclave l'eau et l'agar, et séparément bouillir le p-hydroxymethylbenzoate avec le sucre et le jus. Mélanger l'agar-agar et des solutions de jus et verser rapidement en 60 plaques mm, éliminer les bulles.
- Avant la collecte d'œufs, les mouches sont nourris avec de la pâte de levure (7 grammes de levure de boulanger dans 9 ml d'eau stockée à 4 ° C) sur des plaques fraîches, changé au moins deux fois par jour pendant au moins deux jours. Au jour 3, un pot de bonne devrait produire 100 à 200 œufs par heure. Mieux la pose d'oeuf est observé sur un pot maintenu sur le côté avec l'agar-agar dans la plaque rayée. Beaucoup embryons seront fixées dans ou à côté de la rayure.
- Pour collecter un grand nombre d'embryons, le transfert des embryons en douceur de la plaque de gélose dans un panier à l'aide d'un pinceau. Un panier peut être faite avec un tube de 15 ou 50 ml centrifugeuse. Coupez le bas en laissant une surface suffisante pour piéger un écran (70 mailles um) entre le couvercle et le haut du tube. Rincez les embryons avec dH 2 0 et mis dans une boîte de Pétri des frais de 50% à 100% eau de javel pour enlever le chorion externe. Alternativement, les œufs peuvent être collectés soit individuellement à l'aide de pinces fines, et dechorionated en les plaçant manuellement dans une goutte d'eau de Javel. De-chorionation peut prendre de 30 secondes à 2 minutes (eau de Javel fraîche est beaucoup plus rapide), et doivent être surveillés sous le microscope de dissection. Retrait du chorion expose le brillant, la membrane transparente vitelline. Dechorionated oeufs doivent être brièvement rincés, ou placés dans une solution saline, l'eau de Javel détruit rapidement les tissus devitellinized.
- Il est essentiel de bien l'étape embryons à l'âge désiré de développement. La drosophile défini embryonnaire (1-17; Campos-Ortega et Hartenstein, 1985) ne sont pas utiles, comme tout développement fonctionnelle neuromusculaire survient dans 16 stade tardif ou le stade 17. Ainsi, les embryons sont mis en scène par heure de développement à 25 ° C dans un incubateur humidifié, en quelques heures après la fécondation, ou, plus fréquemment, après la ponte (AEL). Dans ces conditions, l'embryogenèse dure 21 + / - 1 h à 25 ° C.
- Oeufs à partir d'un oeuf chronométrés-lay (1-2 hrs) qui sont d'âge approprié sont considérées pour les prochains critères morphologiques. Après un lavage extensif en DH 2 O, les oeufs dechorionated sont placés dans une boîte de culture en plastique (sous dH 2 O) pour la visualisation. Mise en scène correcte peut être confirmé par des critères morphologiques en utilisant la lumière réfléchie avec un microscope à dissection (Campos-Ortega et Hartenstein, 1985). Mature embryons à un stade avancé (22-24h AEL) sur le point d'incubation sont généralement reconnus par la segmentation de la cuticule et de la trachée gonflée. Les embryons peuvent également être génotypés avec des équilibreurs GFP et un microscope à dissection de fluorescence avec des filtres appropriés.
- Pour la dissection, les embryons et de développement mis en scène dechorionated sont attachés (face dorsale vers le haut) sur une lamelle en une goutte de sérum physiologique (voir étape 1.5). Les embryons sont retirés de la membrane vitelline par ponction de la membrane vers la fin antérieure ou postérieure avec une micropipette de verre ou d'une aiguille de tungstène, et puis doucement en libérant l'embryon de la membrane. En préparation de la dissection, l'embryon doit être placé sur la lamelle avec la surface dorsale jusqu'à (côté dorsal jusqu'à la dissection va exposer le système nerveux et neuromusculaire ventrale pour les expériences. Toutefois, l'embryon ne peut évidemment être placé dans d'autres façons de faciliter l'accès à d'autres les tissus.)
- Embryons au stade précoce (<16 hrs AEL) attacher directement à nettoyer les vitres ou verre recouverte de polylysine (poly-L-lysine bromhydrate; Broadie et Bate, 1993a, b). Âgés embryons (> 16 heures AEL), suite à la formation de la cuticule, doivent être collés, idéalement à Sylgard-enduit (Dow Corning) lamelles. Une eau-polymériser la colle cyanoacrylate chirurgicaux ou vétérinaires est utilisé (Broadie et Bate, 1993c, d). La colle est livrée par le biais d'une pipette d'électrode petit verre (10-20 micromètres de diamètre pointe intérieure) attaché à un tube en caoutchouc avec le flux de la colle contrôlée par la pression bouche. Des précautions doivent être prises lors de la livraison de la colle, la colle polymérise en plus rapidement au contact de la saline. Notez également que le collage ne peut pas être effectuée dans une solution saline sans ou avec de faibles concentrations d'ions divalents, comme la colle nécessite des ions divalents à polymériser. De petites quantités de colle sont d'abord utilisées pour fixer fermement la tête et la queue.
- Une fois les extrémités de l'embryon sont collés à la lamelle, une incision est faite le long de la ligne médiane dorsale avec une électrode en tungstène de verre ou d'une aiguille aiguisée. Ceci est rendu plus facile par la douceur de perforation de la ligne d'incision avant d'effectuer le montage final. Les côtés de l'incision sont ensuite attachés à la lamelle avec plus de colle, pour doucement répandre la plate embryon. Les organes internes, y compris l'intestin, des corps gras et, éventuellement, la trachée sont ensuite éliminés par aspiration avec une pipette de verre attaché au tuyau en caoutchouc (Broadie et Bate 1993a-c). L'embryon doit maintenant être attachés à plat pour la lamelle, l'épiderme vers le bas avec le système nerveux central ventrale, les nerfs périphériques, et la musculature somatique exposés pour l'expérimentation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Staging précis des embryons est essentielle en raison de la maturation rapide des propriétés fonctionnelles au cours du temps de seulement quelques heures. Plusieurs questions compliquent cette mise en scène. Premièrement, la plupart des chercheurs utilisent oeuf chronométré établit au embryons au stade, mais le temps de ponte peut varier énormément d'un animal à des conditions différentes (Broadie et al. 1992). En particulier, les femelles sur un régime alimentaire restreint tendent à retenir les oeufs fécondés pendant des périodes prolongées avant la pose. Il est donc essentiel de «nettoyer» les femelles en se nourrissant sur un régime alimentaire riche en levure pendant au moins 2 jours avant la collecte des œufs (Broadie et al. 1992). Par ailleurs, les femmes âgées conservent aussi des œufs pendant une longue période avant la ponte. Une femme plus âgée peut régulièrement pondre que quelques heures avant leur éclosion. Il est donc important d'utiliser les jeunes femelles (<7 jours) pour les périodes les plus cohérentes de pose (Broadie et al. 1992). Deuxièmement, au cours des stades embryonnaires fin, il est difficile de mettre en scène des embryons uniquement par des critères morphologiques. Caractéristiques scène la plus claire sont complètes en <16 heures AEL (Campos-Ortega et Hartenstein, 1985), mais le développement le plus fonctionnel survient> 16 heures AEL. Fin des caractéristiques de développement (par exemple la trachée de remplissage d'air, le tannage de la cuticule) sont rares et tendent à être moins temporellement limitée. Pour ces raisons, nous recommandons une approche combinatoire: collecter des oeufs de 1-2 heures chronométrées établit, scène pour bien définies au début des événements morphologiques de <30 minutes dans la durée (gastrulation par exemple, fermeture dorsale, en 3 parties intestin; Campos-Ortega et Hartenstein, 1985) et puis incuber à l'âge désiré dans un bien contrôlé 25 ° C incubateur.
La dissection manuelle et l'application de la colle nécessite la motricité fine sous un microscope que peu de gens possèdent initialement. Ces compétences doivent être développées au fil du temps. Les expérimentateurs doivent être prêts à commettre un minimum de plusieurs semaines de pratique quotidienne dédiée avant d'attendre une fréquence élevée de succès. Des préparations appropriées pour l'examen microscopique de la CNS et certaines jonctions neuromusculaires ventrale devrait être réalisable assez rapidement, tandis que les préparatifs saine adaptée pour électrophysiologie nécessite généralement plus d'effort.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
KB est soutenu par NIH GM54544.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 (for 60 mm dish; other sizes available) | Cages can also be home made using punctured tri-pour beakers, as shown in video |
| Sylgard 184 | Dow Corning | Available from various companies | Surgical glue adheres better to sylgard-coated coverslips |
| Fine glass tubing, outer diameter 1.0-1.5 mm | Various | For pulling into fine glass needles for dissection and tubes for glue delivery | |
| Plastic tubing, to attach to glass pipette for mouth suction and glue application | Tygon | Tubing inner diameter needs to match glass outer diameter. |
References
- Aravamudan, B., Fergestad, T., Davis, W. S., Rodesch, C. K., Broadie, K. Drosophila UNC-13 is essential for synaptic transmission. Nat. Neurosci. 2, 965-971 (1999).
- Auld, V. J., Fetter, R. D., Broadie, K., Goodman, C. S. Gliotactin a novel transmembrane protein on peripheral glia, is required to form the blood-nerve barrier in Drosophila. Cell. 81, 757-767 (1995).
- Baines, R. A., Bate, M. Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo. J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).
- Baines, R. A., Robinson, S. G., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Postsynaptic expression of tetanus toxin light chain blocks synaptogenesis in Drosophila. Curr. Biol. 9, 1267-1270 (1999).
- Baines, R. A., Uhler, J. P., Thompson, A., Sweeney, S. T., Bate, M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J. Neurosci. 21, 1523-1531 (2001).
- Bate, M. The embryonic development of the larval muscles in Drosophila. Development. 110, 791-804 (1990).
- Bate, M., Martinez Arias, A. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. Vol. I, II (1993).
- Baumgartner, S., JT, L. ittleton, Broadie, K., MA, B. hat, Harbecke, R., JA, L. engyel, Chiquet-Ehrismann, R., Prokop, A., Bellen, H. J. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87, 1059-1068 (1996).
- AH, B. rand Perrimon N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Brand, A. GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system. Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).
- Broadie, K. Electrophysiological Approaches to the Neuromusculature. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 273-296 (2000).
- Broadie, K., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 144-166 (1993a).
- Broadie, K., Bate, M. Development of larval muscle properties in the embryonic myotubes of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 167-180 (1993b).
- Broadie, K., Bate, M. Activity-dependent development of the neuromuscular synapse during Drosophila embryogenesis. Neuron. 11, 607-619 (1993c).
- Broadie, K., Bate, M. Synaptogenesis in the Drosophila embryo: innervation directs receptor synthesis and localization. Nature. 361, 350-353 (1993d).
- Broadie, K., Bellen, H. J., DiAntonio, A., Littleton, J. T., Schwarz, T. L. The absence of Synaptotagmin disrupts excitation-secretion coupling during synaptic transmission. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10727-10731 (1994).
- Broadie, K., Prokop, A., Bellen, H. J., O'Kane, C. J., Schulze, K. L., Sweeney, S. T. Syntaxin and Synaptobrevin function downstream of vesicle docking in Drosophila. Neuron. 15, 663-673 (1995).
- Broadie, K., Rushton, E., Skoulakis, E. C. M., Davis, R. L. eonardo a 14-3-3 protein involved in learning, regulates presynaptic function. Neuron. 19, 391-402 (1997).
- Broadie, K., Skaer, H., Bate, M. Whole-embryo culture of Drosophila: development of embryonic tissues in vitro. Roux's Arch. Develop. Biol. 201, 364-375 (1992).
- Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin. (1985).
- Deitcher, D. L., Ueda, A., Stewart, B. A., Burgess, R. W., Kidokoro, Y., Schwartz, T. L. Distinct requirements for evoked and spontaneous release of neurotransmitter are revealed by mutations in the Drosophila gene neuronal-synaptobrevin. J. Neurosci. 18, 2028-2039 (1998).
- Featherstone, D. E., Broadie, K. Surprises from Drosophila: genetic mechanisms of synaptic development and plasticity. Brain Res. Bull. 53, 501-511 (2000).
- Featherstone, D. E., Rushton, E. M., Hilderbrand-Chae, M., Phillips, A. M., Jackson, F. R., Broadie, K. Presynaptic glutamic acid decarboxylase is required for induction of the postsynaptic receptor field at a glutamatergic synapse. Neuron. 27, 71-84 (2000).
- Featherstone, D. E., Davis, W. S., Dubreuil, R. R., Broadie, K. Drosophila alpha- and beta-spectrin mutations disrupt presynaptic neurotransmitter release. J Neurosci. 21, 4215-4224 (2001).
- Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release. Nat Neurosci. 5, 141-146 (2002).
- Featherstone, D. E., Rushton, E., Rohrbough, J., Liebl, F., Karr, J., Sheng, Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. An essential Drosophila glutamate receptor subunit that functions in both central neuropil and neuromuscular junction. J. Neurosci. 25, 3199-3208 (2005).
- Fergestad, T., Davis, W. S., Broadie, K. The stoned proteins regulate synaptic vesicle recycling in the presynaptic terminal. J Neurosci. 19, 5847-5860 (1999).
- Fergestad, T., Wu, M. N., Schulze, K. L., Lloyd, T. E., Bellen, H. J., Broadie, K. Targeted mutations in the syntaxin H3 domain specifically disrupt SNARE complex function in synaptic transmission. J Neurosci. 21, 9142-9150 (2001).
- Fergestad, T., Broadie, K. Interaction of stoned and synaptotagmin in synaptic vesicle endocytosis. J Neurosci. 21, 1218-1227 (2001).
- Goodman, C. S., Doe, C. Q. Embryonic Development of the Drosophila Central Nervous System. In The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 1131-1206 (1993).
- Harrison, S. D., Broadie, K., Goor, J. vande, Rubin, G. M. Mutations in the Drosophila Rop gene suggest a function in general secretion and synaptic transmission. Neuron. 13, 555-566 (1994).
- Huang, F. D., Woodruff, E., Mohrmann, R., Broadie, K. Rolling blackout is required for synaptic vesicle exocytosis. J. Neurosci. 26, 2369-2379 (2006).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. L-glutamate as an excitatory transmitter at the Drosophila larval neuromuscular junction. J. Physiol. 262, 215-236 (1976b).
- Kidokoro, Y., Nishikawa, K. I. Miniature endplate currents at the newly formed neuromuscular junction in Drosophila embryos and larvae. Neuroscience Research. 19, 143-154 (1994).
- Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. J. Neurosci. 17, 9642-9655 (1997).
- Mohrmann, R., Matthies, H. J., Woodruff III, E., Broadie, K. Stoned B mediates sorting of integral synaptic vesicle proteins. Neuroscience. 153, 1048-1063 (2008).
- Nishikawa, K. I., Kidokoro, Y. Junctional and extrajunctional glutamate receptor channels in Drosophila embryos and larvae. J. Neurosci. 15, 7905-7915 (1995).
- Renden, R., Berwin, B., Davis, W., Ann, K., Chin, C. T., Kreber, R., Ganetzky, B., Martin, T. F., Broadie, K. Drosophila CAPS is an essential gene that regulates dense-core vesicle release and synaptic vesicle fusion. Neuron. 31, 421-437 (2001).
- Rohrbough, J., Broadie, K. Electrophysiological Analysis of Synaptic Transmission in Central Neurons of Drosophila Larvae. J. Neurophysiol. 88, 847-860 (2002).
- Rohrbough, J., Rushton, E., Palanker, L., Woodruff, E., Matthies, H. J., Acharya, U., Acharya, J. K., Broadie, K. Ceramidase regulates synaptic vesicle exocytosis and trafficking. J. Neurosci. 24, 7789-7803 (2004).
- Rohrbough, J., Rushton, E., Woodruff, E. 3rd, Fergestad, T., Vigneswaran, K., Broadie, K. Presynaptic establishment of the synaptic cleft extracellular matrix is required for postsynaptic differentiation. Genes Dev. 21, 2607-2628 (2007).
- Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J. Comp. Physiol.. A175, 179-191 (1994).
- Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14, 341-351 (1995).
- Tsunoda, S., Salkoff, L. Genetic analysis of Drosophila neurons: Shal, Shaw, and Shab encode most embryonic potassium currents. J. Neurosci. 15, 1741-1754 (1995).
- Ueda, A., Kidokoro, Y. Longitudinal body wall muscles are electrically coupled across the segmental boundary in the third instar larva of Drosophila melanogaster. Invertebrate Neuroscience. 1, 315-322 (1996).
- Wu, C. F., Haugland, F. N. Voltage clamp analysis of membrane currents in larval muscle fibers of Drosophila. J. Neurosci. 5, 2626-2640 (1985).
- Yan, Y., Broadie, K. In vivo assay of presynaptic microtubule cytoskeleton dynamics in Drosophila. J Neurosci Methods. 162, 198-205 (2007).
- Yoshikami, D., Okun, L. Staining of living presynaptic nerve terminals with selective fluorescent dyes. Nature. 310, 53-56 (1984).
- Zagotta, W. N., Brainard, M. S., Aldrich, R. W. Single-channel analysis of four distinct classes of potassium channels in Drosophila muscle. J. Neurosci. 8, 4765-4779 (1988).
- Zhang, Y. Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. A living synaptic vesicle marker: synaptotagmin-GFP. Genesis. 34, 142-145 (2002).
