Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Elektrophysiologische Aufzeichnung in der Drosophila Embryo

Published: May 21, 2009 doi: 10.3791/1348
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Biological Sciences, University of Illinois, 2Department of Biological Sciences, Vanderbilt University

Summary

Elektrophysiologischen Ableitungen aus

Abstract

Drosophila ist ein führender genetisches Modell für die Untersuchung der beiden embryonalen Entwicklung und funktionelle Neurowissenschaften. Traditionell sind diese Felder ganz von einander getrennt, mit weitgehend unabhängigen Geschichten und Wissenschaft. Allerdings ist die Schnittstelle zwischen diesen in der Regel unterschiedliche Felder der Entwicklungsprogramme zugrunde liegenden Erwerb von funktionellen elektrischen Signal-Eigenschaften und die Differenzierung von funktionellen chemischen Synapsen während der letzten Phasen der neuronalen Schaltkreis Bildung. Diese Schnittstelle ist ein äußerst wichtiges Gebiet für die Untersuchung. In Drosophila treten diese Phasen der funktionalen Entwicklung über einen Zeitraum von <8 Stunden (bei ​​25 ° C) während des letzten Drittels der Embryogenese. Diese späte Entwicklungsphase galt lange Zeit als unlösbar zu Ermittlungen wegen der Ablagerung von einem harten, undurchlässigen epidermale Kutikula. Ein Durchbruch Fortschritt war die Anwendung von Wasser-Polymerisation chirurgische Kleber, die lokal an der Nagelhaut kann angewendet werden, um kontrollierte Präparation des Late-Stage-Embryonen zu ermöglichen. Mit einem dorsalen Längsschnitt, kann der Embryo flach gelegt werden, Freilegung der Bauchmark und Körper Wand Muskulatur experimentelle Untersuchung. Whole-Cell-Patch-Clamp-Techniken kann dann eingesetzt werden, um von individuell identifizierbaren Neuronen und somatischen Muskeln aufzuzeichnen. Diese Aufnahme-Konfigurationen verwendet worden, um das Aussehen und die Reifung der Ionenströme und Aktionspotential Ausbreitung in beide Neuronen und Muskeln zu verfolgen. Genetische Mutationen nicht diese elektrischen Eigenschaften charakterisiert worden, um die molekulare Zusammensetzung von Ionenkanälen und damit verbundene Signal-Komplexen zeigen, und um die Erforschung der molekularen Mechanismen der funktionellen Differenzierung zu beginnen. Ein besonderer Schwerpunkt ist die Montage von synaptischen Verbindungen, sowohl in das zentrale Nervensystem und Peripherie. Die glutamatergen neuromuskulären Synapse (NMJ) ist am leichtesten zugängliche, eine Kombination von optischen bildgebenden und elektrophysiologischen Aufzeichnung. Ein Glas Saugelektrode wird verwendet, um die peripheren Nerven zu stimulieren, mit exzitatorischen Kreuzung Strom (EJC) Aufnahmen in der Spannungs-geklemmt Muskel gemacht. Diese Aufnahme wurde die Konfiguration verwendet werden, um die funktionale Differenzierung der Synapse-Chart, und verfolgen Sie das Aussehen und die Reifung der präsynaptischen Freisetzung von Glutamat Eigenschaften. Darüber hinaus können postsynaptischen Eigenschaften unabhängig über iontophoretischen oder Druck-Anwendung von Glutamat untersucht direkt auf den Muskel Oberfläche, um das Aussehen und die Reifung der Glutamat-Rezeptor-Felder zu messen. So können sowohl prä-und postsynaptischen Elemente einzeln oder in Kombination während der embryonalen Synaptogenese überwacht werden. Dieses System wurde stark genutzt zu isolieren und zu charakterisieren genetische Mutanten, die embryonale Synapsenbildung beeinträchtigen und damit zeigen, die molekularen Mechanismen, über die Spezifikation und Differenzierung von Synapsen-Verbindungen und funktionelle synaptische Signalisierung Eigenschaften.

Protocol

Teil 1: Ausrüstung und Zubehör

  1. Elektrophysiologische Ableitungen von Drosophila Embryonen erfordert zunächst Kenntnisse in embryonalen Dissektion Techniken, die in einem anderen JoVE Video beschrieben werden.
  2. Elektrophysiologische Ableitungen von Drosophila Embryonen nutzt Standard-Patch-Clamp-Aufnahme-Konfigurationen. Patch-Clamp-Aufzeichnungsgeräte und Software für viele andere Präparate eignet sich auch für die Aufnahme von Drosophila-Embryos. Da Drosophila-Embryos zu einem Deckglas beim Präparieren verklebt sind, sollte die Aufnahmezeit Kammer akzeptieren Deckgläser. Die Dicke der Vorbereitung und Weise, in der es um das Deckglas montiert ist, erfordert eine aufrechte Mikroskop mit hervorragenden DIC-Optik und eine lange Distanz Objektiv.
  3. Zwei Arten von Bad-Lösungen sind für die elektrophysiologische Ableitung eingesetzt; 1) "Standard" (Jan und Jan, 1976a) oder "modifizierte Standard" (Broadie, 2000) Salinen, auf Lösungen üblicherweise für die Aufnahme in andere wirbellose Systeme verwendeten, und 2) "Hämolymphe-like" (HL) Salinen (Stewart et al 1994), einen Kompromiss zwischen den Standard-Kochsalzlösung und die Ionenkonzentrationen in der Drosophila Hämolymphe gemessen. Es wird darauf hingewiesen, dass keines dieser Salinen genau imitieren die Ionenkonzentrationen in der Hämolymphe gemessen, was ungünstig für die Aufnahme sind (Broadie, 2000). Standard-Kochsalzlösung enthält (in mM): 135 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl 2, 1,8 CaCl2, 72 Saccharose, 5 TES, pH 7,2.

