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Biology

Electrophysiological रिकॉर्डिंग में ड्रोसोफिला भ्रूण

Published: May 21, 2009 doi: 10.3791/1348
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Biological Sciences, University of Illinois, 2Department of Biological Sciences, Vanderbilt University

Summary

Electrophysiological से रिकॉर्डिंग

Protocol

भाग 1: उपकरण और आपूर्ति

  1. ड्रोसोफिला के भ्रूण से electrophysiological रिकॉर्डिंग पहले भ्रूण विच्छेदन तकनीक है, जो एक और जौव वीडियो में वर्णित हैं में प्रवीणता की आवश्यकता है.
  2. ड्रोसोफिला के भ्रूण से electrophysiological रिकॉर्डिंग मानक पैच दबाना रिकॉर्डिंग विन्यास का इस्तेमाल करता है. पैच दबाना रिकॉर्डिंग उपकरण और सॉफ्टवेयर कई अन्य की तैयारी के लिए उपयुक्त भी है ड्रोसोफिला के भ्रूण से रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त है. क्योंकि ड्रोसोफिला भ्रूण विच्छेदन के दौरान एक कवर पर्ची से चिपके हैं, रिकॉर्डिंग चैम्बर कवर फिसल जाता है स्वीकार करना चाहिए. तैयारी और जिस तरह में coverslip के लिए मुहिम शुरू की है की मोटाई उत्कृष्ट डीआईसी प्रकाशिकी और एक लंबे समय तक काम दूरी लेंस के साथ एक ईमानदार माइक्रोस्कोप की आवश्यकता है.
  3. स्नान के समाधान के दो प्रकार electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए प्रयोग किया जाता हैं, 1) "मानक" (जनवरी और जनवरी, 1976a) या "संशोधित मानक" (Broadie 2000) salines, आमतौर पर अन्य invertebrate प्रणालियों में रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया समाधान पर आधारित है, और 2) (hl) "haemolymph - तरह" salines (स्टीवर्ट एट अल 1994), मानक खारा और ईओण ड्रोसोफिला haemolymph में मापा सांद्रता के बीच एक समझौता . यह नोट किया जाए कि इन salines में से कोई भी सही ईओण haemolymph में मापा सांद्रता, जो रिकॉर्डिंग के लिए प्रतिकूल हैं (Broadie 2000) की नकल करना चाहिए. मानक खारा (मिमी में) शामिल हैं: 135 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl 2, CaCl2 1.8, 72 sucrose, 5 TES, 7.2 पीएच.

भाग 2: रिकॉर्डिंग विन्यास

  1. शारीरिक प्रयोगों के लिए, dissected भ्रूण तैयारी एक छोटे plexiglass रिकॉर्डिंग कक्ष में रखा गया है (<0.5 मिलीलीटर) और एक ईमानदार यौगिक अंतर हस्तक्षेप विपरीत (Nomarski) प्रकाशिकी और एक लंबे समय से काम कर रहे 40-100X दूरी के साथ लगे खुर्दबीन के साथ प्रेषित प्रकाश में देखा ( आम तौर पर 40x) उद्देश्य जल विसर्जन (Broadie और पीटा, 1993a). रिकॉर्डिंग आमतौर पर कमरे के तापमान के नीचे बना रहे हैं (16-22 डिग्री सेल्सियस) ऊंचा तापमान पर बढ़ती कठिनाई के साथ, (22 + डिग्री सेल्सियस). हम कमरा ठंडा बजाय preapartion ठंडा करके इस लक्ष्य को हासिल है.
  2. पैच pipettes फाइबर से भरे चश्मे की एक किस्म (जैसे borosilicate ग्लास, 1 मिमी बाहरी व्यास) से निकाला जा सकता है और सुझावों 5-10 MΩ के अंतिम resistances को आग पॉलिश किया जाना चाहिए. जमीन क्लोराइड - चांदी के तार स्नान में रखा गया है. सिग्नल एक पैच दबाना प्रवर्धक (जैसे Axopatch-1D, Axon उपकरण), 2-10 हर्ट्ज पर एक 8 पोल बेसल फिल्टर के साथ फ़िल्टर्ड है, और या तो लाइन पर नमूना या बाद में विश्लेषण के लिए डिजिटल संग्रहीत का उपयोग परिलक्षित कर रहे हैं.
  3. पारंपरिक पैच दबाना रिकॉर्डिंग सबसे अक्सर 18 साल की उम्र में बना रहे हैं ° सी (~ 1 सुक्ष्ममापी आईडी युक्तियाँ पॉलिश गर्मी) के पैच फाइबर से भरे borosilicate ग्लास से खींच pipettes के साथ. Broadie एट अल, 1997;. Fergestad एट अल, 1999; फेयथेरस्टोन एट अल वर्तमान रिकॉर्ड वोल्टेज (मानक धारण -80 एम वी -60 क्षमता) क्लैंप (Broadie और पीटा, 1993a - घ में पहचान multinucleate मांसपेशी फाइबर से बना रहे हैं , 2000). पैच विंदुक समाधान (मिमी): 120 KCl, KOH 20, 4 2 MgCl, 0.25 2 CaCl, 5 EGTA, 4 ना 2 एटीपी, 36 Sucrose, और 5 TES, पीएच 7.2 पर बफर. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड वापस भर रहे हैं.

