Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הקלטה של ​​אלקטרו תסיסנית עובריים

Published: May 21, 2009 doi: 10.3791/1348
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Biological Sciences, University of Illinois, 2Department of Biological Sciences, Vanderbilt University

Summary

הקלטות אלקטרו מן

Abstract

תסיסנית הוא מודל גנטי המוביל במחקר של פיתוח הן עובריים המוח תפקודית. באופן מסורתי, בתחומים אלה הם די מבודדים אחד מהשני, עם היסטוריה עצמאית במידה רבה קהילות מדעיות. עם זאת, הממשק בין שדות אלה נבדלים בדרך כלל התוכניות התפתחותית תפקודית הבסיסית רכישת נכסים איתות חשמלי הבחנה של סינפסות כימיות תפקודית במהלך השלבים האחרונים של הקמת מעגל עצבי. ממשק זה הוא אזור חשוב ביותר לחקירה. ב תסיסנית, אלה שלבים של התפתחות תפקודי להתרחש בתקופה של <8 שעות (במהירות של 25 ° C) במהלך השליש האחרון של העובר. תקופה זו התפתחותי מאוחר נחשב ארוך סורר אל בשל חקירה בתצהיר של הציפורן, קשה אפידרמיס חדיר. מראש היה פריצת דרך ביישום של דבק מים polymerizing כירורגית כי ניתן להחיל באופן מקומי כדי לאפשר לציפורן לנתיחה מבוקר של עוברים בשלב מאוחר. עם חתך אורכי הגבי, העובר יכול להיות מונח שטוח, חשיפת עצבים בחוט הגחון ועל קיר שרירי הגוף חקירה ניסויית. Whole-cell-clamp תיקון טכניקות אז יכול להיות מועסק על מנת להקליט בנפרד נוירונים לזיהוי והשרירים סומטי. תצורות אלו הקלטה שימשו כדי לעקוב אחר המראה ההבשלה של זרמים יוניים התפשטות פוטנציאל פעולה בשני הנוירונים והשרירים. מוטנטים גנטיים המשפיעים אלה התכונות החשמליות כבר מאופיין לחשוף את ההרכב המולקולרי של תעלות יונים ומתחמים איתות קשור, ולהתחיל חקר המנגנונים המולקולריים של בידול פונקציונלי. דגש מיוחד כבר את הרכבה של קשרים סינפטיים, הן בפריפריה מערכת העצבים המרכזית. Glutamatergic neuromuscular צומת (NMJ) נגיש ביותר שילוב של דימות אופטי ורישום אלקטרו. אלקטרודה יניקה כוס משמש כדי לעורר את העצבים ההיקפית, עם הגירוי הנוכחי לצומת (EJC) הקלטות שנעשו בשריר מתח מהודק. תצורה זו הקלטה שימש בתרשים בידול פונקציונלי של הסינפסה, ולעקוב אחר המראה ההבשלה של נכסים presynaptic שחרור גלוטמט. בנוסף, תכונות postsynaptic ניתן assayed באופן עצמאי באמצעות iontophoretic או יישום בלחץ של גלוטמט ישירות על פני שרירים, כדי למדוד את המראה ואת ההבשלה של שדות קולטן הגלוטמט. לפיכך, גם אלמנטים טרום postsynaptic ניתן לנטר בנפרד או בשילוב במהלך synaptogenesis עובריים. מערכת זו הייתה בשימוש רב לבודד ולאפיין מוטציות גנטיות הפוגעות במבנה סינפסה העוברית, וכך לגלות את המנגנונים המולקולריים השולטים מפרט והבחנה של קשרים סינפסה ופונקציונלי תכונות האיתות הסינפטי.

Protocol

חלק 1: ציוד ואספקה

  1. הקלטה אלקטרו מעוברים תסיסנית הראשונה מחייבת מיומנות בטכניקות לנתיחה עובריים, אשר מתוארים וידאו אחר יופיטר.
  2. הקלטה אלקטרו מעוברים תסיסנית מנצל תקן מהדק תיקון תצורות הקלטה. מהדק תיקון הקלטה ציוד ותוכנה מתאימה תכשירים רבים אחרים מתאים גם הקלטה מעוברים תסיסנית. מכיוון עוברים תסיסנית מודבקים לחמוק כיסוי במהלך דיסקציה, לשכת הקלטה לקבל תלושי לכסות. העובי של התכשיר ובאופן שבו הוא רכוב על coverslip דורש מיקרוסקופ זקוף עם אופטיקה DIC מעולה עדשה ארוכה מרחק עבודה.
  3. שני סוגים של פתרונות אמבטיה משמשים הקלטה אלקטרו: 1) "רגילה" (יאן יאן, 1976a) או "שונה תקן" (Broadie, 2000) salines, המבוססת על פתרונות נפוץ במערכות הקלטה חוליות אחרים, 2) "haemolymph דמוי" (HL) salines (סטיוארט et al 1994), פשרה בין מלח רגיל הריכוזים יוניים נמדד haemolymph תסיסנית. יצוין, כי אף אחד salines אלה לחקות במדויק את ריכוזי יוניים נמדד haemolymph, שהם שלילי עבור הקלטה (Broadie, 2000). התקן מכיל מלח (מ"מ): 135 NaCl, KCl 5, 4 MgCl 2, 1.8 CaCl2, 72 סוכרוז, 5 TES, pH 7.2.