Teil 2: Recording-Konfiguration

  1. Für physiologische Experimente, die seziert Embryo Zubereitung in einer kleinen Plexiglas-Aufnahme Kammer platziert (<0,5 ml) und angesehen im Durchlicht mit einem aufrechten Mikroskop Verbindung mit Differential-Interferenz-Kontrast (Nomarski) Optik und eine lange Arbeitsabstand 40-100X ausgestattet ( typischerweise 40X) Wasser-Immersions-Objektiv (Broadie und Bate, 1993a). Die Aufnahmen werden in der Regel unterhalb der Raumtemperatur vorgenommen (16-22 ° C), mit steigendem Schwierigkeitsgrad bei erhöhten Temperaturen (22 + ° C). Dies erreichen wir durch Kühlung des Raumes statt Kühlung der preapartion.
  2. Patch-Pipetten können aus einer Vielzahl von Faser-gefüllte Gläser (zB Borosilikatglas, 1 mm Außendurchmesser) gezogen werden und die Spitzen sollten feuerpolierte bis zur endgültigen Widerstände von 5-10 MOhm. Ein Chlorid-Silber-Erdleitung wird in das Bad gelegt. Signale werden verstärkt mit einem Patch-Clamp-Verstärker (zB Axopatch-1D, Axon Instruments), mit einem 8-poligen Bessel-Filter bei 2-10 Hz gefiltert und entweder on-line abgetastet oder digital für eine spätere Analyse gespeichert werden.
  3. Herkömmliche Patch-Clamp-Aufzeichnungen werden meist bei 18 ° C gilt mit Patch-Pipetten aus fasergefüllte Borosilikatglas gezogen (Tipps Wärme poliert, um ~ 1 um id). Broadie et al, 1997;;.. Fergestad et al, 1999; Featherstone et al Aktuelle Datensätze werden aus den identifizierten vielkernigen Muskelfasern in Voltage-Clamp (Standard halten Potentiale -60 bis -80 mV) (Broadie und Bate, 1993a-d gemacht ., 2000). Die Patch-Pipette Lösung enthält (in mm): 120 KCl, 20 KOH, 4 MgCl 2, 0,25 CaCl 2, 5 EGTA, 4 Na 2 ATP, 36 Sucrose und 5 TES, pH 7,2 gepuffert. Recording-Elektroden sind wieder gefüllt.

Teil 3: Muscle Recording

  1. Im Prinzip kann jeder embryonalen Muskel in dieser Zubereitung aufgezeichnet werden. In der Praxis hat die meisten Aufnahmen auf dem großen, ventral Längsmuskeln in der innersten Muskelschicht (; Broadie und Bate, 1993a-c Bate, 1990) konzentriert. Die Aufzeichnungen haben auch von der dorsalen und lateralen Muskeln dieser Muskelschicht (; Auld et al 1995;. Nishikawa und Kidokoro, 1995;. Baumgartner bei al 1996 Kidokoro und Nishikawa, 1994) gemacht worden. Allerdings sind die meisten Experimente auf die Gruppe der vier Längs-, ventralen Muskeln (6,7,12,13), vor allem Muskel-6 in der vorderen Bauch (A2-A3) zu konzentrieren.
  2. Keine enzymatische Behandlung vor Muskel-Aufnahme bei jungen Embryonen (<16 Stunden AEL) erforderlich. Allerdings entwickelt sich ein Muskel Scheide in den späteren Embryo (> 16 Stunden AEL) und muss mit Kollagenase (Collagenase Typ IV, 1 mg / ml in zweiwertiges Kation-free Kochsalzlösung, 0,5-2 min bei RT) vor Patch Aufnahme entfernt werden. Nach Enzymbehandlung sind Abdichtwiderstande auf den Muskel in der Regel> 1 G.
  3. Patch-Clamp Messungen können aus der embryonalen Muskeln mit einer Reihe von Standard-Techniken hergestellt werden (; Broadie et al 1994, 1995, 1997;. Broadie und Bate 1993a-c Nishikawa und Kidokoro, 1995). Jede Standard-Patch-Clamp-Variationen - cell-attached, inside-out, outside-out - eingesetzt werden, um Einkanal-Aktivität im Muskel-oder Muskel isoliert Membranflecken aufzuzeichnen. Einzel-Glutamat-Rezeptor-Kanal-Aktivität (~ 12 pA bei -60 mV) sind in der Regel auf der fallenden Phase der spontanen exzitatorischen Kreuzung Ströme (sEJCs) in Ganzzell-Modus aufgenommen zu beobachten.
  4. Die meisten Aufnahmen ist in whole-cell recording Config getanration, erreicht leicht von der Zell-befestigten Zustand mit leichten Sog oder eine elektrische "buzz". Die Muskeln können entweder in Voltage-Clamp (typisch hält Potentiale von -60 bis -80 mV) oder Current-Clamp-Konfigurationen aufgenommen werden. Muskeln bei jüngeren Embryonen (<13 Stunden AEL) kann nicht effektiv Spannung eingespannt wegen umfangreicher Kopplung zwischen den embryonalen Myotuben (Broadie und Bate, 1993), das ist normalerweise kein Problem bei der späteren (14 + Stunden AEL) Entwicklungsstadien (Ueda und Kidokoro, 1996).
  5. Nystatin-perforierten Patch-Clamp-Aufzeichnung angewandt werden, um Datensätze mit Standard-whole-cell-Techniken (Broadie und Bate, 1993a) erhalten zu überprüfen. Die Perforation Lösung wird wie folgt: 10 mg Pluronic F-127 (Molecular Probes p-1572) wird in 20 ml DMSO gelöst und mit 10 mg Nystatin in dieser Lösung gelöst, um die Lager zu machen. 100 ul der Bestand auf 5 ml gefiltert Pipettenlösung der Recording-Lösung angehängt. Whole-cell Ströme sind in der Regel <3 Minuten nach dem Siegel Bildung erhalten. Längswiderstand ist deutlich in den meisten Fällen erhöht und die Zellen können einen erhöhten Ableitstrom entwickeln (Broadie und Bate, 1993a).
  6. Eine nach innen Calcium (I Ca): Die whole-cell spannungsgesteuerten Strom in reifen embryonalen (und Larven) Muskel besteht aus fünf prominenten Komponenten (.;; Zagotta et al 1988 Broadie und Bate, 1993b Wu und Haugland, 1985) komponiert und vier nach außen Kalium Ströme (Tsunoda und Salkoff, 1995), darunter zwei schnelle, inaktivierende Ströme, Spannung-gated (I A) und Kalzium-abhängige (I CF), und zwei verzögert, nicht-inaktivierende Ströme, Spannung-gated (I K) und Kalzium-abhängige (I CS). Ion-Substitution Experimente können verwendet werden, um diese Ströme aus der ganzen-Zell-Antwort bei der Voltage-Clamp (Broadie und Bate, 1993b) zerlegen.

Teil 4: neuromuskulären Synapse Stimulation und Recording

  1. Die häufigste und zuverlässige Methode zur NMJ Stimulation nutzt ein Glas Saugelektrode auf der segmentalen peripheren Nerven. Saug-Elektroden können aus einer Vielzahl von Fasern gefüllten Elektrode Glas (1-1.5 um Außendurchmesser) gezogen werden und sollte feuerpolierte, um die gewünschte Konfiguration (~ 5 um Innendurchmesser) zu erreichen. Ein kleines Segment (<50 um) des entsprechenden segmentalen motorischen Nerven in die Pipette mit sanftem Sog gezogen, um eine Abdichtung zu bilden.
  2. Es ist üblich, die intakte Nerven, indem in einer Schleife des Nervs in der Nähe des ZNS Ausspeisepunkt zu stimulieren. Dieser Ansatz ermöglicht eine einfache Stimulation des intakten Vorbereitung, hat aber den Nachteil, dass spontane CNS-evozierte Aktivität auf der angewandten Stimulation Paradigma überlagert auftreten. Eine Alternative ist, um den Schnitt motorischen Nerven zu stimulieren. Dies kann erreicht werden, wenn der CNS entfernt werden, obwohl dieses Verfahren neigt dazu, die Nerven dehnen und können Schäden verursachen. Der Nerv kann auch mit einem scharfen Glas-Mikroelektrode geschnitten werden, aber dieses Verfahren ist langwierig und schwierig. Es wird empfohlen, die Datensätze aus der intakten Präparat durchgeführt werden.
  3. Stimulation kann mit einer Vielzahl von Paradigmen angewandt werden. Kurze Stimulation (0.2-1 ms) am besten funktioniert und Intensität der Stimulation (in der Regel 1-5 V) wird auf der Saug-Konfiguration ab und muss experimentell für jede Zelle bestimmt werden. Überschwellige Stimulation der motorischen Nerven ist am besten, indem Sie die Reizstärke leicht über (1-2 Volt) Schwellenwert erreicht. Evozierte NMJ Antworten werden von der Patch-geklemmt Muskel aufgenommen, wie oben beschrieben. Der Schock Artefakt kann im Wesentlichen mit dem Einsatz einer isolierten virtuellen Boden gesenkt werden.
  4. Eine weniger sichere Alternative zu den Standard Saugelektrode Nervenstimulation ist eine direkte Stimulation des zentralen Nervensystems (Nishikawa und Kidokoro, 1995). Eine Mikroelektrode mit 3-4 M KCl (oder KAC) aufgefüllt wird in die Mitte des Bauchganglion und positive Impulse von ~ 2 Mikroampere in Intensität und ~ 2 ms Dauer geliefert werden (Dietcher et al. 1998) eingefügt. Die Elektrodenspitze sollte in den nächsten Neuropil der hemisegment wo Stimulation gewünscht wird. Synaptischen Übertragung ist in der Patch-geklemmt Muskel in der Standard-Konfiguration aufgezeichnet.
  5. Die embryonale NMJ zugänglich ist whole-cell Patch-Clamp-Aufzeichnung während seiner Differenzierung. Für erregende junctional Strom (EJC) Aufnahmen werden die Signale mit einer Standard-Patch-Clamp-Verstärker aufgenommen, gefiltert (in der Regel bei 1-2 KHz), umgewandelt in ein digitales Signal mittels eines Analog-Digital-Interface, und erwarb mit einem Computer entsprechende Software.