भाग 3: बलवान रिकॉर्डिंग

  1. सिद्धांत रूप में, किसी भी भ्रूण मांसपेशियों से इस तैयारी में दर्ज किया जा सकता है. अभ्यास में, सबसे रिकॉर्डिंग बड़े मांसपेशियों सबसे भीतरी परत (Broadie और पीटा, 1993a ग पीटा, 1990) में उदर अनुदैर्ध्य मांसपेशियों पर ध्यान केंद्रित किया गया है. रिकॉर्ड्स भी इस मांसपेशी परत के पृष्ठीय और पार्श्व मांसपेशियों (Auld एट अल 1995; Nishikawa और Kidokoro, 1995, अल में बॉमगार्टनर 1996 Kidokoro और Nishikawa, 1994) से बनाया गया है. हालांकि, ज्यादातर प्रयोगों चार अनुदैर्ध्य, उदर की मांसपेशियों के समूह (6,7,12,13), पूर्वकाल पेट (A2-A3) में विशेष रूप से 6 मांसपेशियों पर ध्यान केंद्रित.
  2. नहीं enzymatic उपचार युवा भ्रूण (<16 बजे AEL) में पेशी रिकॉर्डिंग के लिए पहले की आवश्यकता है. हालांकि, एक मांसपेशी म्यान बाद में भ्रूण में विकसित (AEL> 16 बजे) और (collagenase प्रकार चतुर्थ, 1 मिलीग्राम / द्विसंयोजक खारा कटियन मुक्त मिलीलीटर, आरटी पर 0.5-2 मिनट) पैच रिकॉर्डिंग से पहले collagenase के साथ हटा दिया जाना चाहिए. एंजाइम उपचार के बाद, मांसपेशियों पर मुहर resistances आम तौर पर कर रहे हैं> 1 GΩ.
  3. पैच दबाना रिकॉर्डिंग भ्रूण मानक तकनीकों का एक नंबर का उपयोग मांसपेशियों से बना जा सकता है (; Broadie एट अल 1994, 1995, 1997, Broadie और 1993a ग पीटा Nishikawa और Kidokoro, 1995). किसी भी मानक पैच दबाना रूपों - सेल संलग्न, अंदर बाहर, बाहर से बाहर - मांसपेशियों या पृथक मांसपेशियों झिल्ली पैच में एक चैनल गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए नियोजित किया जा सकता है. एकल ग्लूटामेट रिसेप्टर चैनल गतिविधि (~ 12 -60 एम वी पर पीए) आम तौर पर सहज उत्तेजक जंक्शन (sEJCs) धाराओं पूरे सेल मोड में दर्ज की गिरने चरण पर नमूदार हैं.
  4. हाल रिकॉर्डिंग पूरे सेल रिकॉर्डिंग config में किया जाता हैuration सेल संलग्न राज्य से आसानी से मामूली चूषण या एक बिजली के "चर्चा" के साथ हासिल की. मांसपेशियों वोल्टेज दबाना में या तो (-60 के लिए -80 एम वी के ठेठ धारण क्षमता) या वर्तमान दबाना विन्यास से दर्ज किया जा सकता है. युवा भ्रूण (AEL <13 बजे) में स्नायु को प्रभावी ढंग से भ्रूण myotubes (Broadie और पीटा, 1993a) के बीच व्यापक युग्मन के कारण वोल्टेज clamped नहीं किया जा सकता है, बाद में इस दौरान आम तौर पर होता है (14 + AEL बजे) विकास के चरणों (Ueda एक समस्या नहीं और Kidokoro, 1996).
  5. Nystatin छेदा रिकॉर्डिंग पैच दबाना मानक पूरे सेल तकनीक (Broadie और पीटा, 1993a) के साथ प्राप्त की रिकॉर्ड को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वेध समाधान के रूप में इस प्रकार किया जाता है: 10 मिलीग्राम pluronic एफ 127 (आणविक जांच P-१५७२) 20 मिलीलीटर DMSO में भंग है, और 10 मिलीग्राम Nystatin इस समाधान में भंग शेयर करना. शेयर के 100 μl 5 मिलीलीटर फ़िल्टर विंदुक रिकॉर्डिंग समाधान बनाने के समाधान के लिए जोड़ा जाता है. पूरे सेल धाराओं आमतौर पर मुहर गठन के बाद कर रहे हैं <3 मिनट प्राप्त है. श्रृंखला प्रतिरोध स्पष्ट रूप से ज्यादातर मामलों में वृद्धि हुई है और कोशिकाओं को एक वृद्धि रिसाव वर्तमान विकसित कर सकते हैं (Broadie और पीटा, 1993a).
  6. एक आवक वर्तमान कैल्शियम (मैं Ca): पूरे सेल परिपक्व भ्रूण में gated वोल्टेज वर्तमान (और लार्वा) मांसपेशी पाँच प्रमुख घटकों (; Zagotta एट अल 1988 Broadie और पीटा, 1993b वू और Haugland, 1985) के बना है और मैं चार जावक पोटेशियम धाराओं (Tsunoda और Salkoff, 1995) दो तेज, निष्क्रिय धाराओं, gated वोल्टेज (मैं एक) और कैल्शियम निर्भर (मैं CF) सहित, और दो ​​में देरी, गैर निष्क्रिय धाराओं, gated वोल्टेज ( ) कश्मीर और कैल्शियम पर निर्भर (मैं सीएस). आयन प्रतिस्थापन प्रयोगों वोल्टेज क्लैंप के दौरान पूरे सेल प्रतिक्रिया (Broadie और पीटा, 1993b) से इन धाराओं को काटना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

भाग 4: Neuromuscular जंक्शन उत्तेजना और रिकॉर्डिंग

  1. NMJ उत्तेजना का सबसे आम है और विश्वसनीय तरीका कमानी परिधीय तंत्रिका पर एक गिलास चूषण इलेक्ट्रोड का उपयोग करता है. सक्शन इलेक्ट्रोड फाइबर से भरे इलेक्ट्रोड ग्लास (1-1.5 सुक्ष्ममापी बाहरी व्यास) की एक किस्म से निकाला जा सकता है और आग पॉलिश करने के लिए वांछित विन्यास (~ 5 सुक्ष्ममापी भीतरी व्यास) को प्राप्त करने किया जाना चाहिए. उपयुक्त कमानी मोटर तंत्रिका के एक छोटे खंड (<50 सुक्ष्ममापी) कोमल चूषण के साथ पिपेट में तैयार की है एक तंग सील फार्म.
  2. यह आम है CNS से ​​बाहर निकलें बिंदु के पास तंत्रिका के एक पाश में ड्राइंग द्वारा बरकरार तंत्रिका उत्तेजित. इस दृष्टिकोण बरकरार तैयारी की आसान उत्तेजना की अनुमति देता है, लेकिन नुकसान यह है कि सहज गतिविधि CNS-पैदा लागू उत्तेजना प्रतिमान पर आरोपित हो सकता है. एक विकल्प के लिए कटौती मोटर तंत्रिका उत्तेजित है. यह अगर सीएनएस हटा दिया है हासिल किया जा सकता है, हालांकि इस प्रक्रिया के लिए तंत्रिका खिंचाव देता है और नुकसान का कारण बन सकता है. तंत्रिका एक तेज गिलास microelectrode के साथ भी कटौती हो सकता है, लेकिन इस प्रक्रिया थकाऊ और कठिन है. यह अनुशंसा की जाती है कि रिकॉर्ड बरकरार तैयारी से किया जा है.
  3. उत्तेजना मानदंड की एक किस्म के साथ लागू किया जा सकता है. संक्षिप्त उत्तेजना (0.2-1 मिसे) सबसे अच्छा काम करता है और उत्तेजना तीव्रता (आमतौर पर 1-5 वी) चूषण विन्यास पर निर्भर करेगा और प्रयोगात्मक प्रत्येक कक्ष के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए. मोटर तंत्रिका के Suprathreshold उत्तेजना का सबसे अच्छा प्रोत्साहन थोड़ा ऊपर ताकत दहलीज (1-2 वोल्ट) सेटिंग के द्वारा हासिल की है. पैदा NMJ प्रतिक्रियाओं पैच clamped मांसपेशियों से ऊपर वर्णित के रूप में दर्ज कर रहे हैं. सदमे विरूपण साक्ष्य को काफी हद तक एक पृथक आभासी भूमि के उपयोग के साथ कम किया जा सकता है.
  4. मानक चूषण इलेक्ट्रोड तंत्रिका उत्तेजना के लिए एक कम विश्वसनीय वैकल्पिक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (Nishikawa और Kidokoro, 1995) के प्रत्यक्ष उत्तेजना है. 3-4 एम KCl (या KAC) से भरा microelectrode वेंट्रल नाड़ीग्रन्थि और ~ तीव्रता में 2 microamp और (1998 Dietcher एट अल.) ~ अवधि में मिसे 2 वितरित कर रहे हैं सकारात्मक दालों के बीच में डाला जाता है. इलेक्ट्रोड टिप जहां उत्तेजना वांछित है hemisegment निकटतम neuropil में किया जाना चाहिए. Synaptic प्रसारण पैच-clamped मानक विन्यास में मांसपेशियों में दर्ज है.
  5. भ्रूण NMJ अपने भेदभाव भर में पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए सुलभ है. उत्तेजक junctional वर्तमान रिकॉर्डिंग (EJC) के लिए संकेत एक मानक प्रवर्धक पैच दबाना के साथ दर्ज हैं, फ़िल्टर (आमतौर पर 1-2 KHz पर), एक डिजिटल संकेत करने के लिए एक एनालॉग से डिजिटल इंटरफ़ेस का उपयोग कर परिवर्तित, और एक कंप्यूटर के साथ अधिग्रहण का उपयोग उचित सॉफ्टवेयर.

भाग 5: Neuromuscular जंक्शन रसायन और औषध अनुप्रयोग

  1. कोई छोटा सा, चार्ज अणु प्रभावी ढंग से भ्रूण NMJ (; Fergestad एट अल 2001 1999, Aravamudan एट अल, 1999) पर iontophoresed जा सकता है. Iontophoretic pipettes विशिष्ट विन्यास के लिए निकाला जा सकता है, चर अवधि के लिए आवेदन के साथ, नकारात्मक या सकारात्मक वर्तमान की दालों का उपयोग कर. यह पु के बीच रिसाव को रोकने के लिए महत्वपूर्ण हैएक उपयुक्त विरोध समर्थन के साथ lses वर्तमान (Broadie एट अल 1993d, फेयथेरस्टोन एट अल 2002, 2005;. Rohrbough एट अल 2007). इस वर्तमान समर्थन की भयावहता विंदुक विन्यास के साथ भिन्न है और प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना चाहिए.
  2. कई प्रयोगों NMJ neurotransmitter है, एल ग्लूटामेट (जनवरी और जनवरी, 1976b) के साथ किया गया है, एक 100mm शेयर समाधान (मोनोसोडियम नमक, 8-9 पीएच) का उपयोग कर (Broadie और पीटा, 1993c). उच्च प्रतिरोध iontophoretic pipettes (100-200 MΩ) ग्लूटामेट रिसेप्टर (gluR) मैपिंग (Broadie और पीटा, 1993d) के लिए इस्तेमाल किया गया है, और कम प्रतिरोध pipettes (20-50 MΩ) के लिए कुल gluR (प्रतिक्रिया Broadie एट अल का अनुमान किया जाता है. 1995, 1997, फेयथेरस्टोन एट अल 2002, 2005, Rohrbough एट अल 2007).. नकारात्मक वर्तमान (~ 10 NA) अच्छी तरह से एक छोटा सा, सकारात्मक वर्तमान समर्थन करने के लिए रिसाव को रोकने के साथ काम करते हैं, लघु दालों (0.1-1 एमएस).
  3. गैर का आरोप लगाया और चार्ज अणु दबाव इंजेक्शन (Fergestad और Broadie, 2001; फेयथेरस्टोन एट अल 2001) द्वारा लागू किया जा सकता है. आवेदन के लिए, एक दबाव इंजेक्शन (<5 सुक्ष्ममापी भीतरी व्यास) विंदुक समाधान युक्त बंद तैनात है तंत्रिका टर्मिनल से (<10 सुक्ष्ममापी). अलग हो समाधान (5-10 साई) picospritzer या अन्य दबाव हवा स्रोत (फेयथेरस्टोन एट अल., 2002) का उपयोग कर लागू किया जा सकता है. प्रयोगों के दौरान लंबे समय तक, रिकॉर्डिंग कक्ष (<मात्रा 0.5 मिलीलीटर) लगातार perfused होना चाहिए (0.1 - 0,2 मिलीग्राम / सेक) सामान्य स्नान नमक के साथ.
  4. कई प्रयोगों hyperosmotic खारा के साथ किया गया है synaptic vesicles (Broadie एट अल 1995. Aravamudan, एट अल, 1999; Fergestad एट अल, 1999;. फेयथेरस्टोन, एट अल, 2000, 2002) के विलय ट्रिगर. अन्य प्रयोगों ग्लूटामेट रिसेप्टर्स और काली विधवा मकड़ी विष युक्त latroinsectotoxin (Broadie एट अल. +१९९५) के खिलाफ 636 argiotoxin जैसे जहर, के साथ किया गया है.

भाग 6: पूरक Neuromuscular जंक्शन महत्वपूर्ण इमेजिंग तकनीक

  1. Synaptic पुटिका कैनेटीक्स फ्लोरोसेंट lipophilic stryl रंजक (; Rohrbough एट अल 2004 Fergestad और Broadie, 2001) के साथ नजर रखी जा सकती है. vesicles के वितरण सीधे हो सकता है, देखा जा और endocytosis और exocytosis की दर को मापा. कई वेरिएंट अलग फ्लोरोसेंट गुण (FM4-64, rhodamine तरह FM1-43, fluorescein तरह) के साथ बनाया गया है. मूल डाई के संशोधन बदल hydrophobic गुण के साथ उत्पादों झुकेंगे है, और इसलिए अलग वार्शआउट कैनेटीक्स के साथ, उदाहरण के लिए, FM2-10 dissociates झिल्ली से बहुत तेजी से.
  2. Stryl रंगों के साथ भ्रूण NMJ लेबल, 10 सुक्ष्ममापी FM1 43 ऊंचा कोशिकी (50-90 मिमी) पोटेशियम (Fergestad और Broadie, 2001) का उपयोग कर 1-5 मिनट के लिए लोड किया जा सकता है. एक और अधिक शारीरिक दृष्टिकोण एक तंत्रिका चूषण इलेक्ट्रोड के द्वारा उत्तेजना के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है. तैयारी कर रहे हैं तो 2 CA में बार बार 5 मिनट के लिए + मुक्त बफर, धोया और प्रतिदीप्ति (रंगे synaptic vesicles प्रतिनिधित्व) मापा बनाए रखा . Exocytosis को मापने के लिए, एक या तो ऊंचा पोटेशियम या तंत्रिका बिजली की उत्तेजना का उपयोग डाई अनलोड कर सकते हैं.
  3. GFP वेरिएंट के साथ फ्यूजन प्रोटीन भ्रूण NMJ synapse के बहुरंगा लेबलिंग (. झांग एट अल 2002, ब्रांड, 1999) की अनुमति उत्पादन किया गया है. कई GFP - टैग प्रोटीन व्यक्त ट्रांसजेनिक्स सामान्य झिल्ली मार्करों (GFP जैसे - mCD8), postsynaptic मार्करों (शेखर GFP, GluRIIA - GFP उदाहरण के लिए), cytoskeletal (actin GFP जैसे, moesin GFP, ट्यूबिलिन GFP) और mitochondrial सहित उपलब्ध हैं मार्कर (जैसे साइटोक्रोम सी GFP) और synaptic पुटिका मार्करों (जैसे synaptobrevin - GFP, synaptotagmin - GFP, झांग एट अल, 2002).
  4. GFP संवाददाताओं डिब्बों कि अत्यधिक गतिशील हैं और विकास सुविधाओं या उत्परिवर्ती phenotypes (फेयथेरस्टोन और Broadie, 2000) का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लेबल. और फिर विरंजन (FRAP) प्रतिदीप्ति वसूली देख लार्वा ड्रोसोफिला NMJ (, यान और Broadie, 2007 जांग एट अल, 2002) में कम से कम संभव हो दिखाया गया है. सतर्कता का एक शब्द है, तथापि: इन मार्करों के कुछ पूरी तरह से अशक्त म्यूटेंट नहीं बचाव करते हैं और यहां तक ​​कि सामान्य NMJ फिजियोलॉजी बदल सकता है.

भाग 7: केन्द्रीय मोटर न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग

  1. कई भ्रूण न्यूरॉन्स व्यक्तिगत सोम स्थिति और प्रक्षेपण आकारिकी (Goodman और डो, 1993, Landgraf एट अल 1997 पीटा और मार्टिनेज - Arias, 1993) के आधार पर पहचाना जा सकता है है. इसके अलावा, GAL4/UAS प्रणाली (ब्रांड और Perrimon, 1993) GFP अभिव्यक्ति को लक्षित करने के लिए पहचाने जाने योग्य न्यूरॉन आबादी (Baines एट अल., 1998) की कल्पना कर सकते हैं. मोटर चार (एसीसी और RP1-4) न्यूरॉन्स और एक interneuron पीसीसी Baines (एट अल, 1998, 1999, 2001, तिथि करने के लिए रिकॉर्डिंग पढ़ाई पांच भ्रूण वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड (VNC) के भीतर सतही, पृष्ठीय न्यूरॉन्स के एक समूह पर ध्यान केंद्रित किया है , Rohrbough और Broadie, 2002; फेयथेरस्टोन एट अल 1995)..
  2. पहचान न्यूरॉन्स की सेल निकायों पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लिए सुलभ हैं. VNC neurolemma म्यान पहले protease (Baines और पीटा, 1998 के साथ संक्षिप्त केन्द्र उपचार के साथ हटाया जाना चाहिए; Baines ई. अल, 1999 टी, Rohrbough और Broadie, 2002). पृष्ठीय neuronal सेल निकायों एक बड़े (~ 20 सुक्ष्ममापी) पैच विंदुक व्यास 0.5-1% protease (रिकॉर्डिंग खारा में टाइप XIV (सिग्मा)) युक्त का उपयोग करने के लिए उजागर कर रहे हैं. सीएनएस म्यान सामग्री चूषण द्वारा विंदुक टिप में म्यान ruptures (फेयथेरस्टोन एट अल. १,९९५) जब तक 1-2 मिनट के लिए तैयार है. रिकॉर्डिंग, लूसिफ़ेर पीला (dipotassium नमक, 1-2 मिलीग्राम / एमएल) के दौरान सेलुलर पहचान की पुष्टि पैच समाधान के लिए जोड़ा जा सकता है क्रम में करने के लिए स्थिति और सेल की आकारिकी कल्पना.
  3. मानक पूरे सेल वोल्टेज और दबाना चालू रिकॉर्डिंग (; फेयथेरस्टोन एट अल, 2005 Rohrbough और Broadie, 2002) बनाया जा सकता है. बाहरी रिकॉर्डिंग खारा (मिमी): NaCl 140, 3, KCl 2 2 CaCl, 4 2 MgCl, 5 HEPES, 10 sucrose, NaOH 2 (7.2 पीएच) . पैच समाधान होता है (मिमी): 140 कश्मीर एसीटेट, 2 2 MgCl, CaCl2 0.1, 10 HEPES, EGTA 1.1, 2 Na2 एटीपी ~ 6 KOH (7.2 पीएच). वोल्ट दबाना रिकॉर्डिंग -60 एम वी का आयोजन क्षमता पर 18 डिग्री सेल्सियस पर बना रहे हैं ठेठ असमायोजित आराम क्षमता -45 के लिए -65 एम वी की रेंज में हैं (-52.9 ± 7.5 mV, ± एसडी, n = 78) का अर्थ है.
  4. उपलब्ध assays gated वोल्टेज ईओण Baines (और पीटा, 1998) धाराओं, दोहराव कार्रवाई क्षमता, synaptically की मध्यस्थता गतिविधि और agonist-gated प्रतिक्रियाओं (Baines एट अल., 2001) प्रकट करते हैं. मोटर न्यूरॉन्स को synaptic इनपुट दोनों तेजी से एपी मध्यस्थता तेजी उत्तेजक synaptic (ESCs) धाराओं, और उत्तेजक इनपुट के आवधिक, निरंतर (ऊपर 1 सेकंड की अवधि) एपिसोड कई बार या प्रति मिनट और अधिक (Baines एट अल घटनेवाला के रूप में दर्ज की गई है , 1999;. एट अल Baines, 2001).
  5. सेल सोम iontophoretically लागू (ACH) acetylcholine और निरोधात्मक ट्रांसमीटर GABA (फेयथेरस्टोन, एट अल 2005. Baines और पीटा, 1998) का जवाब. ACH neuronal सोम iontophoretically लागू कर सकते हैं एक तेज DH 2, 0 में 100mm ACH युक्त microelectrode के माध्यम से सकारात्मक वर्तमान agonist योणोगिनेसिस पक्ष में 4-5 पीएच पर.

प्रतिनिधि परिणाम

Ventral अनुदैर्ध्य मांसपेशी 6 खंडों A2-A3 रिकॉर्डिंग के लिए सबसे अधिक उपयोग लक्ष्य (Broadie और पीटा, 1993a घ है, हैरिसन एट अल 1994, अल में स्वीनी 1995; Renden एट अल 2001, हुआंग एट अल 2006. Mohrmann एट अल 2008). परिपक्व भ्रूण और नव रची पहली instar लार्वा (20-21 में 25 बजे AEL डिग्री सेल्सियस = सेने), मांसपेशियों 6 पूरे सेल समाई आमतौर पर 25-30 pF है, और इनपुट resistances MΩ 20-40, विकासात्मक उम्र के साथ बदलते. अधिकतमबिटरेट NMJ synaptic धाराओं picoamps के दसियों (13-14 बजे AEL) से 1 - 2nA (20-21 बजे AEL) रेंज है, उम्र के एक समारोह के रूप में तेजी से बढ़ रही है. ग्लूटामेट-gated धाराओं के प्रत्यक्ष उपाय सिर्फ अंडे सेने के लिए पहले picoamps के सैकड़ों (13-14 बजे AEL) से 1.5 4nA की अधिक से अधिक प्रतिक्रियाओं उपज. श्रृंखला प्रतिरोध त्रुटियों (कुल मौजूदा एक्स श्रृंखला प्रतिरोध) आमतौर पर <5 एम वी कर रहे हैं, लेकिन, परिपक्व, अंडे सेने के पूर्व भ्रूण में, के रूप में 10 के रूप में उच्च के रूप में हो + mV सकता है, और इस तरह श्रृंखला प्रतिरोध मुआवजा की सलाह दी है. 10-30 सुक्ष्ममापी के एक औसत व्यास, और 40-80 सुक्ष्ममापी की औसत लंबाई के साथ भ्रूण मांसपेशियों के लिए लगभग एक आदर्श स्थान दबाना मापदंडों दिखाने दिखाई देते हैं. सेल दबाना समय (आर श्रृंखला XC सेल) स्थिरांक औसत 0.25 से कम मिसे.

परिपक्व भ्रूण और नव रची लार्वा, पृष्ठीय मोटर न्यूरॉन जनसंख्या अधिक सीमित रिकॉर्डिंग के अधीन किया गया है. Neuronal सोम रिकॉर्डिंग 1.8-2.5 (2.0 pF औसत pF), 40-60 की श्रृंखला MΩ प्रतिरोध और ~ GΩ 5 (फेयथेरस्टोन एट अल 2005 Baines और पीटा, 1998) के इनपुट प्रतिरोध की सीमा में पूरे सेल समाई प्रकट करते हैं. इन कोशिकाओं को भ्रूण परिपक्वता के दौरान स्पष्ट रूप से आकार और जटिलता में वृद्धि, और इस विकास लार्वा विकास भर में जारी है. तीसरे instars में, पूरे सेल समाई 17-20 pF है, श्रृंखला प्रतिरोध 25-37 MΩ है और इनपुट प्रतिरोध औसत 900 ~ MΩ (Rohrbough और Broadie, 2002, रिचर्ड Baines, व्यक्तिगत संचार). ईओण conductances विकास में वृद्धि, लेकिन वर्तमान घनत्व (PA / पीएफ) उल्लेखनीय निरंतर बनी हुई है. परिपक्व भ्रूण में, synaptic आयाम में 75 100pA औसत धाराओं, दोनों तेजी से ईएससी घटनाओं और लंबे समय तक ~ 500 मिसे (Baines और पीटा, 1998; फेयथेरस्टोन एट अल 2005) औसत धाराओं के साथ. भ्रूण में, इन निरंतर औसत 3-5 मिनट प्रति घटनाओं, पहला instar (रिचर्ड Baines, व्यक्तिगत संचार) प्रति मिनट में 20 ~ बढ़ रही है. ध्यान दें कि रूपात्मक जटिलता और ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स की झिल्ली गुण यह लगभग असंभव ठीक सोम परे सेल के ज्यादा वोल्टेज क्लैंप करने के लिए बनाता है . इसलिए ध्यान के साथ रिकॉर्डिंग की व्याख्या करना चाहिए.

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Discussion

ड्रोसोफिला के भ्रूण से electrophysiological रिकॉर्डिंग मैनुअल हेरफेर और विच्छेदन की आवश्यकता है . तैयारी के स्वास्थ्य, और रिकॉर्डिंग के फलस्वरूप गुणवत्ता, जल्दी से और बड़े करीने से से रिकॉर्डिंग के लिए नाजुक भ्रूण के ऊतकों को तैयार करने में सक्षम किया जा रहा पर निर्भर करता है, और तब प्रयोग निष्पादित. प्रयोगकर्ता एक ही बार में दोनों से निपटने की कोशिश कर रहा से पहले दोनों भ्रूण dissections और पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में कुशल होना चाहिए.

रिकॉर्डिंग "संशोधित मानक" या "haemolymph की तरह" salines (hl) के कई वेरिएंट में से एक में किया जा सकता है. खारा इन दो वर्गों के बीच प्राथमिक अंतर 1) ना + (70 मिमी HL बनाम 120-135 मिमी मानक) एकाग्रता और 2) मिलीग्राम 2 + एकाग्रता (4 मिमी मानक बनाम 20 मिमी एच. एल). मानक समाधान में उच्च ना + एकाग्रता के प्रमुख लाभ कार्रवाई संभावित प्रसार और इसलिए, सामान्य, नमूनों synaptic प्रसारण के रखरखाव की सुविधा है . HL salines कार्रवाई संभावित मध्यस्थता synaptic प्रसारण को दबाने. 2 मिलीग्राम, +, जो वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल ब्लॉक में अंतर synaptic प्रसारण के आयाम बदल और HL salines (स्टीवर्ट एट अल 1994) में Ca 2 + निर्भरता रेंज ऊपर बदलाव. HL इसलिए पर salines बहुत कम synaptic प्रसारण आयाम दिखाने एक दिया [ca 2 +] Osmolarity की सावधानी से नियंत्रण दोनों salines में सेलुलर vacuolation समाप्त, और आकारिकी समान रूप से अच्छी तरह से या तो खारा में संरक्षित प्रकट होता है. के बाद से न तो खारा वास्तविक haemolymph replicates एक नमकीन का चयन अध्ययन के तहत सवाल की जरूरतों को प्रतिबिंबित करना चाहिए.

वहाँ कई महत्वपूर्ण भ्रूण रिकॉर्डिंग की सफलता को अधिकतम करने के दिशा निर्देश हैं. सबसे पहले, को सफलतापूर्वक भ्रूण पेशी पर gigaohm जवानों फार्म की क्षमता विकासात्मक उम्र के साथ घट जाती है. यह मुख्य रूप से परिपक्व मांसपेशियों के आसपास तहखाने झिल्ली के विकास के लिए कारण संभावना है. इस प्रतिक्रिया के लिए, अब collagenase उपचार (1-2 मिनट) की आवश्यकता है. हालाँकि, ध्यान क्योंकि इस lengthened enzymatic उपचार जल्दी मांसपेशियों शरीर दीवार अनुलग्नक समझौता कर लिया होना चाहिए, और आसानी से मांसपेशियों की टुकड़ी के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. एक नियम हम प्रभावी पाया है ~ समय है कि detectable मांसपेशियों टुकड़ी का कारण बनता है के 50% के लिए एंजाइम उपचार की सीमा है. दूसरा, यह महत्वपूर्ण है कि तंत्रिका पर्याप्त उत्तेजना के लिए एक चूषण इलेक्ट्रोड में तंग फिट है, भी ढीली और उत्तेजना में विफल रहता है, बहुत तंग है और यह तंत्रिका की एक पर्याप्त अनुभाग को प्रोत्साहित करने के लिए संभव नहीं है. हमारे अनुभव में, यह निश्चित रूप से सफल NMJ रिकॉर्डिंग के लिए सबसे बड़ा एकल सीमा है. चूषण इलेक्ट्रोड के लिए उपयुक्त व्यास empirically निर्धारित करना चाहिए, लेकिन हर प्रयास करने के लिए एक अच्छा उत्तेजना इलेक्ट्रोड है, जो आसानी से रिकॉर्डिंग के एक पूरे दिन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की रक्षा के लिए किया जाना चाहिए. तीसरा, NMJ सफल neurotransmitter है और नशीली दवाओं के अनुप्रयोगों के लिए, यह synapse स्थापन के साथ परिचित बनने के लिए महत्वपूर्ण है. अनुभव के साथ, टकसाली अंत आसानी डीआईसी प्रकाशिकी के साथ पाया जा सकता है. शुरुआत के लिए, भ्रूण में तंत्रिका टर्मिनलों झिल्ली permeant 123 rhodamine या 4-डि - 2 - Asp (Broadie, और पीटा, 1993a Yoshikami और Okun, 1984) जैसे फ्लोरोसेंट mitochondrial रंजक, के साथ प्रगट किया जा सकता है. dissected भ्रूण बस डाई (5mm, 5 मिनट) और अधिक खारा के कई washes के साथ हटा डाई से अवगत कराया है. तैयारी तो एक महामारी प्रतिदीप्ति लगाव और उपयुक्त फिल्टर के साथ देखी जा सकती है. इसी तरह के दृष्टिकोण ट्रांसजेनिक GFP भ्रूण synapse अंकन constructs का उपयोग कर सकते हैं.

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Acknowledgments

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तंत्रिका विज्ञान 27 अंक ड्रोसोफिला भ्रूण पूरे सेल पैच दबाना मांसपेशियों न्यूरॉन neuromuscular जंक्शन synapse
Electrophysiological रिकॉर्डिंग में<em> ड्रोसोफिला</em> भ्रूण
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Chen, K., Featherstone, D. E.,… More

Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo. J. Vis. Exp. (27), e1348, doi:10.3791/1348 (2009).

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