Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

에 Electrophysiological 녹음 Drosophila 엠브료

Published: May 21, 2009 doi: 10.3791/1348
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Biological Sciences, University of Illinois, 2Department of Biological Sciences, Vanderbilt University

Summary

Electrophysiological 녹음에서

Abstract

Drosophila는 배아 발달과 기능 모두의 신경 과학 연구를위한 최고의 유전자 모델입니다. 전통적으로,이 필드는 주로 독립적인 역사 및 과학 사회와 서로 꽤을 분리하고 있습니다. 그러나 이러한 일반적으로 서로 다른 분야 사이의 인터페이스는 기능 전기적 신호 특성과 신경 회로 형성의 마지막 단계에서 기능성 화학 시냅스의 분화 취득을 기본 발달 프로그램입니다. 이 인터페이스는 조사를위한 중요한 지역입니다. Drosophila에서 기능의 개발이 단계는 embryogenesis의 마지막 세번째 동안 <8시간 기간 (25 ° C에서)하는 동안 발생합니다. 이렇게 늦게 발달 기간 동안 힘든, 스며들지 표피 표피의 증착에 수사 때문에하는 어려운 여겨졌다. 획기적인 사전은 로컬 말기 태아의 제어 절개를 사용하는 표피에 적용할 수있는 물 polymerizing 수술 접착제의 적용되었다. 지느러미 세로 절개로 배아가 실험 조사하기 위해 복부 신경 코드 및 신체 벽면 근육을 노출, 평면 마련하실 수 있습니다. 전체 세포 패치 - 클램프 기법은 다음 개별적으로 - 식별 뉴런과 체세포 근육에서 기록을 채용하실 수 있습니다. 이러한 녹음 구성 이온 전류와 뉴런과 근육 모두에서 행동 가능성이 전파의 모양과 성숙을 추적하는 데 사용되었습니다. 이러한 전기적 특성에 영향을 미치는 유전자 돌연변이 이온 채널과 관련된 신호 단지의 분자 조성을 공개하고, 기능 분화의 분자 메커니즘의 탐사를 시작 특징되었습니다. 특히 초점은 중추 신경계와 주변 모두에 시냅스 연결의 조립을했습니다. glutamatergic 신경근육학 교차점 (NMJ)는 광학 이미징 및 electrophysiological 녹음의 조합에 가장 액세스할 수 있습니다. 유리 흡입 전극은 전압 - 고정되어 근육에서 만들어진 흥분성의 접합 전류 (EJC) 기록과, 말초 신경을 자극하는 데 사용됩니다. 이 녹음 구성 버렸네의 기능 분화를 차트와 presynaptic 글루 탐 산염 방출 특성의 모양과 성숙을 추적하는 데 사용되었습니다. 또한, postsynaptic 속성은 글루 탐 산염 수용체 필드의 모양과 성숙을 측정하기 위해 근육의 표면에 직접 글루 탐 산염의 iontophoretic 또는 압력 응용 프로그램을 통해 독립적으로 assayed 수 있습니다. 따라서, 모두 사전과 postsynaptic 요소는 배아 synaptogenesis 동안 별도로 또는 함께 모니터링할 수 있습니다. 이 제도는 크게 배아 버렸네 형성에 악영향을하고, 따라서 버렸네 연결과 기능 시냅스 신호 속성의 사양과 차별을 규제하는 분자 메커니즘을 밝혀 유전자 돌연변이를 분리하고 특성화하는 데 사용되었습니다.

Protocol

1 부 : 장비 및 소모품

  1. Drosophila의 배아에서 Electrophysiological 녹음 먼저 다른 조브 동영상에서 설명하는 배아 절개 기법에 능력을 필요로합니다.
  2. Drosophila의 배아에서 Electrophysiological 녹화는 표준 패치 클램프 녹음 구성을 활용합니다. 다른 많은 준비에 적합한 패치 클램프 녹음 장비 및 소프트웨어는 또한 Drosophila의 배아에서 녹음에 적합합니다. Drosophila의 배아가 해부하는 동안 커버 슬립에 붙어 있기 때문에, 녹음 챔버 커버 전표를 수락해야합니다. 그것이 coverslip에 탑재되는 준비와 방법의 두께는 훌륭한 DIC 광학과 긴 작동 거리 렌즈와 수직 현미경이 필요합니다.
  3. 목욕 솔루션의 두 종류가 electrophysiological 기록에 사용되며 1) "표준"(1 월 및 월, 1976a) 또는 "수정된 표준"(Broadie, 2000) 살린스을 일반적으로 다른 무척추 동물 시스템에서 레코딩에 사용되는 솔루션을 기반으로하고, 2) "haemolymph처럼"(HL) 살린스 (스튜어트 외 1994), 표준 호수와 Drosophila의 haemolymph에서 측정한 이온 농도 사이의 타협. 그것은 이러한 살린스 중 아무도 정확하게 (Broadie, 2000) 녹음 불리한하는 haemolymph에서 측정한 이온 농도를 모방 없다는 것을 주목하여야한다. 표준 호수가 (MM)를 포함하고 : 135 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl 2, 1.8 CaCl2, 72 자당, 5 TES, 산도 7.2.