Teil 5: neuromuskulären Synapse Chemical and Drug Applications

  1. Jede kleine, geladene Molekül kann effektiv auf die embryonale NMJ (.; Fergestad et al 1999, 2001 Aravamudan et al, 1999) iontophoresed werden. Iontophoretische Pipetten können für bestimmte Konfigurationen gezogen werden, mit Anwendungen für unterschiedliche Zeiträume, mit Impulsen von negativen oder positiven Strom. Es ist wichtig, um eine Leckage zwischen pu verhindernSchreiadler mit einer entsprechenden gegnerischen Rückendeckung Strom (Broadie et al 1993d;. Featherstone et al 2002, 2005;.. Rohrbough et al 2007). Die Größe dieser Rückendeckung Strom wird mit Pipette Konfiguration variieren und sollte experimentell bestimmt werden.
  2. Viele Experimente wurden mit dem NMJ Neurotransmitter, L-Glutamat (Jan und Jan, 1976b) getan wurde, mit einer 100 mM Stammlösung (Mononatriumsalz; pH 8-9) (Broadie und Bate, 1993c). Hohe Beständigkeit iontophoretischen Pipetten (100-200 MOhm) haben für die Glutamat-Rezeptor (Glur) Mapping (Broadie und Bate, 1993d) verwendet wurde, und einen geringeren Widerstand Pipetten (20-50 MQ) verwendet werden, um die gesamte Glur Antwort (Broadie et al schätzen. 1995, 1997; Featherstone et al 2002, 2005;. Rohrbough et al 2007).. Kurze Impulse (0.1-1 ms) der negativen Strom (~ 10 nA) funktionieren gut, mit einem kleinen, positiven Rückhalt aktuellen Auslaufen zu verhindern.
  3. Non-geladen und geladene Moleküle können durch Druck Auswurf (Fergestad und Broadie, 2001.; Featherstone et al 2001) angewendet werden. Für den Einsatz wird ein Druck Auswurf Pipette (<5 um Innendurchmesser) mit der Lösung nahe (<10 um) aus der Nervenendigung positioniert. Die Lösung ausgeworfen werden kann unter Verwendung einer picospritzer (5-10 psi) oder andere Druckluftquelle (Featherstone et al., 2002). Bei längerem Versuche, sollte die Aufnahmezeit (Volumen <0,5 ml) kontinuierlich durchströmt werden (0,1 bis 0,2 ml / sec) mit normalen Bad Kochsalzlösung.
  4. Viele Experimente sind mit hyperosmotischen Kochsalzlösung getan worden, um Fusion von synaptischen Vesikeln (Broadie et al 1995.; Aravamudan, et al, 1999;. Fergestad et al, 1999;.. Featherstone et al, 2000, 2002) auslösen. Andere Experimente haben mit Toxinen, wie Argiotoxin 636 gegen Glutamat-Rezeptoren und Schwarze Witwe Gift enthält latroinsectotoxin (Broadie et al. 1995) getan worden.

Teil 6: Zusätzliche neuromuskulären Synapse Vital Imaging Techniques

  1. Synaptischer Vesikel Kinetik kann mit fluoreszierenden lipophilen styryl Farbstoffe (.; Rohrbough et al 2004 Fergestad und Broadie, 2001) überwacht werden. Die Verteilung der Vesikel direkt beobachtet werden, und die Sätze der Endozytose und Exozytose gemessen. Mehrere Varianten mit unterschiedlichen Fluoreszenz-Eigenschaften (; FM4-64, Rhodamin-like FM1-43, Fluorescein-like) gemacht worden. Änderungen der ursprünglichen Farbe haben Produkte mit veränderten hydrophoben Eigenschaften ergeben, und daher mit unterschiedlichen Auswaschen Kinetik, zB FM2-10 distanziert viel schneller von der Membran.
  2. Um die Beschriftung der embryonalen NMJ mit styryl Farbstoffe, 10 uM FM1-43 für 1-5 Minuten mit erhöhtem extrazellulärem Kalium (50-90 mM) (Fergestad und Broadie, 2001) geladen werden. Eine weitere physiologische Ansatz kann über eine Stimulation durch einen Nerv Saugelektrode erreicht werden. Die Vorbereitungen sind dann immer wieder in Ca 2 +-freien Puffer für 5 Minuten gewaschen, und behielt Fluoreszenz (entspricht gefärbt synaptische Vesikel) gemessen. Zur Messung Exozytose, kann man entladen den Farbstoff entweder mit erhöhten Kalium-oder Nervenzellen elektrische Stimulation.
  3. Fusionsproteine ​​mit GFP-Varianten wurden hergestellt erlaubt multicolor Kennzeichnung der embryonalen NMJ Synapse (Brand, 1999;. Zhang et al 2002). Viele Transgenik, die GFP-markierten Proteine ​​zur Verfügung, einschließlich allgemeiner Membran Marker (z. B. mCD8-GFP), postsynaptischen Markern (zB Shaker-GFP, GluRIIA-GFP), des Zytoskeletts (zB Aktin-GFP, Moesin-GFP, Tubulin-GFP) und die mitochondriale Marker (z. B. Cytochrom C-GFP) und synaptische Vesikel Marker (z. B. Synaptobrevin-GFP, Synaptotagmin-GFP;. Zhang et al, 2002).
  4. GFP-Reporter-Label Fächer, die sehr dynamisch sind und kann verwendet werden, um Entwicklungs-Features oder mutierten Phänotypen (Featherstone und Broadie, 2000) zu beurteilen. Bleaching und dann beobachten die Erholung der Fluoreszenz (FRAP) hat sich gezeigt, möglich sein, zumindest bei den Larven Drosophila NMJ (Zhang et al, 2002;. Yan und Broadie, 2007). Ein Wort der Vorsicht jedoch: einige dieser Marker nicht in vollem Umfang zu retten null Mutanten und vielleicht sogar verändern normalen NMJ Physiologie.

Teil 7: Aufnahme aus Mittel-Motoneuronen

  1. Viele embryonalen Neuronen können individuell auf der Grundlage soma Position und Projektion Morphologie (; Goodman und Doe, 1993; Landgraf et al 1997 Bate und Martinez-Arias, 1993) identifiziert werden. Ferner kann die GAL4/UAS System (Brand-und Perrimon, 1993) Ziel GFP-Expression auf identifizierbare Neuron Populationen (Baines et al., 1998) zu visualisieren. Vier Motor Neurone (ACC und RP1-4) und einem Interneuron PCC (Baines et al, 1998, 1999, 2001;. Recording Studien bis heute haben sich auf eine Gruppe von fünf oberflächlich, dorsalen Neuronen innerhalb der embryonalen Bauchmark (VNC) konzentriert ; Rohrbough und Broadie, 2002; Featherstone et al 1995)..
  2. Zellkörper der Neuronen identifiziert zugänglich sind whole-cell Patch-Clamp-Aufzeichnung Elektroden. Die VNC Neurilemm Scheide muss zunächst mit einer kurzen Brennweite Behandlung mit Protease (Baines und Bate, 1998 entfernt werden; Baines et al, 1999;. Rohrbough und Broadie, 2002). Dorsal neuronalen Zellkörpern ausgesetzt sind, mit einem großen Durchmesser (ca. 20 um) Patch-Pipette mit 0.5-1% Protease (Typ XIV (Sigma) in der Aufnahme Kochsalzlösung). Das ZNS Mantelmaterial wird durch Ansaugen in die Pipettenspitze für 1-2 Minuten, bis die Hülle platzt (Featherstone et al. 1995). Um zelluläre Identität während der Aufnahmen, Lucifer Yellow (Dikaliumsalz, 1-2 mg / ml) bestätigen kann, um das Patch-Lösung zugegeben werden, um die Position und die Morphologie der Zelle sichtbar zu machen.
  3. Standard-whole-cell Spannungs-und Strom-Clamp Messungen gemacht (Rohrbough und Broadie, 2002.; Featherstone et al, 2005). Die externe Aufzeichnung Kochsalzlösung enthält (in mm): 140 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl 2, 4 MgCl 2, 5 HEPES, 10 Saccharose, 2 NaOH (pH 7,2). Der Patch-Lösung enthält (in mm): 140 K-Acetat, 2 MgCl 2, 0,1 CaCl2, 10 HEPES, 1,1 EGTA, 2 Na2-ATP, ~ 6 KOH (pH 7,2). Voltage-Clamp Messungen sind Halten Potentiale von -60 mV bei 18 ° C aus Typische unbereinigte ruhenden Potenziale liegen im Bereich von -45 bis -65 mV (-52,9 ± 7,5 mV, Mittelwert ± SD, n = 78).
  4. Verfügbare Tests zeigen spannungsabhängigen Ionenströme (Baines und Bate, 1998), repetitive Aktionspotentiale, synaptisch-vermittelten Aktivität und Agonist-gated Antworten (Baines et al., 2001). Synaptic Eingang Motoneuronen ist in der Form der beiden schnellen AP-vermittelten schnellen exzitatorischen synaptischen Ströme (WSR) und regelmäßige, nachhaltige (bis zu 1 sec Dauer) Episoden von exzitatorischen Eingang vorkommenden mehrfach oder mehr pro Minute (Baines et al aufgezeichnet ., 1999; Baines et al, 2001)..
  5. Zell-Soma zu iontophoretisch angewendet Acetylcholin (ACh) und die hemmende Transmitter GABA (.; Featherstone et al 2005 Baines und Bate, 1998) zu reagieren. ACh kann iontophoretisch der neuronalen soma angewandt werden über einen scharfen Mikroelektroden mit 100 mM ACh in dH 2 0, bei pH 4-5 zu Agonist Iontophorese durch positive aktuellen begünstigen.

Repräsentative Ergebnisse

Ventral Längsmuskel 6 ist Segmente A2-A3 ist die am häufigsten verwendeten Target für die Aufnahme (Broadie und Bate, 1993a-d; Harrison et al 1994;. Sweeney et al 1995;. Renden et al 2001;. Huang et al 2006.; Mohrmann et al. 2008). In den reifen Embryo und frisch geschlüpften Larven erste Larvenstadium (20-21 Uhr AEL bei 25 ° C = Schlupf), wird Muskel 6 ganze Zelle Kapazität der Regel mit 25-30 pF und Eingangswiderstände 20-40 MOhm, im Wechsel mit Entwicklungsalter. Maximal NMJ synaptischen Ströme reichen von zehn picoamps (13-14 Uhr AEL), um 1-2nA (20-21 Uhr AEL), schnell wachsende Abhängigkeit vom Alter. Direkte Messung von Glutamat-gesteuerten Ströme liefern maximale Reaktionen von Hunderten von picoamps (13-14 Uhr AEL) zum 1,5-4NA kurz vor dem Schlüpfen. Längswiderstand Fehler (total aktuelle X-Serie Widerstand) sind in der Regel <5 mV, aber in den reifen, vor dem Schlüpfen Embryonen, kann so hoch sein wie 10 + mV und damit Serienwiderstand Entschädigung wird empfohlen. Embryonale Muskeln mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 10-30 um, und die durchschnittliche Länge von 40-80 pm, scheinen fast idealen Raum Klemme Parameter zeigen. Zell-Clamp Zeitkonstanten (R-Serie XC-Zelle) im Durchschnitt weniger als 0,25 ms.

In den reifen Embryo und frisch geschlüpften Larven, die dorsalen motorischen Neurons Bevölkerung unterliegt begrenzter Aufnahme. Neuronale soma Aufnahmen offenbaren ganze Zelle Kapazität im Bereich 1,8-2,5 pF (2,0 pF Durchschnitt), Vorwiderstand von 40-60 MOhm und Eingangswiderstand von ~ 5 GOhm (Baines und Bate, 1998; Featherstone et al 2005). Diese Zellen wachsen deutlich in Größe und Komplexität während der embryonalen Reifung, und dieses Wachstum setzt sich während Larvalentwicklung. Im dritten instars ist Ganzzell Kapazität 17-20 pF, Vorwiderstand ist 25-37 MOhm und Eingangswiderstand Durchschnitt ~ 900 MOhm (Rohrbough und Broadie, 2002; Richard Baines, persönliche Mitteilung). Ionic Leitwerte der gesamten Entwicklung zu erhöhen, aber die Stromdichte (pA / pF) bleibt bemerkenswert konstant. In den reifen Embryonen, synaptische Ströme durchschnittliche 75-100pA in der Amplitude, wobei sowohl eine schnelle ESC Veranstaltungen und verlängerte Ströme von durchschnittlich ca. 500 ms (Baines und Bate, 1998; Featherstone et al 2005). In Embryonen, wodurch diese anhaltende Ereignisse durchschnittlich 3-5 pro min, bis ~ 20 pro min in der ersten Larvenstadium (Richard Baines, persönliche Mitteilung). Beachten Sie, dass die morphologische Komplexität und Eigenschaften der Membran von Nervenzellen Drosophila es praktisch unmöglich, richtig Voltage-Clamp viel von der Zelle über den Soma macht. Man sollte daher zu interpretieren Aufnahmen mit Sorgfalt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Elektrophysiologische Ableitungen von Drosophila Embryonen erfordert die manuelle Manipulation und Präparation. Die Gesundheit der Vorbereitung und konsequente Qualität der Aufnahmen, hängt von einer in der Lage, schnell und sauber vorbereiten fragile embryonalen Gewebe für die Aufnahme, und führen Sie dann das Experiment. Experimentatoren sollten in beiden embryonalen Dissektionen und Patch-Clamp-Elektrophysiologie beherrschen, bevor Sie beides auf einmal anzugehen.

Die Aufnahmen können in eine von mehreren Varianten des "modifizierten Standard" oder "Hämolymphe-like" (HL) Salinen durchgeführt werden. Die wichtigsten Unterschiede zwischen diesen beiden Kochsalzlösung Klassen 1) Na +-Konzentration (120-135 mm Standard-vs 70 mM HL) und 2) Mg 2 +-Konzentration (4 mM Standard vs 20 mM HL). Der große Vorteil des hohen Na +-Konzentration in der Standard-Lösung ist es, Action-Potential Ausbreitung und damit die Aufrechterhaltung eines normalen, gemusterte synaptischen Übertragung zu erleichtern. Die HL Salinen unterdrücken Action-Potential vermittelte synaptische Übertragung. Der Unterschied in der Mg 2 +, die spannungsabhängigen Calcium-Kanäle blockiert, ändert sich die Amplitude der synaptischen Übertragung und verschiebt die Ca 2 +-Abhängigkeit Bereich nach oben in die HL Salinen (Stewart et al. 1994). HL Salinen zeigen also deutlich niedriger synaptischen Übertragung Amplituden zu einem bestimmten [Ca 2 +]. Eine sorgfältige Kontrolle der Osmolarität eliminiert zellulären Vakuolisierung in beiden Salinen und Morphologie erscheint ebenso gut in entweder Kochsalzlösung erhalten. Da weder Kochsalzlösung repliziert tatsächlichen Hämolymphe, sollte die Auswahl einer Kochsalzlösung die Bedürfnisse der Frage untersuchten reflektieren.

Es gibt mehrere wichtige Richtlinien zum Erfolg der embryonalen Aufnahmen zu maximieren. Erstens nimmt die Fähigkeit zur erfolgreichen Form Gigaohm Dichtungen an embryonalen Muskel mit Entwicklungsstörungen Alter. Dies dürfte in erster Linie auf die Entwicklung der Basalmembran um die Reifung Muskeln. Um dem entgegenzuwirken, ist länger Kollagenasebehandlung (1-2 min) erforderlich. Allerdings muss darauf geachtet werden, da diese verlängert enzymatische Behandlung schnell Kompromiss wird der Muskel Bindung an den Körper Wand, und kann leicht an Muskel-Ablösung führen. Eine Regel, die wir gefunden haben, wirksam ist es, die Enzymbehandlung auf ~ 50% der Zeit, dass nachweisbar Muskel Ablösung Ursachen zu beschränken. Zweitens ist es wichtig, dass der Nerv einen festen Sitz in der Saug-Elektrode für eine ausreichende Stimulation hat; zu locker und die Stimulation nicht zu eng und es ist nicht möglich, eine ausreichende Durchschneidung des Nerven zu stimulieren. Nach unserer Erfahrung ist dies definitiv der größte einzelne Beschränkung auf erfolgreiche NMJ Aufnahme. Die entsprechenden Durchmesser für die Saugelektrode muss empirisch ermittelt werden, sondern sollten alle Anstrengungen unternommen, um eine gute Stimulationselektrode, die leicht einen ganzen Tag der Aufzeichnung angewandt werden, zu erhalten. Drittens für eine erfolgreiche Neurotransmitter und Zulassungsanträge für Arzneimittel, die NMJ, ist es wichtig, sich mit Synapse Platzierung. Mit Erfahrung kann die stereotype Endungen leicht mit DIC-Optik zu finden. Für den Anfänger kann Nervenendigungen in den Embryo mit membranpermeablen fluoreszierenden Mitochondrien Farbstoffe wie Rhodamin 123 oder 4-Di-2-Asp (; Broadie und Bate, 1993a Yoshikami und Okun, 1984) aufgedeckt werden. Die seziert Embryo wird einfach an den Farbstoff (5mm, 5 Min.) und überschüssiger Farbstoff mit mehreren Wäschen von Kochsalzlösung entfernt ausgesetzt. Die Zubereitung wird dann mit einem Auflicht-Fluoreszenz Befestigung und entsprechende Filter angesehen. Ähnliche Ansätze nutzen können transgenen GFP-Konstrukte Kennzeichnung der embryonalen Synapse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

KB wird durch NIH GM54544 unterstützt.

References

  1. Aravamudan, B., Fergestad, T., Davis, W. S., Rodesch, C. K., Broadie, K. Drosophila UNC-13 is essential for synaptic transmission. Nat. Neurosci. 2, 965-971 (1999).
  2. Auld, V. J., Fetter, R. D., Broadie, K., Goodman, C. S. Gliotactin a novel transmembrane protein on peripheral glia, is required to form the blood-nerve barrier in Drosophila. Cell. 81, 757-767 (1995).
  3. Baines, R. A., Bate, M. Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo. J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).
  4. Baines, R. A., Robinson, S. G., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Postsynaptic expression of tetanus toxin light chain blocks synaptogenesis in Drosophila. Curr. Biol. 9, 1267-1270 (1999).
  5. Baines, R. A., Uhler, J. P., Thompson, A., Sweeney, S. T., Bate, M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J. Neurosci. 21, 1523-1531 (2001).
  6. Bate, M. The embryonic development of the larval muscles in Drosophila. Development. 110, 791-804 (1990).
  7. Bate, M., Martinez Arias, A. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. Vol. I, II (1993).
  8. Baumgartner, S., JT, L. ittleton, Broadie, K., MA, B. hat, Harbecke, R., JA, L. engyel, Chiquet-Ehrismann, R., Prokop, A., Bellen, H. J. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87, 1059-1068 (1996).
  9. AH, B. rand Perrimon N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  10. Brand, A. GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system. Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).
  11. Broadie, K. Electrophysiological Approaches to the Neuromusculature. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 273-296 (2000).
  12. Broadie, K., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 144-166 (1993a).
  13. Broadie, K., Bate, M. Development of larval muscle properties in the embryonic myotubes of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 167-180 (1993b).
  14. Broadie, K., Bate, M. Activity-dependent development of the neuromuscular synapse during Drosophila embryogenesis. Neuron. 11, 607-619 (1993c).
  15. Broadie, K., Bate, M. Synaptogenesis in the Drosophila embryo: innervation directs receptor synthesis and localization. Nature. 361, 350-353 (1993d).
  16. Broadie, K., Bellen, H. J., DiAntonio, A., Littleton, J. T., Schwarz, T. L. The absence of Synaptotagmin disrupts excitation-secretion coupling during synaptic transmission. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10727-10731 (1994).
  17. Broadie, K., Prokop, A., Bellen, H. J., O'Kane, C. J., Schulze, K. L., Sweeney, S. T. Syntaxin and Synaptobrevin function downstream of vesicle docking in Drosophila. Neuron. 15, 663-673 (1995).
  18. Broadie, K., Rushton, E., Skoulakis, E. C. M., Davis, R. L. eonardo a 14-3-3 protein involved in learning, regulates presynaptic function. Neuron. 19, 391-402 (1997).
  19. Broadie, K., Skaer, H., Bate, M. Whole-embryo culture of Drosophila: development of embryonic tissues in vitro. Roux's Arch. Develop. Biol. 201, 364-375 (1992).
  20. Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin. (1985).
  21. Deitcher, D. L., Ueda, A., Stewart, B. A., Burgess, R. W., Kidokoro, Y., Schwartz, T. L. Distinct requirements for evoked and spontaneous release of neurotransmitter are revealed by mutations in the Drosophila gene neuronal-synaptobrevin. J. Neurosci. 18, 2028-2039 (1998).
  22. Featherstone, D. E., Broadie, K. Surprises from Drosophila: genetic mechanisms of synaptic development and plasticity. Brain Res. Bull. 53, 501-511 (2000).
  23. Featherstone, D. E., Rushton, E. M., Hilderbrand-Chae, M., Phillips, A. M., Jackson, F. R., Broadie, K. Presynaptic glutamic acid decarboxylase is required for induction of the postsynaptic receptor field at a glutamatergic synapse. Neuron. 27, 71-84 (2000).
  24. Featherstone, D. E., Davis, W. S., Dubreuil, R. R., Broadie, K. Drosophila alpha- and beta-spectrin mutations disrupt presynaptic neurotransmitter release. J Neurosci. 21, 4215-4224 (2001).
  25. Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release. Nat Neurosci. 5, 141-146 (2002).
  26. Featherstone, D. E., Rushton, E., Rohrbough, J., Liebl, F., Karr, J., Sheng, Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. An essential Drosophila glutamate receptor subunit that functions in both central neuropil and neuromuscular junction. J. Neurosci. 25, 3199-3208 (2005).
  27. Fergestad, T., Davis, W. S., Broadie, K. The stoned proteins regulate synaptic vesicle recycling in the presynaptic terminal. J Neurosci. 19, 5847-5860 (1999).
  28. Fergestad, T., Wu, M. N., Schulze, K. L., Lloyd, T. E., Bellen, H. J., Broadie, K. Targeted mutations in the syntaxin H3 domain specifically disrupt SNARE complex function in synaptic transmission. J Neurosci. 21, 9142-9150 (2001).
  29. Fergestad, T., Broadie, K. Interaction of stoned and synaptotagmin in synaptic vesicle endocytosis. J Neurosci. 21, 1218-1227 (2001).
  30. Goodman, C. S., Doe, C. Q. Embryonic Development of the Drosophila Central Nervous System. In The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 1131-1206 (1993).
  31. Harrison, S. D., Broadie, K., Goor, J. vande, Rubin, G. M. Mutations in the Drosophila Rop gene suggest a function in general secretion and synaptic transmission. Neuron. 13, 555-566 (1994).
  32. Huang, F. D., Woodruff, E., Mohrmann, R., Broadie, K. Rolling blackout is required for synaptic vesicle exocytosis. J. Neurosci. 26, 2369-2379 (2006).
  33. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
  34. Jan, L. Y., Jan, Y. N. L-glutamate as an excitatory transmitter at the Drosophila larval neuromuscular junction. J. Physiol. 262, 215-236 (1976b).
  35. Kidokoro, Y., Nishikawa, K. I. Miniature endplate currents at the newly formed neuromuscular junction in Drosophila embryos and larvae. Neuroscience Research. 19, 143-154 (1994).
  36. Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. J. Neurosci. 17, 9642-9655 (1997).
  37. Mohrmann, R., Matthies, H. J., Woodruff III, E., Broadie, K. Stoned B mediates sorting of integral synaptic vesicle proteins. Neuroscience. 153, 1048-1063 (2008).
  38. Nishikawa, K. I., Kidokoro, Y. Junctional and extrajunctional glutamate receptor channels in Drosophila embryos and larvae. J. Neurosci. 15, 7905-7915 (1995).
  39. Renden, R., Berwin, B., Davis, W., Ann, K., Chin, C. T., Kreber, R., Ganetzky, B., Martin, T. F., Broadie, K. Drosophila CAPS is an essential gene that regulates dense-core vesicle release and synaptic vesicle fusion. Neuron. 31, 421-437 (2001).
  40. Rohrbough, J., Broadie, K. Electrophysiological Analysis of Synaptic Transmission in Central Neurons of Drosophila Larvae. J. Neurophysiol. 88, 847-860 (2002).
  41. Rohrbough, J., Rushton, E., Palanker, L., Woodruff, E., Matthies, H. J., Acharya, U., Acharya, J. K., Broadie, K. Ceramidase regulates synaptic vesicle exocytosis and trafficking. J. Neurosci. 24, 7789-7803 (2004).
  42. Rohrbough, J., Rushton, E., Woodruff, E. 3rd, Fergestad, T., Vigneswaran, K., Broadie, K. Presynaptic establishment of the synaptic cleft extracellular matrix is required for postsynaptic differentiation. Genes Dev. 21, 2607-2628 (2007).
  43. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J. Comp. Physiol.. A175, 179-191 (1994).
  44. Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14, 341-351 (1995).
  45. Tsunoda, S., Salkoff, L. Genetic analysis of Drosophila neurons: Shal, Shaw, and Shab encode most embryonic potassium currents. J. Neurosci. 15, 1741-1754 (1995).
  46. Ueda, A., Kidokoro, Y. Longitudinal body wall muscles are electrically coupled across the segmental boundary in the third instar larva of Drosophila melanogaster. Invertebrate Neuroscience. 1, 315-322 (1996).
  47. Wu, C. F., Haugland, F. N. Voltage clamp analysis of membrane currents in larval muscle fibers of Drosophila. J. Neurosci. 5, 2626-2640 (1985).
  48. Yan, Y., Broadie, K. In vivo assay of presynaptic microtubule cytoskeleton dynamics in Drosophila. J Neurosci Methods. 162, 198-205 (2007).
  49. Yoshikami, D., Okun, L. Staining of living presynaptic nerve terminals with selective fluorescent dyes. Nature. 310, 53-56 (1984).
  50. Zagotta, W. N., Brainard, M. S., Aldrich, R. W. Single-channel analysis of four distinct classes of potassium channels in Drosophila muscle. J. Neurosci. 8, 4765-4779 (1988).
  51. Zhang, Y. Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. A living synaptic vesicle marker: synaptotagmin-GFP. Genesis. 34, 142-145 (2002).

Tags

Neuroscience Ausgabe 27 Drosophila Embryo whole-cell Patch-Clamp- Muskel- Neuron neuromuskulären Synapse Synapsen
Elektrophysiologische Aufzeichnung in der<em> Drosophila</em> Embryo
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Chen, K., Featherstone, D. E.,… More

Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo. J. Vis. Exp. (27), e1348, doi:10.3791/1348 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter