Summary
Esta técnica expone al neuromusculatura Drosophila embrionarias para inmunohistoquímica o de registro electrofisiológico. Es útil para el estudio de los primeros eventos en el desarrollo neuromuscular o la realización de electrofisiología en los mutantes que no pueden eclosionar.
Abstract
Drosophila es un modelo genético de primera para el estudio de ambos el desarrollo embrionario y funcional neurociencia. Tradicionalmente, estos campos son muy aislados unos de otros, con historias en gran medida independiente y la comunidad científica. Sin embargo, la relación entre estos campos por lo general diferentes programas de desarrollo es la base de adquisición de las propiedades funcionales de señalización eléctrica y la diferenciación de las sinapsis químicas funcional durante las fases finales de la formación de circuitos neuronales. Esta interfaz es una zona muy importante para la investigación. En Drosophila, estas fases de desarrollo funcional se producen durante un período de <8 horas (a 25 ° C) durante el último tercio de la embriogénesis. Este período de desarrollo tardío fue considerado durante mucho tiempo difíciles de investigación debido a la deposición de una cutícula dura, epidérmico impermeable. Un avance avance fue la aplicación de agua de polimerización pegamento quirúrgico que puede aplicarse localmente a la cutícula para permitir la disección controlada de la última etapa de embriones. Con una incisión longitudinal dorsal, el embrión puede ser en plano, dejando al descubierto el cordón nervioso ventral y la musculatura de la pared del cuerpo para la investigación experimental. Este sistema ha sido muy utilizada para aislar y caracterizar mutantes genéticos que impiden la formación de sinapsis embrionario, por lo que revelan los mecanismos moleculares que regulan la especificación y diferenciación de las sinapsis y conexiones sinápticas propiedades funcionales de señalización.
Protocol
Parte 1: Equipos y Suministros
- Un microscopio de disección se requiere una buena disección de embriones, se sugiere la ampliación de 40X, 25X, con los ojos las piezas para aumentar al máximo aumento.
- Pinzas finas (número 5) se requieren para la selección manual de los embriones y devitellinization de embriones.
- Equipo para realizar y modificar las finas agujas de vidrio es necesario. Tira de vidrio se requieren agujas para la disección. Preferimos vidrio sólido para la disección (duran más), pero la norma de paredes gruesas tubo de vidrio (diámetro externo 1-1,5 mm) funciona tan bien. Algunas personas utilizan agujas muy finas de tungsteno, electrólisis de la nitidez deseada en un baño de NaOH 1 M con una batería de 10 + autotransformador Amp. Afiladas agujas de disección de tungsteno tienen la ventaja de que son relativamente resistentes y de larga duración. Agujas de vidrio hueco (similar a la forma de parches electrodos pinza) están conectados a un tubo de plástico y se utiliza durante la disección de succión y expulsión de solución salina, así como la entrega controlada de la cola. Una variedad de extractores de vidrio están disponibles para la fabricación de agujas de cristal. Programada por ordenador extractores puede ser programado para tirar de una variedad de formas y tamaños. El Brown-Flaming modelos (Sutter Instrument Co.) son ampliamente favorecidos. Un microscopio compuesto (20-40X objetivo) debe estar disponible para inspeccionar y modificar los electrodos antes de su uso.
- Dos tipos de soluciones se utilizan comúnmente para baño de los tejidos embrionarios durante la disección: 1) "estándar" (Jan y Jan, 1976a) o "norma modificada" (Broadie, 2000) salinas, en base a soluciones de uso común para la grabación en otros sistemas de invertebrados , y 2) "hemolinfa-like" (HL) Salines (Stewart et al 1994), un compromiso entre la solución salina normal y las concentraciones iónicas medidas en la hemolinfa de Drosophila. Cabe señalar que ninguna de estas salinas de reproducir fielmente la composición química de la hemolinfa en vivo (Broadie, 2000). Salino estándar contiene (en mM): 135 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl 2, 1,8 CaCl 2, 72 sacarosa, 5 TES, pH 7,2. Los experimentadores también puede considerar salina preparada comercialmente de insectos (por ejemplo, los medios de comunicación de insectos de Schneider), que no es apta para registro electrofisiológico pero lo más probable para proteger la salud de los tejidos expuestos.
Parte 2: La estadificación de embriones y la disección
- Para la recolección de huevos óptima, mantener jóvenes (<7 días), varones sanos y las moscas hembras (20-40) en fresco por la que se ollas durante 2-3 días. Por la que se ollas comunes constan de 100 vasos de plástico ml (Tri-Pour) perforada para proporcionar la circulación de aire adecuada, cubriendo una placa de agar de 60 mm. Placas de agar contienen jugo de manzana o de uva endurecido con agar. Existen varias recetas, pero un ejemplo es el siguiente: 700 ml de agua, 25 a 30 gramos de agar, 300 ml de jugo concentrado (uva o manzana), 0,5 g de metilparabeno (p-hydroxymethylbenzoate), y el azúcar 30 g. Autoclave el agua y el agar, y por separado hervir el p-hydroxymethylbenzoate con el azúcar y el jugo. Mezcle el jugo de agar y soluciones de forma rápida y verter en placas de 60 mm, la eliminación de las burbujas.
- Antes de la recolección de huevos, las moscas se alimentan de pasta de levadura (7 gramos de levadura de panadería en 9 ml de agua se almacenan a 4 ° C) en las placas nuevas, cambiar por lo menos dos veces al día durante al menos dos días. El día 3, una buena olla debe producir 100-200 huevos por hora. Mejor puesta de huevos se observa en una olla mantenido a su lado con el agar en la placa de rayado. Muchos embriones se establecerán en o junto a los arañazos.
- Para recoger un gran número de embriones, la transferencia de los embriones con cuidado de la placa de agar en una cesta con un pincel. Una cesta se puede hacer con un tubo de centrífuga de 15 ó 50 ml. Cortar la parte inferior dejando la superficie lo suficiente para atrapar a una pantalla (70 micras de malla) entre la tapa y la parte superior del tubo. Enjuague los embriones con dH 2 0 y poner en una placa de Petri de agua dulce 50% al 100% de lejía para eliminar el corion externo. Por otra parte, los huevos pueden ser recogidos por separado utilizando unas pinzas finas, y dechorionated mediante la colocación de forma manual en una gota de lejía. De-chorionation puede tardar desde 30 segundos a 2 minutos (lejía fresca es mucho más rápido), y deben ser controlados bajo el microscopio de disección. La eliminación del corion expone la membrana brillante, transparente vitelino. Huevos dechorionated debe enjuagarse brevemente, o se colocan en una solución salina, como el cloro destruye rápidamente los tejidos devitellinized.
- Es fundamental para la etapa cuidadosamente los embriones a la edad deseada de desarrollo. La Drosophila definido las fases embrionarias (1-17; Campos-Ortega y Hartenstein, 1985) no son útiles, como todo el desarrollo neuromuscular funcional ocurre en 16 etapas finales o de la etapa 17. Por lo tanto, los embriones son protagonizadas por hora de desarrollo a 25 ° C en una incubadora humidificada, en horas después de la fecundación o, más comúnmente, después de la puesta de huevos (AEL). En estas condiciones, la embriogénesis dura 21 + / - 1 hora a 25 ° C.
- Los huevos procedentes de un tiempo de huevo laicos (1-2 hrs) que estén debidamente años están al lado de vista de los criterios morfológicos. Después de un prolongado lavado en dH 2 O, los huevos dechorionated se colocan en una placa de cultivo de plástico (en dH 2 O) para su visualización. Puesta en escena correcta se puede confirmar con criterios morfológicos utilizando la luz reflejada con un microscopio de disección (Campos-Ortega y Hartenstein, 1985). Madura la última etapa de embriones (22-24h AEL) al borde de la eclosión son generalmente reconocidos por la segmentación de la cutícula y la tráquea infladas. Los embriones también pueden ser genotipo utilizando equilibradores de las buenas prácticas agrarias y un microscopio de disección de fluorescencia con los filtros adecuados.
- Para la disección, embriones y dechorionated etapas de desarrollo están sujetos (lado dorsal hacia arriba) en un cubreobjetos en una gota de solución salina (véase el paso 1.5). Los embriones se extraen de la membrana vitelina por punción de la membrana cerca del extremo anterior o posterior, con una micropipeta de vidrio o una aguja de tungsteno, y luego suavemente liberar al embrión de la membrana. En preparación para la disección, el embrión debe ser colocado en el portaobjetos con la superficie hasta dorsal (parte dorsal hasta la disección se exponga el sistema nervioso ventral y neuromusculatura para los experimentos. Sin embargo, el embrión, obviamente, se puede colocar en otras maneras de facilitar el acceso a otros tejidos.)
- Embriones prematuros (<16 h AEL) se conectan directamente a limpiar el cristal o de vidrio recubierto con polilisina (poli-L-lisina bromhidrato; Broadie y Bate, 1993a, b). Mayores embriones (> 16 hrs AEL), tras la formación de la cutícula, deben ser pegados, lo ideal es que Sylgard recubiertos (Dow Corning) cubreobjetos. Un agua de polimerización pegamento de cianoacrilato quirúrgico o veterinario se utiliza (Broadie y Bate, 1993c, d). El pegamento se entrega a través de una pipeta de vidrio pequeño electrodo (10-20 punta micrómetro de diámetro interior) conectada a un tubo de goma con el flujo de cola controlado por la presión de la boca. Se debe tener cuidado durante el parto de cola, como el pegamento se polimeriza rápidamente en contacto con la solución salina. Tenga en cuenta también que pegar no se puede realizar en una solución salina sin o bajas concentraciones de iones divalentes, como el pegamento requiere iones divalentes para polimerizar. Pequeñas cantidades de pegamento se utilizó por primera vez para sujetar firmemente la cabeza y la cola.
- Una vez que los extremos del embrión se pegan a los cubreobjetos, se hace una incisión a lo largo de la línea media dorsal con un electrodo de vidrio o una aguja de tungsteno afilada. Esto es más fácil con cuidado perforando la línea de incisión antes de hacer el corte final. Los lados de la incisión se adjuntarán a los cubreobjetos con más cola, para extender suavemente el piso embrión. Los órganos internos, incluyendo los intestinos, los órganos de la grasa y, opcionalmente, la tráquea se retirar mediante aspiración con una pipeta de vidrio conectado a un tubo de goma (Broadie y Bate 1993a-c). El embrión debe adjuntar planos de la cubreobjetos, la epidermis hacia abajo con el ventral del sistema nervioso central, nervios periféricos y músculos somáticos expuestos para la experimentación.
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Discussion
Clasificación precisa de los embriones es crítica debido a la rápida maduración de las propiedades funcionales en el transcurso de tiempo de tan sólo varias horas. Varios problemas complican la puesta en escena. En primer lugar, la mayoría de los investigadores utilizan huevo tiempo pone a los embriones de etapa, pero el tiempo de puesta de huevos puede variar enormemente de un animal a otro en diferentes condiciones (Broadie et al. 1992). En particular, las mujeres con una dieta limitada tienden a retener los huevos fecundados por períodos prolongados antes de la puesta. Por tanto, es fundamental para "limpiar" las hembras se alimentan de una dieta rica en levadura por lo menos 2 días antes de la recolección de huevos (Broadie et al. 1992). Por otra parte, las mujeres mayores también conservan los huevos durante un largo período antes de la puesta. Una mujer mayor de rutina pueden poner los huevos sólo un par de horas antes de su eclosión. Por tanto, es importante la utilización de las mujeres jóvenes (<7 días) para los momentos más consistente por la que se (Broadie et al. 1992). En segundo lugar, durante las etapas finales del embrión, es difícil etapa de embriones únicamente por criterios morfológicos. Características de clasificación más clara se completa con <16 h AEL (Campos-Ortega y Hartenstein, 1985), pero el desarrollo se produce más funcional> 16 hrs AEL. Finales de las características del desarrollo (por ejemplo, la tráquea el aire que llena, el curtido de la cutícula) son pocos y tienden a ser menos temporalmente restringido. Por estas razones, se recomienda un enfoque combinatorio: recoger huevos de 1-2 horas tiempo establece, escenario para bien definidos los primeros eventos morfológicos de <30 minutos de duración (gastrulación por ejemplo, el cierre dorsal, 3-parte del intestino; Campos-Ortega y Hartenstein, 1985) y luego incubar a la edad deseada de una manera bien controlada 25 ° C incubadora.
La disección manual y la aplicación de cola requieren habilidades motoras finas bajo el microscopio que pocas personas poseen inicialmente. Estas habilidades se deben desarrollar con el tiempo. Experimentadores deben estar dispuestos a cometer un mínimo de varias semanas de práctica dedicada al día antes de esperar una alta frecuencia de éxito. Los preparativos adecuados para el examen microscópico del sistema nervioso central y algunas uniones neuromusculares ventral debe ser alcanzable con relativa rapidez, mientras que las preparaciones saludables adecuadas para electrofisiología normalmente requieren un mayor esfuerzo.
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Acknowledgments
KB es apoyado por el NIH subvención GM54544.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 (for 60 mm dish; other sizes available) | Cages can also be home made using punctured tri-pour beakers, as shown in video |
| Sylgard 184 | Dow Corning | Available from various companies | Surgical glue adheres better to sylgard-coated coverslips |
| Fine glass tubing, outer diameter 1.0-1.5 mm | Various | For pulling into fine glass needles for dissection and tubes for glue delivery | |
| Plastic tubing, to attach to glass pipette for mouth suction and glue application | Tygon | Tubing inner diameter needs to match glass outer diameter. |
References
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