2 부 : 녹음 구성

  1. 생리 실험, 해부 배아 준비는 작은 플렉시 글라스 기록 챔버에 배치됩니다 (<0.5 ML)과 미분 간섭 대비 (Nomarski) 광학 40 - 100X 긴 작동 거리가 장착되어 수직 복합 현미경으로 전송된 빛을 볼 ( 일반적으로 40X) 물 침지 목표 (Broadie 및 베이트, 1993a). 녹음이 일반적으로 높은 온도에서 증가하는 어려움과 함께, (16-22 ° C) 실내 온도보다 낮은 만들어집니다 (22 + ° C). 우리는 방을 냉각보다는 preapartion을 냉각하여 이것을 얻을 수 있습니다.
  2. 패치 pipettes는 섬유 가득한 안경 다양한 (예 : borosilicate 유리, 1mm 외경)에서 가져온 수 있으며 도움말 5-10 MΩ 최종 resistances에 불이 - 연마해야합니다. 염화물 - 실버 접지 와이어는 욕조에 배치됩니다. 신호는 20-10 Hz에서에서 8 폴 베셀 필터와 필터, 그리고 중 온라인 샘플 이상의 분석을 위해 디지털로 저장된 패치 - 클램프 앰프 (예 : Axopatch - 1D, 액슨 악기)를 사용 증폭됩니다.
  3. 기존 패치 - 클램프 녹음이 대부분 18 ° 만들어진 섬유 가득한 borosilicate 유리에서 가져온 패치 pipettes와 C (~ 1 μm의 ID와 광택 팁 열). Broadie 외, 1997,,.. Fergestad 외, 1999; 피더 외 현재 기록은 전압 - 클램프 (-80 MV 표준 개최 후보 -60) (Broadie 및 베이트, 1993a - D에서 확인된 multinucleate 근육 섬유에서 만들어진 ., 2000). 패치 피펫 솔루션이 포함되어 있습니다 (MM)을 : 120 KCl, 20 코, 4 MgCl 2, CaCl 0.25 2, 5 EGTA, pH를 7.2에서 버퍼 4 나 2 ATP 36 자당, 5 TES. 녹화 전극은 다시 채워진 있습니다.

제 3 부 : 근육 녹음

  1. 원칙적으로 모든 배아 근육이 준비에서 기록될 수 있습니다. 실제로, 대부분의 기록은 내부 - 대부분의 근육 계층 (; Broadie 및 베이트, 1993a - C 베이트, 1990)의 대형 복부 세로 근육에 집중하고 있습니다. 기록은 또한이 근육 계층의 지느러미와 측면 근육 (; 올드 외 1995;. 니시 카와와 Kidokoro, 1995;. 알에 바움가트너 1996 Kidokoro와 니시 카와, 1994)에서 만든되었습니다. 그러나, 대부분의 실험 네 세로, 복부 근육의 그룹 (6,7,12,13)​​, 앞쪽에 복부 (A2 - A3) 특히 근육 6 중​​점을두고 있습니다.
  2. 대한 효소 처리 전에 젊은 배아 (<16 시간의 AEL)에 근육 녹음에 필요하지 않습니다. 그러나, 근육 칼집은 나중에 배아의 발달 (> 16 시간 AEL)와 사전 패치 레코딩에 collagenase (collagenase 종류 IV, 1 이가의 양이온이없는 호수에서 MG / ML, RT에서 0.5-2 분)와 함께 제거해야합니다. 효소 처리에 따라, 근육에 씰 resistances은 일반적으로> 일아르 GΩ.
  3. 패치 - 클램프 녹음 표준 기술의 번호를 사용하여 배아 근육에서 만들 수 있습니다 (; Broadie 외 1994, 1995, 1997,. Broadie 및 베이트 1993a - C 니시 카와와 Kidokoro, 1995). 표준 패치 - 클램프 변화는 - 세포에 연결된, 내부 출력, 외부 출력 - 근육 또는 근육 격리 막 패치에서 단일 채널의 활동을 기록하기 위해 고용 수 있습니다. 단일 글루 탐 산염 수용체 채널 활동 (-60 뮤직 비디오에서 ~ 12 PA)는 일반적으로 전체 셀 모드에서 기록된 자연 흥분성의 접합 전류 (sEJCs)의 전도 단계에서 관찰할 수 있습니다.
  4. 대부분의 기록은 전체 세포 녹화 설정에서 이루어집니다uration는 약간의 흡입 또는 전기 "버즈"로 세포에 연결된 상태에서 쉽게 달성했습니다. 근육은 전압 클램프의 중 (-60에 -80 MV의 전형적인 개최 가능성) 또는 전류 클램프 구성에서 녹음하실 수 있습니다. 젊은 배아 (<13 시간 AEL)에서 근육이 효과적 때문에 배아 myotubes (Broadie 및 베이트, 1993a) 사이에 광범위한 결합하는 전압 - 고정되어 수 없으며 이것은 (14 + AEL 시간) 발달 단계 (우에다 나중에 동안 일반적으로 문제가되지 않습니다 그리고 Kidokoro, 1996).
  5. Nystatin - 다공 패치 - 클램프 녹음 표준 전체 세포 기술 (Broadie 및 베이트, 1993a)과 획득 기록을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 천공 솔루션은 다음과 같이 구성되어 있습니다 : 10 MG의 pluronic F - 127 (분자 프로브 P - 1572) 20 ML DMSO에 용해되며, 10 MG의 Nystatin은 주식을하기 위해이 솔루션에서 해산. 주식 100 μl는 녹음 솔루션을 만드는 5 ML 필터링 피펫 솔루션에 추가됩니다. 전체 셀 전류는 일반적으로 인감 형성 이후에 <3 분을 얻을 수 있습니다. 직렬 저항은 현저하게 대부분의 경우에 증가하고 전지 (Broadie 및 베이트, 1993a) 증가 누설 전류를 개발할 수 있습니다.
  6. 현재 안으로 칼슘 (I CA) : 성숙 배아에서 전체 셀 전압 - 문이 전류는 (그리고 애벌레) 근육 다섯 유수의 구성 요소 (.,, Zagotta 외 1,988 Broadie와 베이트, 1993b 우와 Haugland, 1985)으로 구성되어 있습니다 두 빠르고 운영을 중지시키지 전류, 전압 - 게이 티드 (I)과 칼슘 의존 (I CF)를 포함한 4 개의 외부 칼륨 전류 (쓰노다 및 Salkoff, 1995), 두 개의 지연이 아닌 운영을 중지시키지 전류, 전압 - 게이 티드 (I K)과 칼슘 의존 (I CS). 이온 치환 실험은 전압 클램프 동안 전체 세포 반응 (Broadie 및 베이트, 1993b)에서 이러한 전류를 해부하다하는 데 사용할 수 있습니다.

4 부 : 신경근육학 융티온 자극 및 녹음

  1. NMJ의 자극의 가장 일반적이고 신뢰할 수있는 방법은 segmental 주변 신경에 유리 흡입 전극을 사용합니다. 흡입 전극은 섬유 가득한 전극 유리 (1-1.5 μm의 외경)의 다양한에서 가져온 수 있으며, 원하는 구성 (~ 5 μm의 내경)을 달성하기 위해 불을 연마해야합니다. 해당 segmental 모터 신경의 작은 세그먼트 (<50 μm의)는 단단히 밀봉을 형성 부드러운 흡입으로 피펫으로 그려진 것입니다.
  2. 그것은 CNS 출구 지점 근처 신경의 루프에서 그림으로 그대로 신경을 자극하는 것이 일반적입니다. 이러한 접근 방식은 그대로 준비 쉽게 자극을 허용하지만, 자발적인 CNS - evoked 활동이 적용 자극 패러다임에 겹쳐 발생할 수있는 단점이 있습니다. 대안 컷 모터 신경을 자극하는 것입니다. CNS 제거하면이 절차는 신경을 스트레칭하는 경향이 손상의 원인이 될 수 있지만 이것은 형성될 수 있습니다. 배짱도 날카로운 유리 microelectrode가 얽혀있지만,이 절차는 지루하고 어렵다 수 있습니다. 이것은 레코드가 손상 준비로 만든 것이 좋습니다.
  3. 자극은 패러다임의 다양한 적용할 수 있습니다. 간략한 자극 (0.2-1 밀리초)은 최고의 작품과 자극의 강도 (보통 1-5 V) 흡입 구성에 따라 달라집니다 그리고 실험적으로 각 셀에 대해 결정되어야합니다. 모터 신경의 Suprathreshold의 자극이 가장 약간 위의 자극 강도 (1-2 볼트) 임계값을 설정하여 달성됩니다. 위에서 설명한대로 Evoked NMJ 응답은 패치 - 고정되어 근육에서 기록됩니다. 충격 유물은 크게 격리 가상 접지를 사용하여 감소 수 있습니다.
  4. 표준 흡입 전극 신경 자극에 덜 안정적인 대안은 중추 신경계 (니시 카와와 Kidokoro, 1995)의 직접적인 자극이다. 3-4 M KCl (또는 KAc)으로 가득 microelectrode은 복부 신경절과 강도 ~ 2 microamp와 ~ 기간 2 밀리초가 전달됩니다 (Dietcher 외 있습니다. 1998)의 긍정적인 펄스의 중간에 삽입됩니다. 전극 팁은 자극이 원하는되는 hemisegment 가까운 neuropil에 있어야합니다. 시냅스 전송 표준 구성에 패치 - 고정되어 근육에 기록됩니다.
  5. 배아의 NMJ은 차별화에 걸쳐 전체 세포 패치 - 클램프 녹음에 액세스할 수 있습니다. 흥분성의 junctional 전류 (EJC) 녹음 들어, 신호, (보통 1-2 kHz에서에서) 필터링, 표준 패치 - 클램프 증폭기로 기록된 아날로그 - 디지털 인터페이스를 사용하여 디지털 신호로 변환하고, 사용하는 컴퓨터 인수 해당 소프트웨어.

제 5 부 : 신경근육학 융티온 화학 약물 응용

  1. 모든 소형 청구 분자가 효과적으로 배아 NMJ (.; Fergestad 외 1999, 2001 Aravamudan 외, 1999)에 iontophoresed 수 있습니다. Iontophoretic pipettes은 부정적 또는 긍정적인 전류의 펄스를 사용하여 변수 기간 동안 응용 프로그램, 특정 구성에 뽑아하실 수 있습니다. 그것은 PU 사이의 누출을 방지하기 위해 매우 중요합니다적절한 백업과 반대 lses 전류 (Broadie 외 1993d;. 피더 외 2002, 2005,.. Rohrbough 외 2007). 현재이 백업의 크기는 피펫 구성 다를 수 있으며 실험적으로 결정되어야합니다.
  2. (Broadie 및 베이트, 1993c), 대부분의 실험은 100mM 재고 솔루션 (산도 8-9 Monosodium 소금)을 사용하여, NMJ 신경 전달 물질, L - 글루 탐 산염 (월 및 월, 1976b)로 완료되었습니다. 높은 저항 iontophoretic pipettes은 (MΩ 100-200) 글루 탐 산염 수용체 (gluR) 매핑 (Broadie 및 베이트, 1993d)에 사용하고, 낮은 저항 pipettes (MΩ 20-50)는 총 gluR 응답 (Broadie 외를 추정하는 데 사용되었습니다. 1995, 1997, 피더 외 2002, 2005;. Rohrbough 외 2007).. 누출을 방지하기 위해 현재의 작은 긍정적인 후원과 잘 부정적인 전류 (~ 10 NA) 작업의 짧은 펄스 (0.1-1 MS).
  3. 비 - 충전 및 충전 분자는 압력 방출 (Fergestad 및 Broadie, 2001.; 피더 외 2001)에 의해 적용할 수 있습니다. 응용 프로그램, 솔루션을 포함하는 압력 분출 피펫은 (<5 μm의 내경) 신경 터미널에서 (<10 μm의) 가까운 위치입니다. 꺼낼 수 솔루션은 picospritzer (5-10 PSI) 또는 기타 가압 공기 소스 (피더 외., 2002)를 사용하여 적용할 수 있습니다. 일반 목욕 ​​식염수에 - 장기 실험 동안 녹음 챔버 (볼륨 <0.5 ML)은 (0.2 ML / 초 0.1) 지속 perfused해야합니다.
  4. 대부분의 실험은 시냅스 vesicles (.; Aravamudan, 외, 1999;. Fergestad 외, 1999;.. 피더, 외, 2000, 2002 Broadie 외 1995)의 융합을 유도하는 hyperosmotic 식염수에 완료되었습니다. 다른 실험은 이러한 글루 탐 산염 수용체와 검은 과부 거미의 독이 들어있는 latroinsectotoxin (Broadie 외. 1995)에 대한 argiotoxin 636과 같은 독소와 완료되었습니다.

6 부 : 보완 신경근육학 융티온 바이탈 이미징 기법

  1. 시냅스 소포의 속도론은 형광 염료 lipophilic stryl (.; Rohrbough 외 2,004 Fergestad 및 Broadie, 2001)와 함께 모니터링할 수 있습니다. vesicles의 분포 직접 관찰하고, endocytosis와 exocytosis의 요금은 측정할 수 있습니다. 몇 가지 변종이 다른 형광 특성 (; FM4 - 64, rhodamine 같은 FM1 -​​ 43, 플루오레신 같은)로되었습니다. 원래 염색의 수정 변경 소수성 특성을 가진 제품을 굴복, 따라서 다른 워시 아웃 속도론과 함께, 훨씬 빠른 멤브레인에서 예, FM2 - 10 dissociates.
  2. stryl 염료와 배아 NMJ 레이블을 위해, 10 μm의 FM1 -​​ 43은 높은 세포외 칼륨 (50-90 ㎜) (Fergestad 및 Broadie, 2001)를 사용 1-5분에 대해 로드할 수 있습니다. 더 많은 생리적 접근은 신경 흡입 전극에 의해 자극을 통해 달성할 수 있습니다. 준비 그때 + 무료 버퍼 5 분 칼슘 2 반복 세탁 및 형광 (염색 시냅스 vesicles을 대표하는) 측정을 유지하고 있습니다. exocytosis를 측정하는 하나는 고가 칼륨이나 신경 전기 자극 중 하나를 사용하여 염료를 언로 드 수 있습니다.
  3. GFP의 변종과 함께 융합 단백질은 배아 NMJ 버렸네의 여러 가지 빛깔의 라벨을 (.; 장 외 2,002 브랜드, 1999) 수 있도록 제작되었습니다. GFP - 태그 단백질을 표현하는 많은 트렌스 제닉 일반 멤브레인 표시 (예 : mCD8 - GFP), postsynaptic 마커 (예 : 쉐이크 - GFP, GluRIIA - GFP), cytoskeletal (예 굴지 - GFP, moesin - GFP, tubulin - GFP)과 mitochondrial 포함하여 사용할 수 있습니다 마커 (예 : 시토크롬 C - GFP)과 시냅스 소포 표시 (예 : synaptobrevin - GFP, synaptotagmin - GFP;. 장 외, 2002).
  4. GFP 기자는 매우 동적이며 발달 기능이나 돌연변이 phenotypes (피더 및 Broadie, 2000)을 평가하는 데 사용할 수있는 구획 레이블을. 표백 후 형광 (FRAP)의 회복을 관찰하는 것은 최소한 애벌레 Drosophila NMJ (.; 연의와 Broadie, 2007 장 외, 2002)에서 실현 가능한 것으로 표시되었습니다. 그러나주의의 단어, 이러한 마커 중 일부는 완전히 NULL 돌연변이를 구조하지 않고도 정상 NMJ 생리를 변경할 수 있습니다.

7 부 : 중앙 모터 뉴런에서 레코딩

  1. 많은 배아 뉴런은 개별적으로 소마 위치 및 프로젝션 형태 (; 굿맨과 미상, 1993; Landgraf 외 1,997 베이트와 마르티네스 - 아리아스, 1993)을 기반으로 확인할 수 있습니다. 또한, GAL4/UAS 시스템 (브랜드 및 Perrimon, 1993)은 식별 신경 세포의 집단 (베인즈 외., 1998)를 시각화하는 GFP 발현을 타겟팅할 수 있습니다. 네 모터 뉴런 (ACC 및 RP1 - 4) 한 interneuron PCC (베인즈 외, 1998, 1999, 2001;. 최신 녹화 연구는 배아 복부 신경 코드 (VNC) 내에서 다섯 외면, 지느러미 뉴런의 그룹에 집중하고 있습니다 ; Rohrbough 및 Broadie, 2002; 피더 외 1995)..
  2. 식별 뉴런의 세포 기관은 전체 세포 패치 - 클램프 녹음 전극에 액세스할 수 있습니다. VNC neurolemma의 드레스가 처음으로 프로 테아제 (베인즈 및 베이트, 1998 한때 초점 치료로 제거되어야하며 베인즈 Et 알, 1999;. Rohrbough과 Broadie, 2002). 도설의 연결을 세포 기관은 0.5-1 % 프로 테아제 (기록 생리를 입력 XIV (시그마)를) 포함하는 큰 지름 (~ 20 μm의) 패치 피펫을 사용하여 노출됩니다. CNS의 피복 재료는 쉬스 파열 (피더 외. 1995)까지 1~2분에 대한 피펫 팁으로 흡입에 의해 그려진 것입니다. 녹음, 루시퍼 노란색 (dipotassium 소금, 1-2 MG / ML) 동안 세포의 신원을 확인하기 위해서는 세포의 위치와 형태를 시각화하기 위해 패치를 솔루션에 추가할 수 있습니다.
  3. 표준 전체 셀 전압 및 전류 클램프 녹음 (.; 피더 외, 2005 Rohrbough 및 Broadie, 2002) 만들 수 있습니다. 외부 녹음 염분이 포함되어 있습니다 (MM)을 : 140 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl 2, 4 MgCl 2, 5 HEPES, 10 자당, 2 NaOH (산도 7.2). 패치 솔루션이 포함되어 있습니다 (MM)을 : 140 K - 아세테이트, 2 MgCl 2, 0.1 CaCl2, 10 HEPES, 1.1 EGTA, 2 Na2 - ATP, ~ 6 코 (산도 7.2). 전압 클램프 녹음은 18 ° C.에서 -60 뮤직 비디오의 개최 가능성에 만들어진 일반 조정되지 않은 휴식 후보가 -45에 -65 MV의 범위에있는 (-52.9 ± 7.5 뮤직 비디오, ± SD, N = 78을 의미).
  4. 사용 가능한 assays 전압 - 게이 티드 이온 전류 (베인즈 및 베이트, 1998), 반복적인 행동 잠재력, synaptically - 중재 활동과 작용제 - 문이 반응 (베인즈 외., 2001)을 공개. 모터 뉴런을 시냅스 입력은 분당 몇 배 이상 (베인즈 외 발생하는 모두 빠른 AP - 중재 빠른 흥분성의 시냅스 전류 (ESCs) 및 흥분성의 입력 (최대 1 초 지속 시간) 지속, 정기적인 에피소드의 형식으로 기록됩니다 ., 1999; 베인즈 외, 2001)..
  5. 셀 소마는 iontophoretically 적용 아세틸콜린 (ACH)와 억제 송신기 GABA (.; 피더 외 2,005 베인즈와 베이트, 1998)에 대응. ACH는 긍정적인 현재의 작용제의 iontophoresis를 선호하는 4-5 산도에서 DH 2 0에서 100mM ACH를 포함하는 날카로운 microelectrode 통해 소마의 연결에 iontophoretically 적용할 수 있습니다.

대표 결과

해리슨 외 1994,,. 알에 스위니 1995;. Renden 외 2001;. 후앙 외 2006., 복부 세로 근육 6 A2 - A3 녹음에 가장 일반적으로 활용 대상 (Broadie 및 베이트, 1993a - D는 세그먼트입니다 Mohrmann 외. 2008). 성숙한 배아 및 새로 부화 첫번째 i​​nstar의 유충 (25 20-21 시간의 AEL ° C = 부화), 근육 6 전체 셀 커패시턴스는 일반적으로 25-30 PF이며, MΩ 입력 resistances 20-40, 발달 연령과 함께 변화.에서는 picoamps 수십 (13-14 시간 AEL)에서 1 2nA (20-21 시간 AEL)를 최대한 NMJ 시냅스 전류 범위는 빠르게 시대의 함수로 증가합니다. 글루 탐 산염 - 문이 전류의 직접 측정이 부화하기 직전 picoamps 수백 (13-14 시간 AEL) 1.5 - 4nA의 최대한의 답변을 얻을 수 있습니다. 시리즈 저항 오류 (총 전류 X 시리즈 저항)은 일반적으로 <5 뮤직 비디오지만, 성숙, 사전 부화의 배아에서 10로 높은 수 + 뮤직 비디오 때문에 직렬 저항 보상이 좋습니다. 10-30 μm의 평균 직경, 그리고 40-80 μm의 평균 길이 배아 근육은 거의 이상적인 공간 클램프 매개 변수를 표시 나타납니다. 셀 클램프 시간 상수 (R 시리즈 XC 전지) 평균 이하 0.25 밀리초.

성숙한 배아 및 새로 부화 유충에서 지느러미 모터 신경 세포의 인구는 더 제한 녹음에 따라 달라질 수 있습니다. 의 연결 소마 레코딩은 1.8-2.5 PF (2.0 PF 평균), MΩ 40-60 일련의 저항과 ~ 5 GΩ (; 피더 외 2,005 베인즈와 베이트, 1998)의 입력 저항의 범위에서 전체 셀 용량을 표시. 이러한 세포는 배아 명확하게 성숙하는 동안 크기와 복잡도에 성장하고,이 성장은 애벌레 개발 전반에 걸쳐 계속됩니다. 셋째 instars에서 전체 셀 용량은 17-20 PF는 직렬 저항 MΩ 25-37 있으며, 입력 저항 평균 ~ 900 MΩ (Rohrbough 및 Broadie, 2002, 리차드 베인즈, 개인 통신). 이온 conductances 개발 전반에 걸쳐 증가하지만, 전류 밀도 (PA / PF)은 매우 상수이다. 성숙 태아에는 빠른 ESC 행사 ~ 500 밀리초를 (베인즈 및 베이트, 1998; 피더 외 2005) 평균 연장 전류 모두 진폭의 75 100pA 평균 시냅스 전류. 배아에서 이러한 지속적인 이벤트를 분 평균 3-5은 첫째 instar (리차드 베인즈, 개인 통신)에 분 당 ~ 20 증가합니다. 형태학의 복잡 성과 Drosophila 뉴런의 막 특성이 거의 불가능 많이 소마 넘어 세포의를 제대로 전압 클램프 수 있습니다합니다. 하나는 따라서 신경을 써서 녹화를 해석한다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Drosophila의 배아에서 Electrophysiological 녹음 수동 조작과 절개를 필요로합니다. 준비의 건강과 레코딩의 결과의 품질, 신속하고 깔끔하게 레코딩을위한 연약한 배아 조직을 준비하는 수있는 하나 따라 다음 실험을 실행합니다. 경험은 한번에 모두를 해결하기 위해 시도하기 전에 배아 해부 및 패치 클램프 전기 생리학 모두 실력해야합니다.

녹음은 "수정된 표준"또는 "haemolymph처럼"(HL) 살린스 여러 변종 중 하나에 수행할 수 있습니다. 이 두 호수 클래스 사이의 주요 차이점 1 있음) 나 + 농도 (70 MM HL 대 120-135 MM 표준) 및 2) MG 2 + 농도 (4 MM 표준 대 20 MM HL). 표준 솔루션에 높은 나 + 농도의 주요한 이점은 액션 잠재적인 전파하고, 따라서 정상적인, 꽃무늬 시냅스 전달의 유지 보수를 용이하게하는 것입니다. HL 살린스 행동 - 잠재적인 중재 신경 전달을 억제. 전압 - 문이 칼슘 채널을 차단 +, MG 2의 차이는 시냅스 전달의 진폭을 바꿀지도 모르겠어과 HL 살린스 (스튜어트 외. 1994)에서 칼슘 2 + - 의존성 범위 이상을 교대. HL 따라서에서 훨씬 낮은 시냅스 전송 amplitudes을 보여주 살린스 주어진 [칼슘 2 +]. osmolarity주의 컨트롤은 모두 살린스에서 세포 vacuolation을 제거하고, 형태 마찬가지로 역시 호수에 보존 나타납니다. 도 생리가 실제 haemolymph를 복제 때문에, 호수의 선택은 연구에 따라 질문의 요구를 반영해야합니다.

배아 음반의 성공을 최대화하기 위해 몇 가지 중요한 지침이 있습니다. 첫째, 성공적으로 배아 근육에 gigaohm 물개를 형성하는 능력이 발달 나이가 감소하게된다. 이것은 가능성이 주로 성숙 근육을 둘러싸고있는 지하 막의 개발에 의한 것입니다. 이것을 대항하기 위해 더 이상 collagenase 처리 (1-2 분)이 필요합니다. 이 길어 효소 치료를 신속하게 몸 벽에 근육 첨부 파일을 손상 때문에 그러나,주의 이동해야하며 쉽게 근육 분리로 이어질 수 있습니다. 우리가 효과적으로 발견 하나의 규칙은 감지 근육 부대를 일으키는 시간 ~ 50 % 효소 치료를 제한하는 것입니다. 너무 느슨한과 자극에 실패, 너무 꽉 그리고 그것은 신경의 적절한 섹션을 자극하는 것은 불가능합니다, 둘째, 그것은 신경이 적절한 자극에 대한 흡입 전극에 꼭 맞는를 가지고 매우 중요합니다. 우리의 경험에서는, 이것은 확실히 성공 NMJ 녹음에 가장 큰 단일 제한됩니다. 흡입 전극에 해당하는 직경은 경험적으로 결정되어야하지만, 모든 노력은 쉽게 녹음의 하루 동안 사용할 수있는 좋은 자극 전극을 보존하여야한다. 셋째, NMJ 성공 신경 전달 물질과 약물 어플 리케이션을위한, 그것은 버렸네 배치에 익숙해지하는 것이 중요합니다. 경험을 바탕으로, 틀에 박힌 엔딩은 쉽게 DIC 광학과 함께 찾을 수 있습니다. 초보자 들어, 배아에서 신경 터미널은 같은 Rhodamine 123 또는 4 - 디 - 2 - ASP (; Broadie 및 베이트, 1993a Yoshikami 및 Okun, 1984)로 막 - permeant 형광 mitochondrial 염료와 발표하실 수 있습니다. 해부 배아 단순히 생리 여러 세척과 함께 제거 염료 (5mM, 5 분) 및 초과 염색에 노출됩니다. 준비는 다음 에피 형광 첨부하고 적절한 필터를 볼 수 있습니다. 비슷한 접근 방식은 배아 버렸네를 표시 유전자 변형 GFP 구조를 활용할 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

킬로바이트는 NIH 부여 GM54544에 의해 지원됩니다.

References

  1. Aravamudan, B., Fergestad, T., Davis, W. S., Rodesch, C. K., Broadie, K. Drosophila UNC-13 is essential for synaptic transmission. Nat. Neurosci. 2, 965-971 (1999).
  2. Auld, V. J., Fetter, R. D., Broadie, K., Goodman, C. S. Gliotactin a novel transmembrane protein on peripheral glia, is required to form the blood-nerve barrier in Drosophila. Cell. 81, 757-767 (1995).
  3. Baines, R. A., Bate, M. Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo. J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).
  4. Baines, R. A., Robinson, S. G., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Postsynaptic expression of tetanus toxin light chain blocks synaptogenesis in Drosophila. Curr. Biol. 9, 1267-1270 (1999).
  5. Baines, R. A., Uhler, J. P., Thompson, A., Sweeney, S. T., Bate, M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J. Neurosci. 21, 1523-1531 (2001).
  6. Bate, M. The embryonic development of the larval muscles in Drosophila. Development. 110, 791-804 (1990).
  7. Bate, M., Martinez Arias, A. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. Vol. I, II (1993).
  8. Baumgartner, S., JT, L. ittleton, Broadie, K., MA, B. hat, Harbecke, R., JA, L. engyel, Chiquet-Ehrismann, R., Prokop, A., Bellen, H. J. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87, 1059-1068 (1996).
  9. AH, B. rand Perrimon N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  10. Brand, A. GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system. Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).
  11. Broadie, K. Electrophysiological Approaches to the Neuromusculature. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 273-296 (2000).
  12. Broadie, K., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 144-166 (1993a).
  13. Broadie, K., Bate, M. Development of larval muscle properties in the embryonic myotubes of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 167-180 (1993b).
  14. Broadie, K., Bate, M. Activity-dependent development of the neuromuscular synapse during Drosophila embryogenesis. Neuron. 11, 607-619 (1993c).
  15. Broadie, K., Bate, M. Synaptogenesis in the Drosophila embryo: innervation directs receptor synthesis and localization. Nature. 361, 350-353 (1993d).
  16. Broadie, K., Bellen, H. J., DiAntonio, A., Littleton, J. T., Schwarz, T. L. The absence of Synaptotagmin disrupts excitation-secretion coupling during synaptic transmission. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10727-10731 (1994).
  17. Broadie, K., Prokop, A., Bellen, H. J., O'Kane, C. J., Schulze, K. L., Sweeney, S. T. Syntaxin and Synaptobrevin function downstream of vesicle docking in Drosophila. Neuron. 15, 663-673 (1995).
  18. Broadie, K., Rushton, E., Skoulakis, E. C. M., Davis, R. L. eonardo a 14-3-3 protein involved in learning, regulates presynaptic function. Neuron. 19, 391-402 (1997).
  19. Broadie, K., Skaer, H., Bate, M. Whole-embryo culture of Drosophila: development of embryonic tissues in vitro. Roux's Arch. Develop. Biol. 201, 364-375 (1992).
  20. Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin. (1985).
  21. Deitcher, D. L., Ueda, A., Stewart, B. A., Burgess, R. W., Kidokoro, Y., Schwartz, T. L. Distinct requirements for evoked and spontaneous release of neurotransmitter are revealed by mutations in the Drosophila gene neuronal-synaptobrevin. J. Neurosci. 18, 2028-2039 (1998).
  22. Featherstone, D. E., Broadie, K. Surprises from Drosophila: genetic mechanisms of synaptic development and plasticity. Brain Res. Bull. 53, 501-511 (2000).
  23. Featherstone, D. E., Rushton, E. M., Hilderbrand-Chae, M., Phillips, A. M., Jackson, F. R., Broadie, K. Presynaptic glutamic acid decarboxylase is required for induction of the postsynaptic receptor field at a glutamatergic synapse. Neuron. 27, 71-84 (2000).
  24. Featherstone, D. E., Davis, W. S., Dubreuil, R. R., Broadie, K. Drosophila alpha- and beta-spectrin mutations disrupt presynaptic neurotransmitter release. J Neurosci. 21, 4215-4224 (2001).
  25. Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release. Nat Neurosci. 5, 141-146 (2002).
  26. Featherstone, D. E., Rushton, E., Rohrbough, J., Liebl, F., Karr, J., Sheng, Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. An essential Drosophila glutamate receptor subunit that functions in both central neuropil and neuromuscular junction. J. Neurosci. 25, 3199-3208 (2005).
  27. Fergestad, T., Davis, W. S., Broadie, K. The stoned proteins regulate synaptic vesicle recycling in the presynaptic terminal. J Neurosci. 19, 5847-5860 (1999).
  28. Fergestad, T., Wu, M. N., Schulze, K. L., Lloyd, T. E., Bellen, H. J., Broadie, K. Targeted mutations in the syntaxin H3 domain specifically disrupt SNARE complex function in synaptic transmission. J Neurosci. 21, 9142-9150 (2001).
  29. Fergestad, T., Broadie, K. Interaction of stoned and synaptotagmin in synaptic vesicle endocytosis. J Neurosci. 21, 1218-1227 (2001).
  30. Goodman, C. S., Doe, C. Q. Embryonic Development of the Drosophila Central Nervous System. In The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 1131-1206 (1993).
  31. Harrison, S. D., Broadie, K., Goor, J. vande, Rubin, G. M. Mutations in the Drosophila Rop gene suggest a function in general secretion and synaptic transmission. Neuron. 13, 555-566 (1994).
  32. Huang, F. D., Woodruff, E., Mohrmann, R., Broadie, K. Rolling blackout is required for synaptic vesicle exocytosis. J. Neurosci. 26, 2369-2379 (2006).
  33. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
  34. Jan, L. Y., Jan, Y. N. L-glutamate as an excitatory transmitter at the Drosophila larval neuromuscular junction. J. Physiol. 262, 215-236 (1976b).
  35. Kidokoro, Y., Nishikawa, K. I. Miniature endplate currents at the newly formed neuromuscular junction in Drosophila embryos and larvae. Neuroscience Research. 19, 143-154 (1994).
  36. Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. J. Neurosci. 17, 9642-9655 (1997).
  37. Mohrmann, R., Matthies, H. J., Woodruff III, E., Broadie, K. Stoned B mediates sorting of integral synaptic vesicle proteins. Neuroscience. 153, 1048-1063 (2008).
  38. Nishikawa, K. I., Kidokoro, Y. Junctional and extrajunctional glutamate receptor channels in Drosophila embryos and larvae. J. Neurosci. 15, 7905-7915 (1995).
  39. Renden, R., Berwin, B., Davis, W., Ann, K., Chin, C. T., Kreber, R., Ganetzky, B., Martin, T. F., Broadie, K. Drosophila CAPS is an essential gene that regulates dense-core vesicle release and synaptic vesicle fusion. Neuron. 31, 421-437 (2001).
  40. Rohrbough, J., Broadie, K. Electrophysiological Analysis of Synaptic Transmission in Central Neurons of Drosophila Larvae. J. Neurophysiol. 88, 847-860 (2002).
  41. Rohrbough, J., Rushton, E., Palanker, L., Woodruff, E., Matthies, H. J., Acharya, U., Acharya, J. K., Broadie, K. Ceramidase regulates synaptic vesicle exocytosis and trafficking. J. Neurosci. 24, 7789-7803 (2004).
  42. Rohrbough, J., Rushton, E., Woodruff, E. 3rd, Fergestad, T., Vigneswaran, K., Broadie, K. Presynaptic establishment of the synaptic cleft extracellular matrix is required for postsynaptic differentiation. Genes Dev. 21, 2607-2628 (2007).
  43. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J. Comp. Physiol.. A175, 179-191 (1994).
  44. Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14, 341-351 (1995).
  45. Tsunoda, S., Salkoff, L. Genetic analysis of Drosophila neurons: Shal, Shaw, and Shab encode most embryonic potassium currents. J. Neurosci. 15, 1741-1754 (1995).
  46. Ueda, A., Kidokoro, Y. Longitudinal body wall muscles are electrically coupled across the segmental boundary in the third instar larva of Drosophila melanogaster. Invertebrate Neuroscience. 1, 315-322 (1996).
  47. Wu, C. F., Haugland, F. N. Voltage clamp analysis of membrane currents in larval muscle fibers of Drosophila. J. Neurosci. 5, 2626-2640 (1985).
  48. Yan, Y., Broadie, K. In vivo assay of presynaptic microtubule cytoskeleton dynamics in Drosophila. J Neurosci Methods. 162, 198-205 (2007).
  49. Yoshikami, D., Okun, L. Staining of living presynaptic nerve terminals with selective fluorescent dyes. Nature. 310, 53-56 (1984).
  50. Zagotta, W. N., Brainard, M. S., Aldrich, R. W. Single-channel analysis of four distinct classes of potassium channels in Drosophila muscle. J. Neurosci. 8, 4765-4779 (1988).
  51. Zhang, Y. Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. A living synaptic vesicle marker: synaptotagmin-GFP. Genesis. 34, 142-145 (2002).

Tags

신경 과학 제 27 Drosophila 배 (胚)는 전체 세포 패치 - 클램프 근육 신경 신경근육학 접합 버렸네
에 Electrophysiological 녹음<em> Drosophila</em> 엠브료
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Chen, K., Featherstone, D. E.,… More

Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo. J. Vis. Exp. (27), e1348, doi:10.3791/1348 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter