Summary
Denna teknik exponerar Drosophila embryonala neuromusculature för immunohistokemi eller elektrofysiologiska inspelning. Det är användbart för att studera tidiga händelser i neuromuskulär utveckling eller utföra elektrofysiologiska i mutanter som inte kan kläckas.
Abstract
Drosophila är en förstklassig genetisk modell för studier av såväl embryonal utveckling och funktionell neurovetenskap. Tidigare har dessa fält helt isolerade från varandra, med i stort sett oberoende historia och vetenskapliga samfund. Dock är gränssnittet mellan dessa oftast skilda områden utvecklingsarbetet program som ligger bakom förvärvet av funktionella elektriska signalering egenskaper och differentiering av funktionella kemiska synapser under de sista faserna av neural krets bildas. Detta gränssnitt är ett mycket viktigt område för utredning. I Drosophila, dessa faser av funktionell utveckling sker under en period av <8 timmar (vid 25 ° C) under den sista tredjedelen av fosterutvecklingen. Denna sena utveckling period ansågs länge svårlösta för undersökning på grund av deponering av en tuff och tät yta epidermal nagelband. Ett genombrott förskott var tillämpningen av vatten-polymerisation kirurgiskt lim som kan vara lokalt tillämpas på nagelbanden för att kontrollerad dissekering av sena embryon. Med ett rygg-längsgående snitt, kan embryot läggas platt, utsätta den ventrala nerven sladden och kropp vägg muskulatur till experimentella undersökningar. Detta system har varit starkt användas för att isolera och karakterisera genetiska mutanter som försämrar embryonala synaps bildning, och därmed avslöjar de molekylära mekanismer som styr specifikation och differentiering av synaps anslutningar och funktionella synaptisk signalering egenskaper.
Protocol
Del 1: Utrustning och tillbehör
- En bra dissektion mikroskop krävs för embryot dissektioner, 40X förstoring föreslås, med 25x eye-bitar för att maximalt öka förstoringen.
- Fin peang (nummer 5) krävs för manuellt val av embryon och devitellinization av embryon.
- Utrustning för att göra och ändra fina glas nålar krävs. Drog glas nålar krävs för dissekering. Vi föredrar massivt glas för dissektion (håller längre), men standard tjockväggiga glasrör (ytterdiameter 1-1,5 mm) fungerar lika bra. Vissa människor använder fina volfram nålar, elektrolys till önskad skärpan i ett bad med 1M NaOH med hjälp av en 10 + Amp spartransformator batteri. Vässade volfram dissektion nålar har fördelen att de är relativt motståndskraftiga och långvariga. Ihåligt glas nålar (bildat liknande patch clamp elektroder) länkade till plastslang och används vid dissekering för sug-och utvisning av saltvatten, liksom kontrollerad leverans av lim. En mängd olika glas avdragare är tillgängliga för tillverkning av glas nålar. Dator-programmerad avdragare kan förinställas för att dra en mängd olika former och storlekar. The Brown-Flammande modeller (Sutter Instrument Co) är allmänt gynnas. Ett sammansatt mikroskop (20-40X objektiv) finnas tillgänglig för att inspektera och ändra elektroderna före användning.
- Två typer av lösningar används ofta för att bada den embryonala vävnader vid dissekering: 1) "standard" (Jan och Jan, 1976a) eller "modifierad standard" (Broadie, 2000) Salines, som bygger på lösningar som ofta används för inspelning i andra ryggradslösa system och 2) "haemolymph-liknande" (HL) Salines (Stewart et al 1994), en kompromiss mellan standard koksaltlösning och den joniska koncentrationer som uppmätts i Drosophila haemolymph. Det bör noteras att ingen av dessa Salines exakt härma den kemiska sammansättningen av haemolymph in vivo (Broadie, 2000). Standard saltlösning innehåller (i mm): 135 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl 2, 1,8 CaCl 2, 72 sackaros, 5 TES, pH 7,2. Praktiker kanske också vill överväga kommersiellt beredd insekt saltlösning (t ex Schneiders insekter Media), som är olämpliga för elektrofysiologiska inspelningen men mest sannolikt att skydda hälsan hos utsatta vävnader.
Del 2: Embryo Staging och Dissection
- För optimal insamling av ägg, underhålla unga (<7 dagar), friska manliga och kvinnliga flugor (20-40) på färsk om krukor i 2-3 dagar. Om krukor består vanligtvis av 100 ml plast bägare (Tri-Pour) perforerade för att ge tillräcklig luftcirkulation, som täcker ett 60 mm agarplatta. Agarplattor innehåller äpple eller druvjuice härdade med agar. Flera recept finns, men ett exempel är som följer: 700 ml vatten, 25-30 gram agar, 300 ml saft koncentrat (druva eller äpple), 0,5 g methyl paraben (p-hydroxymethylbenzoate) och 30g socker. Autoklav vattnet och agar, och separat koka p-hydroxymethylbenzoate med socker och juice. Blanda agar och lösningar juice och snabbt häll i 60 mm plattor, ta bort bubblor.
- Innan insamling av ägg, är flugor matas med jäst pasta (7 gram jäst i 9 ml vatten lagras vid 4 ° C) på färska plattor, bytas minst två gånger om dagen i minst två dagar. På dagen tre, en bra pott producera 100-200 ägg per timme. Bättre äggläggning observeras på en pott kvar på sidan med agar i repad plattan. Många embryon kommer att läggas i eller intill repor.
- Att samla ett stort antal embryon försiktigt överföra embryon från agarplatta i en korg med hjälp av en pensel. En korg kan göras med en 15 eller 50 ml centrifugrör. Skär av botten lämnar tillräckligt med yta för att fånga en skärm (70 ìm mesh) mellan locket och toppen av röret. Skölj embryon med dH 2 0 och sattes i en petriskål av färska 50% till 100% blekmedel för att ta bort den yttre chorion. Alternativt kan äggen samlas in individuellt med hjälp av fin pincett, och dechorionated genom att placera dem manuellt i en droppe blekmedel. De-chorionation kan ta från 30 sekunder till 2 minuter (färsk blekmedel är mycket snabbare), och bör övervakas under dissektion mikroskop. Borttagning av chorion utsätter glänsande, genomskinliga vitelline membran. Dechorionated ägg bör kort sköljas, eller placeras i saltlösning, som blekmedel snabbt förstör devitellinized vävnader.
- Det är viktigt att noga skede embryon till önskad utveckling ålder. Den definierade Drosophila embryonala stadierna (1-17, Campos-Ortega och Hartenstein, 1985) är inte användbara, eftersom alla funktionella neuromuskulära utvecklingen sker i sen 16 eller stadium 17. Således är embryon iscensatt av utveckling timmar vid 25 ° C i en fuktig kuvös, i timmar efter befruktning, eller mer vanligt, efter äggläggningen (AEL). Under dessa förhållanden varar embryogenes 21 + / - 1 timme vid 25 ° C.
- Ägg från en tidsinställd ägg-lay (1-2 tims) att på lämpligt sätt i åldrarna är nästa ses för morfologiska kriterier. Efter omfattande tvättning i dH 2 O, är dechorionated ägg som placerats i en plast kultur maträtt (under dH 2 O) för visning. Korrekt iscensättning kan bekräftas med morfologiska kriterier med hjälp av reflekterat ljus med en dissektion mikroskop (Campos-Ortega och Hartenstein, 1985). Mogna slutskedet embryon (22-24h AEL) på gränsen till kläckningen är allmänt erkända genom delning av nagelband och uppblåsta luftstrupe. Embryon kan också genotypas med hjälp av GFP balancers och en fluorescens dissektion mikroskop med lämpliga filter.
- För dissektion, dechorionated och utvecklingsmässigt iscensatt embryon bifogas (ryggsidan uppåt) på ett täckglas under en droppe koksaltlösning (se steg 1.5). Embryon bort från vitelline membranet genom att punktera membranet nära främre eller bakre änden med ett glas mikropipett eller volfram nål, och sedan försiktigt befria embryot från membranet. Som förberedelse för dissektion bör embryot placeras på täckglas med ryggens yta upp (ryggsidan upp dissektion kommer att utsätta den ventrala nervsystemet och neuromusculature för experiment. Kan dock embryot givetvis placeras på andra sätt att underlätta tillgången till andra vävnader.)
- Tidigt stadium embryon (<16 timmar AEL) ansluts direkt till rent glas eller täckta med polylysine (poly-L-lysin hydrobromid, Broadie och Bate, 1993a, b). Äldre embryon (> 16 timmar AEL), efter nagelband bildas, måste limmas, helst till Sylgard-belagd (Dow Corning) täckglas. En vatten-polymerisation cyanoakrylat kirurgiskt eller veterinärt lim används (Broadie och Bate, 1993c, d). Limmet levereras genom ett litet glaselektrod pipett (10-20 mikrometer innerdiameter spets) bifogas en gummislang med lim flödet styrs av munnen tryck. Man måste vara försiktig vid lim leverans, eftersom limmet polymerizes snabbt vid kontakt med koksaltlösning. Observera också att limma inte kan utföras i saltlösning med ingen eller låg tvåvärt jonkoncentrationer som limmet kräver divalent joner att polymerisera. Små mängder av lim används första gången för att ordentligt fästa huvud och svans.
- När ändarna av embryot limmas på täckglas, är ett snitt längs ryggens mittlinje med en glaselektrod eller vässade volfram nål. Detta underlättas genom att försiktigt perforera raden av snittet innan du köper finalen. Sidorna av snittet sedan bifogas täckglas med mer lim, att försiktigt sprida embryot platt. Den inre organ inklusive mag-tarmkanalen, fett organ och, som alternativ, luftstrupen sedan bort genom undertryck med hjälp av en glaspipett bifogas gummislang (Broadie och Bate 1993a-c). Embryot ska nu fästas plant på täckglas, epidermis ner med den ventrala centrala nervsystemet, perifera nerver, och somatiska muskulaturen utsätts för experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Exakt stadieindelning av embryon är kritisk på grund av den snabba mognaden av funktionella egenskaper under tiden loppet av bara några timmar. Flera frågor komplicerar denna iscensättning. Först de flesta forskare använder tidsinställda ägg lägger till steg embryon, men äggläggning kan variera enormt från djur till djur i olika förhållanden (Broadie et al. 1992). I synnerhet kvinnor på en begränsad diet tenderar att behålla befruktade ägg under långa perioder före om. Det är därför viktigt att "klara" honor genom att mata på en rik jäst kost i minst 2 dagar före samla ägg (Broadie et al. 1992). Dessutom äldre kvinnor också ha ägg under en längre tid innan läggningen. En äldre kvinna får rutinmässigt lägga ägg ett par timmar innan de kläcks. Det är därför viktigt att använda unga kvinnor (<7 dagar) för de mest konsekventa om tider (Broadie et al. 1992). För det andra, under sen embryo stadier, är det svårt att scenen embryon enbart av morfologiska kriterier. De flesta klara iscensättningen funktioner är klar med <16 timmar AEL (Campos-Ortega och Hartenstein, 1985), men mest funktionella utvecklingen sker> 16 timmar AEL. Sen utvecklande funktioner (t.ex. trakeal luft-fyllning, garvning av nagelband) är få och tenderar att vara mindre tidsmässigt begränsad. Av dessa skäl rekommenderar vi en kombinatoriska metod: samla in ägg från 1-2 tim tidsinställda lägger, stadium väldefinierade tidiga morfologiska händelserna i <30 minuter i längd (t.ex. gastrulation, bröst stängning, 3-delad gut, Campos-Ortega och Hartenstein, 1985) och sedan inkubera till önskad ålder i en välkontrollerad 25 ° C inkubator.
Den manuella dissekering och limningen kräver finmotorik under ett mikroskop som få människor från början har. Dessa färdigheter måste utvecklas över tiden. Praktiker bör vara villiga att begå ett minimum av flera veckors daglig hängiven övning innan väntar en hög frekvens av framgång. Förberedelser lämpar sig för mikroskopisk undersökning av CNS och några ventrala neuromuskulära korsningar bör kunna uppnås relativt snabbt, medan friska förberedelser lämplig för elektrofysiologi normalt kräver mer ansträngning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
KB stöds av NIH bidrag GM54544.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 (for 60 mm dish; other sizes available) | Cages can also be home made using punctured tri-pour beakers, as shown in video |
| Sylgard 184 | Dow Corning | Available from various companies | Surgical glue adheres better to sylgard-coated coverslips |
| Fine glass tubing, outer diameter 1.0-1.5 mm | Various | For pulling into fine glass needles for dissection and tubes for glue delivery | |
| Plastic tubing, to attach to glass pipette for mouth suction and glue application | Tygon | Tubing inner diameter needs to match glass outer diameter. |
References
- Aravamudan, B., Fergestad, T., Davis, W. S., Rodesch, C. K., Broadie, K. Drosophila UNC-13 is essential for synaptic transmission. Nat. Neurosci. 2, 965-971 (1999).
- Auld, V. J., Fetter, R. D., Broadie, K., Goodman, C. S. Gliotactin a novel transmembrane protein on peripheral glia, is required to form the blood-nerve barrier in Drosophila. Cell. 81, 757-767 (1995).
- Baines, R. A., Bate, M. Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo. J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).
- Baines, R. A., Robinson, S. G., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Postsynaptic expression of tetanus toxin light chain blocks synaptogenesis in Drosophila. Curr. Biol. 9, 1267-1270 (1999).
- Baines, R. A., Uhler, J. P., Thompson, A., Sweeney, S. T., Bate, M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J. Neurosci. 21, 1523-1531 (2001).
- Bate, M. The embryonic development of the larval muscles in Drosophila. Development. 110, 791-804 (1990).
- Bate, M., Martinez Arias, A. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. Vol. I, II (1993).
- Baumgartner, S., JT, L. ittleton, Broadie, K., MA, B. hat, Harbecke, R., JA, L. engyel, Chiquet-Ehrismann, R., Prokop, A., Bellen, H. J. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87, 1059-1068 (1996).
- AH, B. rand Perrimon N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Brand, A. GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system. Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).
- Broadie, K. Electrophysiological Approaches to the Neuromusculature. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 273-296 (2000).
- Broadie, K., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 144-166 (1993a).
- Broadie, K., Bate, M. Development of larval muscle properties in the embryonic myotubes of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 167-180 (1993b).
- Broadie, K., Bate, M. Activity-dependent development of the neuromuscular synapse during Drosophila embryogenesis. Neuron. 11, 607-619 (1993c).
- Broadie, K., Bate, M. Synaptogenesis in the Drosophila embryo: innervation directs receptor synthesis and localization. Nature. 361, 350-353 (1993d).
- Broadie, K., Bellen, H. J., DiAntonio, A., Littleton, J. T., Schwarz, T. L. The absence of Synaptotagmin disrupts excitation-secretion coupling during synaptic transmission. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10727-10731 (1994).
- Broadie, K., Prokop, A., Bellen, H. J., O'Kane, C. J., Schulze, K. L., Sweeney, S. T. Syntaxin and Synaptobrevin function downstream of vesicle docking in Drosophila. Neuron. 15, 663-673 (1995).
- Broadie, K., Rushton, E., Skoulakis, E. C. M., Davis, R. L. eonardo a 14-3-3 protein involved in learning, regulates presynaptic function. Neuron. 19, 391-402 (1997).
- Broadie, K., Skaer, H., Bate, M. Whole-embryo culture of Drosophila: development of embryonic tissues in vitro. Roux's Arch. Develop. Biol. 201, 364-375 (1992).
- Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin. (1985).
- Deitcher, D. L., Ueda, A., Stewart, B. A., Burgess, R. W., Kidokoro, Y., Schwartz, T. L. Distinct requirements for evoked and spontaneous release of neurotransmitter are revealed by mutations in the Drosophila gene neuronal-synaptobrevin. J. Neurosci. 18, 2028-2039 (1998).
- Featherstone, D. E., Broadie, K. Surprises from Drosophila: genetic mechanisms of synaptic development and plasticity. Brain Res. Bull. 53, 501-511 (2000).
- Featherstone, D. E., Rushton, E. M., Hilderbrand-Chae, M., Phillips, A. M., Jackson, F. R., Broadie, K. Presynaptic glutamic acid decarboxylase is required for induction of the postsynaptic receptor field at a glutamatergic synapse. Neuron. 27, 71-84 (2000).
- Featherstone, D. E., Davis, W. S., Dubreuil, R. R., Broadie, K. Drosophila alpha- and beta-spectrin mutations disrupt presynaptic neurotransmitter release. J Neurosci. 21, 4215-4224 (2001).
- Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release. Nat Neurosci. 5, 141-146 (2002).
- Featherstone, D. E., Rushton, E., Rohrbough, J., Liebl, F., Karr, J., Sheng, Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. An essential Drosophila glutamate receptor subunit that functions in both central neuropil and neuromuscular junction. J. Neurosci. 25, 3199-3208 (2005).
- Fergestad, T., Davis, W. S., Broadie, K. The stoned proteins regulate synaptic vesicle recycling in the presynaptic terminal. J Neurosci. 19, 5847-5860 (1999).
- Fergestad, T., Wu, M. N., Schulze, K. L., Lloyd, T. E., Bellen, H. J., Broadie, K. Targeted mutations in the syntaxin H3 domain specifically disrupt SNARE complex function in synaptic transmission. J Neurosci. 21, 9142-9150 (2001).
- Fergestad, T., Broadie, K. Interaction of stoned and synaptotagmin in synaptic vesicle endocytosis. J Neurosci. 21, 1218-1227 (2001).
- Goodman, C. S., Doe, C. Q. Embryonic Development of the Drosophila Central Nervous System. In The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 1131-1206 (1993).
- Harrison, S. D., Broadie, K., Goor, J. vande, Rubin, G. M. Mutations in the Drosophila Rop gene suggest a function in general secretion and synaptic transmission. Neuron. 13, 555-566 (1994).
- Huang, F. D., Woodruff, E., Mohrmann, R., Broadie, K. Rolling blackout is required for synaptic vesicle exocytosis. J. Neurosci. 26, 2369-2379 (2006).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. L-glutamate as an excitatory transmitter at the Drosophila larval neuromuscular junction. J. Physiol. 262, 215-236 (1976b).
- Kidokoro, Y., Nishikawa, K. I. Miniature endplate currents at the newly formed neuromuscular junction in Drosophila embryos and larvae. Neuroscience Research. 19, 143-154 (1994).
- Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. J. Neurosci. 17, 9642-9655 (1997).
- Mohrmann, R., Matthies, H. J., Woodruff III, E., Broadie, K. Stoned B mediates sorting of integral synaptic vesicle proteins. Neuroscience. 153, 1048-1063 (2008).
- Nishikawa, K. I., Kidokoro, Y. Junctional and extrajunctional glutamate receptor channels in Drosophila embryos and larvae. J. Neurosci. 15, 7905-7915 (1995).
- Renden, R., Berwin, B., Davis, W., Ann, K., Chin, C. T., Kreber, R., Ganetzky, B., Martin, T. F., Broadie, K. Drosophila CAPS is an essential gene that regulates dense-core vesicle release and synaptic vesicle fusion. Neuron. 31, 421-437 (2001).
- Rohrbough, J., Broadie, K. Electrophysiological Analysis of Synaptic Transmission in Central Neurons of Drosophila Larvae. J. Neurophysiol. 88, 847-860 (2002).
- Rohrbough, J., Rushton, E., Palanker, L., Woodruff, E., Matthies, H. J., Acharya, U., Acharya, J. K., Broadie, K. Ceramidase regulates synaptic vesicle exocytosis and trafficking. J. Neurosci. 24, 7789-7803 (2004).
- Rohrbough, J., Rushton, E., Woodruff, E. 3rd, Fergestad, T., Vigneswaran, K., Broadie, K. Presynaptic establishment of the synaptic cleft extracellular matrix is required for postsynaptic differentiation. Genes Dev. 21, 2607-2628 (2007).
- Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J. Comp. Physiol.. A175, 179-191 (1994).
- Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14, 341-351 (1995).
- Tsunoda, S., Salkoff, L. Genetic analysis of Drosophila neurons: Shal, Shaw, and Shab encode most embryonic potassium currents. J. Neurosci. 15, 1741-1754 (1995).
- Ueda, A., Kidokoro, Y. Longitudinal body wall muscles are electrically coupled across the segmental boundary in the third instar larva of Drosophila melanogaster. Invertebrate Neuroscience. 1, 315-322 (1996).
- Wu, C. F., Haugland, F. N. Voltage clamp analysis of membrane currents in larval muscle fibers of Drosophila. J. Neurosci. 5, 2626-2640 (1985).
- Yan, Y., Broadie, K. In vivo assay of presynaptic microtubule cytoskeleton dynamics in Drosophila. J Neurosci Methods. 162, 198-205 (2007).
- Yoshikami, D., Okun, L. Staining of living presynaptic nerve terminals with selective fluorescent dyes. Nature. 310, 53-56 (1984).
- Zagotta, W. N., Brainard, M. S., Aldrich, R. W. Single-channel analysis of four distinct classes of potassium channels in Drosophila muscle. J. Neurosci. 8, 4765-4779 (1988).
- Zhang, Y. Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. A living synaptic vesicle marker: synaptotagmin-GFP. Genesis. 34, 142-145 (2002).