חלק 2: תצורת הקלטה

  1. עבור ניסויים פיזיולוגיים, הכנת העובר גזור ממוקם תא קטן פרספקס הקלטה (<0.5 מ"ל) וראו אור מועבר עם מיקרוסקופ מתחם זקוף מצויד בניגוד ההפרש התערבות (Nomarski) אופטיקה מרחק רב עובד 40-100x ( בדרך כלל 40X) טבילה במים אובייקטיבי (Broadie ו בייט, 1993a). הקלטות נעשות בדרך כלל מתחת לטמפרטורת החדר (16-22 ° C), בקשיים גוברים והולכים בטמפרטורות גבוהות (22 + מעלות צלזיוס). אנחנו להשיג זאת על ידי קירור את החדר ולא קירור preapartion.
  2. Pipettes תיקון יכול להיות משך מתוך מגוון של סיבים מלאים כוסות (למשל בורוסיליקט זכוכית, 1 מ"מ קוטר חיצוני) וטיפים צריכה להיות אש מלוטש כדי התנגדויות הסופי של 5-10 MΩ. חוט כסף כלורי, הקרקע ממוקמת באמבטיה. איתותי הם מוגבר באמצעות מגבר תיקון-clamp (למשל Axopatch-1D, מכשירים אקסון), מסונן עם 8-מוט בסל מסנן ב 20-10 הרץ, וטעמו או on-line או מאוחסנים דיגיטלית לצורך ניתוח מאוחר יותר.
  3. תיקון קונבנציונלי-clamp ההקלטות נעשות לרוב על 18 מעלות צלזיוס עם pipettes תיקון משך מן הכוס בורוסיליקט סיבים מלא (חום טיפים מלוטשים id 1 מיקרומטר ~). רשומות נוכחי עשויים לזהות סיבי שריר multinucleate בתוך מלחציים מתח (סטנדרטי מחזיק הפוטנציאלים -60 ל -80 mV) (Broadie ו בייט, 1993a-d; Broadie et al, 1997;.. Fergestad et al, 1999; פת'רסטון ואח' ., 2000). פיפטה תיקון פתרון כולל (מ"מ): 120 KCl, KOH 20, 4 MgCl 2, 0.25 CaCl 2, 5 EGTA, 4 Na 2 ATP, סוכרוז 36, ו 5 TES, בופר ב-pH 7.2. אלקטרודות הקלטה חוזרים מלא.

חלק 3: הקלטה שרירים

  1. באופן עקרוני, כל שריר עובריים עשוי להיות מוקלט מ בהכנה זו. בפועל, הקלטה ביותר התרכז, שרירי גדול אורך הגחון בשכבה הפנימית ביותר של השריר (בייט, 1990; Broadie ו בייט, 1993a-c). תקליטים יש גם עשוי שרירי הגב ואת לרוחב של שכבה זו שריר (Kidokoro ו Nishikawa, 1994; אולד et al 1995;. Nishikawa ו Kidokoro, 1995;. באומגרטנר בבית אל 1996). עם זאת, רוב ניסויי להתמקד קבוצה של ארבעה שרירים אורך הגחון (6,7,12,13), בעיקר שריר 6 בבטן קדמית (A2, A3).
  2. טיפול לא האנזימטית נדרש לפני ההקלטה השריר בעוברים צעירים (<16 AEL שעות). עם זאת, למעטפת השרירים מתפתח העובר לאחר מכן (> 16 שעות AEL) ו יש להסיר עם collagenase (collagenase סוג ד ', 1 מ"ג / מ"ל ​​מלוחים קטיון ללא divalent, 0.5-2 דקות ב RT) לפני הקלטת תיקון. בעקבות טיפול האנזים, התנגדויות חותם על השריר הם בדרך כלל> 1 GΩ.
  3. Patch-clamp הקלטות יכול להיות עשוי השרירים עובריים באמצעות מספר טכניקות סטנדרטיות (Broadie בייט 1993a ו-c, Broadie et al 1994, 1995, 1997;. Nishikawa ו Kidokoro, 1995). תקן כל תיקון-clamp וריאציות - תא המצורפת, פנימה החוצה, החוצה, החוצה - יכול להיות מועסק להקליט פעילות ערוץ אחד בשריר או מבודדים קרום תיקוני השריר. קולטן הגלוטמט יחיד פעילות הערוץ (~ 12 הרשות הפלסטינית ב -60 mV) הם הנצפה בדרך כלל על השלב נפילה של ספונטאניות זרמים צומת מעוררים (sEJCs) רשמה במצב התא כולו.
  4. ההקלטה נעשית רוב config כל תא הקלטתuration, מושגת בקלות ממצב התא מצורף עם יניקה קלה או חשמלי "באז". השרירים ניתן להקליט משני בתוך מלחציים מתח (פוטנציאל מחזיק אופייני mV -60 ל -80) או מהדק הנוכחי תצורות. השרירים העוברים הצעיר (<13 שעות AEL) לא יכול להיות יעיל מתח מהודקת עקב צימוד נרחב בין myotubes עובריים (Broadie ו בייט, 1993a); זה בדרך כלל לא בעיה בזמן מאוחר יותר (14 + שעות AEL) שלבי ההתפתחות (Ueda ו Kidokoro, 1996).
  5. Nystatin-מחורר הקלטה תיקון-clamp ניתן להשתמש כדי לאמת את הרשומות שהושגו עם כל תא טכניקות סטנדרטיות (Broadie ו בייט, 1993a). הפתרון ניקוב מורכב כדלקמן: 10 מ"ג pluronic F-127 (בדיקות מולקולריות p-1572) הוא מומס 20 מ"ל DMSO, ו 10 מ"ג Nystatin מומס פתרון זה על מנת להפוך את המניות. 100 μl של המניה הוא הוסיף 5 פתרון סינון פיפטה מ"ל להפוך את פתרון ההקלטה. Whole-cell זרמים מתקבלים בדרך כלל <3 דקות לאחר היווצרות חותם. התנגדות הסדרה הוא גדל במידה ניכרת ברוב המקרים תאים יכולים להתפתח זרם זליגה מוגברת (Broadie ו בייט, 1993a).
  6. כל תא מתח מגודרת הנוכחית עובריים בוגרת (ו הזחל) השריר מורכב מחמישה רכיבים בולטים (וו Haugland, 1985; Zagotta et al 1988; Broadie ו בייט, 1993b).: סידן פנימה הנוכחי (אני Ca) ארבעה זרמי אשלגן החוצה (צאנודה ו Salkoff, 1995), כולל שני מהיר, זרמים inactivating, מתח מגודרת (אני) וסידן תלויות (אני CF), ושני מתעכב, הלא inactivating זרמים, מתח מגודרת (אני K) וסידן תלויות (אני CS). יון-החלפה ניסויים ניתן להשתמש כדי לנתח את הזרמים מתגובה כל תא במהלך מהדק מתח (Broadie ו בייט, 1993b).

חלק 4: גירוי צומת הקלטה Neuromuscular ו

  1. השיטה הנפוצה ביותר ואמין של גירוי NMJ משתמש יניקה כוס אלקטרודות על העצב ההיקפי סגמנטלי. אלקטרודות יניקה יכול להיות משך מתוך מגוון של סיבי זכוכית מלא אלקטרודה (1-1.5 מיקרומטר קוטר חיצוני) ויש אש מלוטש כדי להשיג את התצורה הרצויה (~ 5 מיקרומטר קוטר פנימי). קטע קטן (<50 מיקרומטר) של העצב המוטורי המתאים סגמנטלי נשאבים לתוך פיפטה עם שאיבה עדינה כדי ליצור חותם חזק.
  2. מקובל לגרות את העצב שלם על ידי ציור בלולאה של העצב במערכת העצבים המרכזית ליד נקודת היציאה. גישה זו מאפשרת גירוי קל הכנה ללא פגע, אבל יש את החיסרון כי פעילות ספונטנית CNS-עורר יכול להתרחש על גבי הפרדיגמה גירוי מיושם. חלופה אחת היא לגרות את העצב המוטורי לחתוך. זו יכולה להיות מושגת אם CNS מוסר, כי הליך זה נוטה למתוח את העצבים עלולה לגרום נזק. עצב ניתן גם לחתוך עם microelectrode זכוכית חדים, אך הליך זה מייגע וקשה. מומלץ רשומות להיות עשוי הכנת כנן.
  3. גירוי יכול להיות מיושם עם מגוון רחב של פרדיגמות. גירוי קצר (0.2-1 msec) עובד הכי טוב ועוצמת גירוי (בדרך כלל 1-5 V) יהיה תלוי בתצורה יניקה צריכה להיקבע באופן ניסיוני עבור כל תא. Suprathreshold גירוי של העצב המוטורי הטובה ביותר מושגת על ידי קביעת עוצמת הגירוי מעל מעט (1-2 וולט) הסף. עורר תגובות NMJ נרשמות מן השריר, תיקון הידק כמתואר לעיל. חפץ ההלם ניתן להפחיתן באופן משמעותי עם השימוש בקרקע וירטואליים מבודדים.
  4. חלופה אמינה פחות הגירוי יניקה רגיל אלקטרודה העצב גירוי ישיר של מערכת העצבים המרכזית (Nishikawa ו Kidokoro, 1995). Microelectrode מלאים 3-4 M KCl (או KAC) מוכנס לתוך באמצע הגנגליון הגחון וקטניות חיובי של 2 microamp ~ בעוצמה ~ 2 msec משך מועברות (Dietcher et al. 1998). קצה האלקטרודה צריכה להיות neuropil הקרוב hemisegment שבו הגירוי הוא הרצוי. שידור Synaptic נרשם בשריר-תיקון הידק בתצורה סטנדרטית.
  5. NMJ עובריים נגיש הקלטה תיקון-clamp כל תא לאורך הבידול שלה. עבור מעוררים junctional (EJC) הקלטות הנוכחי, אותות, נרשם תיקון מגבר-clamp סטנדרטי, מסוננים (בדרך כלל 1-2 KHz), המרה אות דיגיטלי באמצעות ממשק-to-Analog דיגיטליות, רכשה עם מחשב באמצעות התוכנה המתאים.

חלק 5: Neuromuscular כימית והתרופות יישומים צומת

  1. כל מולקולה קטנה, טעונה ניתן iontophoresed ביעילות אל NMJ עובריים (Aravamudan et al, 1999;. Fergestad et al 1999, 2001). Pipettes Iontophoretic יכול להיות משך עבור תצורות ספציפיות, עם יישומים לתקופות משתנות, באמצעות פולסים של זרם שלילי או חיובי. זה חיוני כדי למנוע דליפה בין pulses בגיבוי היריבה המתאימה הנוכחי (Broadie ואח' 1993d;. פת'רסטון et al 2002, 2005,.. Rohrbough et al 2007). עוצמת גיבוי הנוכחית תשתנה בהתאם לתצורה פיפטה ו צריך להיקבע באופן ניסיוני.
  2. ניסויים רבים נעשו עם הנוירוטרנסמיטר NMJ, L-גלוטמט (יאן יאן, 1976b), באמצעות פתרון מניות 100mm (מונוסודיום מלח, pH 8-9) (Broadie ו בייט, 1993c). Pipettes עמידות גבוהה iontophoretic (100-200 MΩ) שימשו במשך קולטן הגלוטמט מיפוי (gluR) (Broadie ו בייט, 1993d), ו pipettes התנגדות נמוכה יותר (20-50 MΩ) השתמשו כדי להעריך את התגובה gluR הכולל (Broadie et al. 1995, 1997; פת'רסטון et al 2002, 2005;. Rohrbough et al 2007).. בפולסים קצרים (0.1-1 ms) של עבודה שלילית (~ 10 NA) זרם היטב, עם גיבוי קטן, חיובי הנוכחי כדי למנוע דליפה.
  3. שאינם טעונים מולקולות טעונים יכול להיות מיושם על ידי פליטה בלחץ (Fergestad ו Broadie, 2001;. פת'רסטון et al 2001). עבור יישום, פליטה לחץ פיפטה (<5 מיקרומטר קוטר פנימי) המכיל את הפתרון ממוקם קרוב (<10 מיקרומטר) ממסוף עצב. הפתרון להיות נפלט יכול להיות מיושם באמצעות picospritzer (psi 50-10), או אוויר אחר מקור בלחץ (פת'רסטון et al., 2002). במהלך הניסויים ממושכת, חדר הקלטה (נפח <0.5 מ"ל) יש perfused ברציפות (0.1-0.2 מ"ל / sec) עם מלח אמבט רגיל.
  4. ניסויים רבים נעשו עם מלוחים hyperosmotic להפעיל שילוב של שלפוחית ​​סינפטית (Broadie et al 1995;. Aravamudan, et al, 1999;. Fergestad et al, 1999;.. פת'רסטון, et al, 2000, 2002). ניסויים נוספים נעשו עם רעלים, כמו argiotoxin 636 נגד קולטני גלוטמט שחור אלמנה ארס העכביש latroinsectotoxin המכיל (Broadie et al. 1995).

חלק 6: משלימה Neuromuscular ויטל צומת שיטות הדמיה

  1. קינטיקה שלפוחית ​​Synaptic עשוי להיות במעקב עם צבעי ניאון stryl lipophilic (Fergestad ו Broadie, 2001;. Rohrbough et al 2004). הפצה של שלפוחית ​​ניתן לצפות ישירות, ושיעורי אנדוציטוזה ו exocytosis נמדד. גרסאות אחדות נעשו עם מאפיינים שונים ניאון (FM1-43, והעמסת כמו; FM4-64, rhodamine דמוי). שינויים של הצבע המקורי הניבו מוצרים עם תכונות הידרופוביות שונה, ולכן עם קינטיקה כשלון שונים, לדוגמה FM2-10 מנתק הרבה יותר מהר מן הממברנה.
  2. כדי התווית NMJ עובריים עם צבעים stryl, 10 מיקרומטר FM1-43 ניתן לטעון עבור 1-5 דקות בעזרת אשלגן תאיים גבוהות (50-90 mM) (Fergestad ו Broadie, 2001). גישה פיזיולוגית יותר עשויה להיות מושגת באמצעות גירוי על ידי אלקטרודה יניקה עצב. ההכנות נשטפים ואז שוב ושוב + ללא חיץ במשך 5 דקות ב Ca 2, שמר פלואורסצנטי (המייצגים שלפוחית ​​סינפטית צבוע) נמדד. כדי למדוד exocytosis, אפשר לפרוק את צבען או באמצעות אשלגן גבוהות או גירוי חשמלי עצבי.
  3. חלבונים Fusion עם גרסאות ה-GFP הופקו המאפשר תיוג ססגוניות של NMJ עובריים סינפסה (Brand, 1999;. Zhang et al 2002). Transgenics רבים להביע את ה-GFP-tagged חלבונים זמינים כולל סמנים קרום כללי (למשל mCD8-GFP), סמנים postsynaptic (למשל שאכר-GFP, GluRIIA-GFP), cytoskeletal (למשל אקטין-GFP, moesin-GFP, טובולין-GFP) ו המיטוכונדריה סמנים (למשל ציטוכרום C-GFP) וסמנים שלפוחית ​​סינפטית (למשל synaptobrevin-GFP, synaptotagmin-GFP,. Zhang et al, 2002).
  4. כתבים GFP תווית תאים כי הם דינמיים מאוד וניתן להשתמש בו כדי להעריך את תכונות התפתחותיות או פנוטיפים מוטנטים (פת'רסטון ו Broadie, 2000). הלבנה ואז התבוננות התאוששות של הקרינה (FRAP) הוכח להיות ריאלי, לפחות תסיסנית הזחל NMJ (Zhang et al, 2002;. יאן Broadie, 2007). מילה של זהירות, עם זאת: כמה סמנים אלה לא לגמרי להציל מוטנטים null ואולי אף לשנות נורמלי NMJ הפיזיולוגיה.

חלק 7: הקלטה ממרכז הנוירונים המנוע

  1. נוירונים עובריים רבים ניתן לזהות בנפרד על בסיס מיקום סומה ומורפולוגיה השלכה (בייט ו-מרטינז אריאס, 1993; גודמן Doe, 1993; Landgraf et al 1997). יתר על כן, מערכת GAL4/UAS (ברנד Perrimon, 1993) יכולים למקד את ביטוי ה-GFP לדמיין אוכלוסיות נוירונים לזיהוי (ביינס et al., 1998). מחקרים הקלטה עד כה התרכזה קבוצה של חמישה, הנוירונים שטחית הגב בתוך חוט עצב עובריים הגחון (VNC), ארבעה הנוירונים המנוע (ACC ו RP1-4) ואחד interneuron PCC (ביינס et al, 1998, 1999, 2001. ; Rohrbough ו Broadie, 2002; פת'רסטון et al 1995)..
  2. גופי התא של הנוירונים מזוהה נגישים כל תא תיקון-clamp אלקטרודות ההקלטה. נדן neurolemma VNC תחילה להסירו בטיפול קצר עם מוקד פרוטאז (ביינס בייט, 1998; ביינס דוארלא אל, 1999;. Rohrbough ו Broadie, 2002). הגב גופי התא העצבי נחשפים באמצעות בקוטר גדול (~ 20 מיקרומטר) פיפטה תיקון המכיל פרוטאז 0.5-1% (סוג XIV (Sigma) ב מלוחים הקלטה). החומר CNS נדן נשאבים על ידי יניקה אל קצה פיפטה עבור 1-2 דקות עד קרעים בנרתיק (פת'רסטון et al. 1995). כדי לאשר את זהות הסלולר במהלך ההקלטות, לוציפר צהוב (מלח dipotassium, 1-2 מ"ג / מ"ל) ניתן להוסיף את התיקון פתרון כדי להמחיש את המיקום ואת המורפולוגיה של התא.
  3. תקן כל תא מתח ו הנוכחי מהדק הקלטות יכול להתבצע (Rohrbough ו Broadie, 2002;. פת'רסטון et al, 2005). מלוחים הקלטה חיצוני המכיל (מ"מ): 140 NaCl, KCl 3, 2 CaCl 2, 4 MgCl 2, 5 HEPES, 10 סוכרוז, 2 NaOH (pH 7.2). הפתרון מכיל תיקון (מ"מ): 140-K-Acetate, 2 MgCl 2, 0.1 CaCl2, 10 HEPES, 1.1 EGTA, 2 Na2-ATP, ~ 6 KOH (pH 7.2). Voltage-clamp הקלטות מתקבלות הפוטנציאלים החזקת mV -60 ב 18 ° C. אופיינית הפוטנציאלים מנוחה מקוריים הם בטווח של mV -45 ל -65 (-52.9 ± 7.5 mV, ממוצע ± סטיית תקן, n = 78).
  4. מבחני זמין לחשוף מתח מגודרת זרמים יוניים (ביינס בייט, 1998), פוטנציאל פעולה חוזרת ונשנית, synaptically בתיווך הפעילות אגוניסט-מגודרת תגובות (ביינס et al., 2001). הקלט Synaptic המנוע נוירונים נרשם בצורת שני מהיר AP בתיווך זרמים מהר סינפטיים מעוררים (ESCs), וכן פרקים תקופתיות, מתמשכת (עד 1 משך שניות) של קלט מעוררים המתרחשים מספר פעמים או יותר לדקה (ביינס ואח' . 1999; ביינס et al, 2001)..
  5. סומה Cell להגיב להחיל iontophoretically אצטילכולין (ACH) ו GABA מעכבות את המשדר (ביינס בייט, 1998;. פת'רסטון et al 2005). אח יכול להיות מיושם על iontophoretically סומה העצבית באמצעות microelectrode חדה המכיל אח 100mm ב DH 2 0, ב-pH 4-5 לטובת iontophoresis אגוניסט על ידי זרם חיובי.

נציג תוצאות

שריר האורך הגחון 6 הוא מגזרים A2-A3 היא היעד הכי מנוצל בדרך כלל הקלטה (Broadie ו בייט, 1993a-d; הריסון et al 1994;. סוויני באל 1995;. Renden et al 2001;. הואנג et al 2006. Mohrmann et al. 2008). בעובר בוגר שזה עתה בקעו first הזחל instar (20-21 שעות AEL במהירות של 25 ° C הבקיעה =), 6 תאים כל שריר קיבול הוא בדרך כלל 25-30 pF, ואת ההתנגדויות קלט 20-40 MΩ, משתנה עם הגיל ההתפתחותי. מקסימלי NMJ מגוון זרמים סינפטיים מעשרות picoamps (13-14 שעות AEL) ל 1-2nA (20-21 שעות AEL), גדל במהירות כפונקציה של גיל. מדידה ישירה של גלוטמט, מגודרת זרמים תשואה התגובות מקסימלי של מאות picoamps (13-14 שעות AEL) ל 1.5-4nA קצר לפני הבקיעה. התנגדות סדרת טעויות (סדרה הכוללת הנוכחית התנגדות X) הם בדרך כלל <5 mV אבל,, לפני הבקיעה עוברים בוגרת, עשוי להיות גבוה כמו 10 + mV ובכך התנגדות פיצוי סדרה מומלץ. שרירי עובריים בקוטר ממוצע של 10-30 מיקרומטר, ואת האורך הממוצע של 40-80 מיקרומטר, מופיעים להראות אידיאלי כמעט מהדק פרמטרים במרחב. מהדק Cell זמן קבועים (R תא סדרה XC) פחות 0.25 ממוצע msec.

בעובר בוגרת הזחל שזה עתה בקעו, האוכלוסייה הגב הנוירון המוטורי כבר כפוף ההקלטה מוגבל יותר. הקלטות סומה העצבית לחשוף קיבול התא כולו בטווח של 1.8-2.5 pF (pF 2.0 בממוצע), התנגדות סדרה של 40-60 MΩ והתנגדות קלט של ~ 5 GΩ (ביינס בייט, 1998; פת'רסטון et al 2005). תאים אלה בבירור לגדול בגודל והמורכבות במהלך ההבשלה עובריים, וצמיחה זו תימשך לאורך כל התפתחות הזחל. ב instars שלישי, קיבול התא כולו הוא 17-20 pF, התנגדות הסדרה 25-37 MΩ והתנגדות ממוצעים קלט ~ 900 MΩ (Rohrbough ו Broadie, 2002; ריצ'רד ביינס, תקשורת אישית). Conductances יונית להגדיל ברחבי פיתוח, אך צפיפות זרם (רש"פ / PF) נשארת קבועה להפליא. בשנת עוברים בוגרת, זרמים סינפטיים הממוצע 75-100pA ב משרעת, עם שני אירועים מהיר ESC וזרמים ממושך ממוצע ~ 500 msec (ביינס בייט, 1998; פת'רסטון et al 2005). בשנת עוברי, האירועים הללו ספגו בממוצע 3-5 דקות, גוברת ~ 20 דקות לכל ב instar הראשון (ריצ'רד ביינס, תקשורת אישית). ראוי לציין, כי המורכבות מורפולוגיים תכונות הממברנה של תסיסנית נוירונים עושה את זה כמעט בלתי אפשרי מתח כראוי מהדק הרבה של התא מעבר סומה. אחת ולכן צריך לפרש הקלטות בזהירות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הקלטה אלקטרו מעוברים תסיסנית דורש מניפולציה דיסקציה ידנית. הבריאות של התכשיר, ואיכות הסוגר של הקלטות, תלוי על אחד להיות מסוגל במהירות בצורה מסודרת להכין את הרקמות עובריים שביר הקלטה, ולאחר מכן לבצע את הניסוי. הניסויים צריכים להיות בקיאים בשני חתכים עובריים מהדק electrophysiology תיקון לפני שתנסה להתמודד בעת ובעונה אחת.

הקלטות ניתן לעשות זאת באחת הגרסאות של כמה "שונה תקן" או "haemolymph דמוי" (HL) salines. ההבדלים העיקריים בין שני מעמדות אלה הם מלוחים 1) Na + ריכוז (120-135 מ"מ סטנדרטי לעומת 70 מ"מ HL) ו 2) Mg 2 + ריכוז (4 מ"מ סטנדרטי לעומת 20 מ"מ HL). היתרון העיקרי של ריכוז גבוה + Na בפתרון הסטנדרטי הוא כדי להקל על הפעולה פוטנציאל התפשטות, ולכן השמירה על השידור, בדוגמת נורמלי הסינפטי. Salines HL לדכא פעולה פוטנציאל בשידור סינפטי בתיווך. ההבדל Mg 2 +, אשר חוסם מתח מגודרת ערוצי סידן, משנה את האמפליטודה של השידור הסינפטי ו מסיט את Ca 2 + תלות כלפי מעלה בטווח של salines HL (סטיוארט et al. 1994). HL salines ולכן להראות הרבה יותר נמוך אמפליטודות בשידור סינפטי על נתון [Ca 2 +]. בקרה קפדנית של osmolarity מבטלת vacuolation הסלולר salines שניהם, מורפולוגיה מופיעה במידה שווה נשמר היטב או מלוחים. מאז מלוחים לא משכפל haemolymph בפועל, הבחירה של תמיסת מלח צריכה לשקף את הצרכים של השאלה הנחקרת.

ישנם מספר קווים מנחים חשובים על מנת למקסם את ההצלחה של הקלטות עובריים. ראשית, היכולת בהצלחה טופס חותמות gigaohm על שריר עובריים פוחתת עם הגיל ההתפתחותי. זה עשוי בעיקר בשל התפתחות של קרום במרתף המקיפים את השרירים התבגרות. כדי לנטרל את זה, כבר טיפול collagenase (1-2 דקות) נדרשת. עם זאת, יש להקפיד כי הטיפול התארך האנזימטית במהרה הפשרה מצורף שריר לקיר הגוף, והוא יכול בקלות להוביל ניתוק השריר. אחת שלטון מצאנו יעיל היא להגביל את הטיפול אנזים 50% ~ הזמן שגורם ניתוק שריר לזיהוי. שנית, חשוב כי עצב יש להתאים חזק האלקטרודה יניקה לגירוי נאותה; רופף מדי גירוי נכשל, חזק מדי, לא ניתן לעורר סעיף נאותה של העצב. מניסיוננו, זה בהחלט המגבלה הגדולה ביותר להקלטה NMJ מוצלח. קוטר מתאים האלקטרודה יניקה צריכה להיקבע באופן אמפירי, אך כל מאמץ צריך להיעשות כדי לשמור על אלקטרודה לגירוי טוב, אשר יכול בקלות לשמש למשך יום שלם של הקלטה. שלישית, עבור יישומים הנוירוטרנסמיטר סמים מוצלח NMJ, חשוב להכיר את מיקום הסינפסה. עם ניסיון, קצות סטריאוטיפית יכול בקלות למצוא עם אופטיקה DIC. עבור המתחיל, מסופי העצב העובר יכול להתגלות עם קרום permeant צבעי ניאון המיטוכונדריה, כגון Rhodamine 123 או 4-Di-2-ASP (Yoshikami ו אוקון, 1984; Broadie ו בייט, 1993a). גזור העובר חשוף פשוט לצבוע את הצבע (5 מ"מ, 5 דקות) ואת עודף שוטף עם מוסר כמה מלוחים. הכנה נתפסת אז עם קובץ מצורף עלית פלואורסצנציה ומסננים המתאימים. גישות דומות יכולים לנצל בונה GFP מהונדס לציון סינפסה עובריים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

KB הוא נתמך על ידי NIH מענק GM54544.

References

  1. Aravamudan, B., Fergestad, T., Davis, W. S., Rodesch, C. K., Broadie, K. Drosophila UNC-13 is essential for synaptic transmission. Nat. Neurosci. 2, 965-971 (1999).
  2. Auld, V. J., Fetter, R. D., Broadie, K., Goodman, C. S. Gliotactin a novel transmembrane protein on peripheral glia, is required to form the blood-nerve barrier in Drosophila. Cell. 81, 757-767 (1995).
  3. Baines, R. A., Bate, M. Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo. J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).
  4. Baines, R. A., Robinson, S. G., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Postsynaptic expression of tetanus toxin light chain blocks synaptogenesis in Drosophila. Curr. Biol. 9, 1267-1270 (1999).
  5. Baines, R. A., Uhler, J. P., Thompson, A., Sweeney, S. T., Bate, M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J. Neurosci. 21, 1523-1531 (2001).
  6. Bate, M. The embryonic development of the larval muscles in Drosophila. Development. 110, 791-804 (1990).
  7. Bate, M., Martinez Arias, A. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. Vol. I, II (1993).
  8. Baumgartner, S., JT, L. ittleton, Broadie, K., MA, B. hat, Harbecke, R., JA, L. engyel, Chiquet-Ehrismann, R., Prokop, A., Bellen, H. J. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87, 1059-1068 (1996).
  9. AH, B. rand Perrimon N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  10. Brand, A. GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system. Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).
  11. Broadie, K. Electrophysiological Approaches to the Neuromusculature. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 273-296 (2000).
  12. Broadie, K., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 144-166 (1993a).
  13. Broadie, K., Bate, M. Development of larval muscle properties in the embryonic myotubes of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 167-180 (1993b).
  14. Broadie, K., Bate, M. Activity-dependent development of the neuromuscular synapse during Drosophila embryogenesis. Neuron. 11, 607-619 (1993c).
  15. Broadie, K., Bate, M. Synaptogenesis in the Drosophila embryo: innervation directs receptor synthesis and localization. Nature. 361, 350-353 (1993d).
  16. Broadie, K., Bellen, H. J., DiAntonio, A., Littleton, J. T., Schwarz, T. L. The absence of Synaptotagmin disrupts excitation-secretion coupling during synaptic transmission. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10727-10731 (1994).
  17. Broadie, K., Prokop, A., Bellen, H. J., O'Kane, C. J., Schulze, K. L., Sweeney, S. T. Syntaxin and Synaptobrevin function downstream of vesicle docking in Drosophila. Neuron. 15, 663-673 (1995).
  18. Broadie, K., Rushton, E., Skoulakis, E. C. M., Davis, R. L. eonardo a 14-3-3 protein involved in learning, regulates presynaptic function. Neuron. 19, 391-402 (1997).
  19. Broadie, K., Skaer, H., Bate, M. Whole-embryo culture of Drosophila: development of embryonic tissues in vitro. Roux's Arch. Develop. Biol. 201, 364-375 (1992).
  20. Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin. (1985).
  21. Deitcher, D. L., Ueda, A., Stewart, B. A., Burgess, R. W., Kidokoro, Y., Schwartz, T. L. Distinct requirements for evoked and spontaneous release of neurotransmitter are revealed by mutations in the Drosophila gene neuronal-synaptobrevin. J. Neurosci. 18, 2028-2039 (1998).
  22. Featherstone, D. E., Broadie, K. Surprises from Drosophila: genetic mechanisms of synaptic development and plasticity. Brain Res. Bull. 53, 501-511 (2000).
  23. Featherstone, D. E., Rushton, E. M., Hilderbrand-Chae, M., Phillips, A. M., Jackson, F. R., Broadie, K. Presynaptic glutamic acid decarboxylase is required for induction of the postsynaptic receptor field at a glutamatergic synapse. Neuron. 27, 71-84 (2000).
  24. Featherstone, D. E., Davis, W. S., Dubreuil, R. R., Broadie, K. Drosophila alpha- and beta-spectrin mutations disrupt presynaptic neurotransmitter release. J Neurosci. 21, 4215-4224 (2001).
  25. Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release. Nat Neurosci. 5, 141-146 (2002).
  26. Featherstone, D. E., Rushton, E., Rohrbough, J., Liebl, F., Karr, J., Sheng, Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. An essential Drosophila glutamate receptor subunit that functions in both central neuropil and neuromuscular junction. J. Neurosci. 25, 3199-3208 (2005).
  27. Fergestad, T., Davis, W. S., Broadie, K. The stoned proteins regulate synaptic vesicle recycling in the presynaptic terminal. J Neurosci. 19, 5847-5860 (1999).
  28. Fergestad, T., Wu, M. N., Schulze, K. L., Lloyd, T. E., Bellen, H. J., Broadie, K. Targeted mutations in the syntaxin H3 domain specifically disrupt SNARE complex function in synaptic transmission. J Neurosci. 21, 9142-9150 (2001).
  29. Fergestad, T., Broadie, K. Interaction of stoned and synaptotagmin in synaptic vesicle endocytosis. J Neurosci. 21, 1218-1227 (2001).
  30. Goodman, C. S., Doe, C. Q. Embryonic Development of the Drosophila Central Nervous System. In The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 1131-1206 (1993).
  31. Harrison, S. D., Broadie, K., Goor, J. vande, Rubin, G. M. Mutations in the Drosophila Rop gene suggest a function in general secretion and synaptic transmission. Neuron. 13, 555-566 (1994).
  32. Huang, F. D., Woodruff, E., Mohrmann, R., Broadie, K. Rolling blackout is required for synaptic vesicle exocytosis. J. Neurosci. 26, 2369-2379 (2006).
  33. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
  34. Jan, L. Y., Jan, Y. N. L-glutamate as an excitatory transmitter at the Drosophila larval neuromuscular junction. J. Physiol. 262, 215-236 (1976b).
  35. Kidokoro, Y., Nishikawa, K. I. Miniature endplate currents at the newly formed neuromuscular junction in Drosophila embryos and larvae. Neuroscience Research. 19, 143-154 (1994).
  36. Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. J. Neurosci. 17, 9642-9655 (1997).
  37. Mohrmann, R., Matthies, H. J., Woodruff III, E., Broadie, K. Stoned B mediates sorting of integral synaptic vesicle proteins. Neuroscience. 153, 1048-1063 (2008).
  38. Nishikawa, K. I., Kidokoro, Y. Junctional and extrajunctional glutamate receptor channels in Drosophila embryos and larvae. J. Neurosci. 15, 7905-7915 (1995).
  39. Renden, R., Berwin, B., Davis, W., Ann, K., Chin, C. T., Kreber, R., Ganetzky, B., Martin, T. F., Broadie, K. Drosophila CAPS is an essential gene that regulates dense-core vesicle release and synaptic vesicle fusion. Neuron. 31, 421-437 (2001).
  40. Rohrbough, J., Broadie, K. Electrophysiological Analysis of Synaptic Transmission in Central Neurons of Drosophila Larvae. J. Neurophysiol. 88, 847-860 (2002).
  41. Rohrbough, J., Rushton, E., Palanker, L., Woodruff, E., Matthies, H. J., Acharya, U., Acharya, J. K., Broadie, K. Ceramidase regulates synaptic vesicle exocytosis and trafficking. J. Neurosci. 24, 7789-7803 (2004).
  42. Rohrbough, J., Rushton, E., Woodruff, E. 3rd, Fergestad, T., Vigneswaran, K., Broadie, K. Presynaptic establishment of the synaptic cleft extracellular matrix is required for postsynaptic differentiation. Genes Dev. 21, 2607-2628 (2007).
  43. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J. Comp. Physiol.. A175, 179-191 (1994).
  44. Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14, 341-351 (1995).
  45. Tsunoda, S., Salkoff, L. Genetic analysis of Drosophila neurons: Shal, Shaw, and Shab encode most embryonic potassium currents. J. Neurosci. 15, 1741-1754 (1995).
  46. Ueda, A., Kidokoro, Y. Longitudinal body wall muscles are electrically coupled across the segmental boundary in the third instar larva of Drosophila melanogaster. Invertebrate Neuroscience. 1, 315-322 (1996).
  47. Wu, C. F., Haugland, F. N. Voltage clamp analysis of membrane currents in larval muscle fibers of Drosophila. J. Neurosci. 5, 2626-2640 (1985).
  48. Yan, Y., Broadie, K. In vivo assay of presynaptic microtubule cytoskeleton dynamics in Drosophila. J Neurosci Methods. 162, 198-205 (2007).
  49. Yoshikami, D., Okun, L. Staining of living presynaptic nerve terminals with selective fluorescent dyes. Nature. 310, 53-56 (1984).
  50. Zagotta, W. N., Brainard, M. S., Aldrich, R. W. Single-channel analysis of four distinct classes of potassium channels in Drosophila muscle. J. Neurosci. 8, 4765-4779 (1988).
  51. Zhang, Y. Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. A living synaptic vesicle marker: synaptotagmin-GFP. Genesis. 34, 142-145 (2002).

Tags

Neuroscience גיליון 27 תסיסנית עובר כל תא תיקון-clamp שריר עצב neuromuscular צומת סינפסה
הקלטה של ​​אלקטרו<em> תסיסנית</em> עובריים
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Chen, K., Featherstone, D. E.,… More

Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo. J. Vis. Exp. (27), e1348, doi:10.3791/1348 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter