Registrazione elettrofisiologiche in Drosophila Embryo

Summary

Le registrazioni elettrofisiologiche da

Abstract

Drosophila è un modello premier genetico per lo studio sia dello sviluppo embrionale e funzionale delle neuroscienze. Tradizionalmente, questi campi sono abbastanza isolati gli uni dagli altri, con storie in gran parte indipendenti e le comunità scientifiche. Tuttavia, l'interfaccia tra questi campi di solito disparati sono i programmi di sviluppo funzionali alla base dell'acquisizione di proprietà elettriche di segnalazione e la differenziazione delle sinapsi chimici funzionali durante le fasi finali della formazione circuito neurale. Questa interfaccia è un'area estremamente importante per le indagini. In Drosophila, queste fasi di sviluppo funzionale si verificano durante un periodo di <8 ore (a 25 ° C) durante l'ultimo terzo di embriogenesi. Questo periodo tardo di sviluppo è stato a lungo considerato intrattabile a causa indagine per la deposizione di un duro, cuticola impermeabile epidermica. Un passo avanti è stato anticipato l'applicazione di acqua-polimerizzazione colla chirurgica che può essere applicata a livello locale per la cuticola per permettere la dissezione controllato di fase avanzata di embrioni. Con una incisione longitudinale dorsale, l'embrione può essere posato piatto, esponendo il cordone ventrale dei nervi e muscolatura della parete del corpo di indagine sperimentale. Whole-cell patch-clamp tecniche possono essere impiegate per registrare da neuroni individualmente identificabili e muscoli somatici. Queste configurazioni di registrazione sono stati utilizzati per monitorare l'aspetto e la maturazione delle correnti ioniche e propagazione del potenziale d'azione sia in neuroni e muscoli. Mutanti genetici che influenzano le proprietà elettriche sono stati caratterizzati per rivelare la composizione molecolare dei canali ionici e dei relativi complessi di segnalazione, e per iniziare l'esplorazione dei meccanismi molecolari del differenziamento funzionale. Un focus particolare è stato l'assemblaggio delle connessioni sinaptiche, sia nel sistema nervoso centrale e la periferia. Il glutamatergici giunzione neuromuscolare (NMJ) è più accessibile ad una combinazione di imaging ottico e la registrazione elettrofisiologica. Un elettrodo di vetro di aspirazione è usato per stimolare il nervo periferico, con eccitatorio giunzione corrente (EJC), le registrazioni effettuate nella tensione muscolare bloccato. Questa configurazione di registrazione è stato utilizzato per tracciare la differenziazione funzionale della sinapsi, e traccia l'aspetto e la maturazione di proprietà presinaptico rilascio di glutammato. Inoltre, le proprietà postsinaptici possono essere analizzati in maniera indipendente tramite iontoforesi o applicazione di una pressione di glutammato direttamente sulla superficie del muscolo, per misurare la comparsa e la maturazione dei campi recettori del glutammato. Così, sia gli elementi pre-e post-sinaptici possono essere monitorate separatamente o in combinazione durante la sinaptogenesi embrionale. Questo sistema è stato molto utilizzato per isolare e caratterizzare mutanti genetici che impedire la formazione embrionale sinapsi, e quindi svelare i meccanismi molecolari che regolano la specificazione e differenziazione delle connessioni di sinapsi e funzionali, le proprietà di segnalazione sinaptica.

Protocol

Parte 1: Attrezzature e Forniture

1. Registrazione elettrofisiologica da embrioni di Drosophila richiede prima padronanza di tecniche di dissezione embrionali, che sono descritte in un altro video Giove.
2. Registrazione elettrofisiologica da embrioni di Drosophila utilizza standard di configurazioni di patch clamp registrazione. Attrezzature di patch clamp registrazione e del software adatto a molte altre preparazioni è adatto anche per la registrazione da embrioni di Drosophila. Perché gli embrioni di Drosophila sono incollati a una scivolata di copertura durante la dissezione, la camera di registrazione dovrebbe accettare coprioggetto. Lo spessore della preparazione e il modo in cui è montato il coprioggetto richiede un microscopio in posizione verticale con un eccellente ottica DIC e una lente lunga distanza di lavoro.
3. Due tipi di soluzioni bagno vengono utilizzati per la registrazione elettrofisiologica; 1) "standard" (Jan e Jan, 1976a) o "modificato standard" (Broadie, 2000) saline, basato su soluzioni comunemente usati per la registrazione nei sistemi di altri invertebrati, e 2) "emolinfa-like" (HL) saline (Stewart et al 1994), un compromesso tra la soluzione salina standard e le concentrazioni ioniche misurate nella emolinfa Drosophila. Va notato che nessuna di queste saline imitano con precisione le concentrazioni ioniche misurate nella emolinfa, che sono sfavorevoli per la registrazione (Broadie, 2000). Standard di soluzione salina contiene (in mm): 135 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl _2, 1.8 CaCl2, 72 saccarosio, 5 TES, pH 7,2.

Parte 2: Configurazione di registrazione

1. Per gli esperimenti fisiologici, la preparazione embrione sezionato è posto in una piccola camera di registrazione plexiglass (<0,5 ml) e visualizzati in luce trasmessa con un microscopio composto verticale dotato di contrasto differenziale di interferenza (Nomarski) ottica e una lunga distanza di lavoro 40-100X ( generalmente 40X) acqua-immersion obiettivo (Broadie e Bate, 1993a). Le registrazioni sono fatte tipicamente sotto della temperatura ambiente (16-22 ° C), con difficoltà crescente a temperature elevate (22 + ° C). Noi raggiungere questo obiettivo il raffreddamento della sala, piuttosto che il raffreddamento del preapartion.
2. Pipette di patch può essere tirato da una varietà di fibra pieni bicchieri (ad esempio in vetro borosilicato, 1 mm di diametro esterno) e le punte devono essere lucidate a fuoco resistenze finale di 5-10 MW. Un cloruro-argento filo di terra si trova nel bagno. I segnali sono amplificati utilizzando una patch-clamp amplificatore (ad es Axopatch-1D, Axon Instruments), filtrato con un 8 poli del filtro di Bessel a 2-10 Hz, e due campionati on-line o archiviati digitalmente per un'analisi successiva.
3. Tradizionali patch-clamp registrazioni sono più spesso viene eseguito a 18 ° C con pipette cerotto tirato da fibra di vetro riempiti borosilicato (calore suggerimenti lucidato a id ~ 1 micron). Record corrente sono costituiti da fibre muscolari multinucleate identificato in voltage-clamp (standard tenendo potenzialità da -60 a -80 mV) (Broadie e Bate, 1993a-d; Broadie et al, 1997;.. Fergestad et al, 1999; Featherstone et al ., 2000). La pipetta soluzione cerotto contiene (in mm): 120 KCl, 20 KOH, 4 MgCl _2, 0,25 CaCl _2, 5 EGTA, 4 Na ₂ ATP, 36 Saccarosio, e 5 TES, tamponata a pH 7,2. Elettrodi di registrazione sono tornati pieni.

Parte 3: Registrazione muscolare

1. In linea di principio, qualsiasi muscolo embrionale può essere registrato da in questa preparazione. In pratica, la maggior parte di registrazione si è concentrata sul grande, i muscoli ventrali longitudinali nel più interno strato muscolare (Bate, 1990; Broadie e Bate, 1993a-c). Record sono stati compiuti anche dai muscoli dorsali e laterali di questo strato muscolare (Kidokoro e Nishikawa, 1994; Auld et al 1995;. Nishikawa e Kidokoro, 1995;. Baumgartner et al 1996). Tuttavia, la maggior esperimenti attenzione sul gruppo di quattro longitudinale, dei muscoli ventrali (6,7,12,13), in particolare del muscolo 6 nel ventre anteriore (A2-A3).
2. Nessun trattamento enzimatico è richiesto prima della registrazione muscolare negli embrioni giovani (<16 ore AEL). Tuttavia, una guaina del muscolo si sviluppa nell'embrione più tardi (> 16 ore AEL) e deve essere rimosso con collagenasi (collagenasi di tipo IV, 1 mg / ml in cationi bivalenti senza soluzione salina, 0,5-2 min a RT) prima della registrazione patch. In seguito a trattamento enzimatico, resistenze sigillo sul muscolo sono tipicamente> 1 GΩ.
3. Patch-clamp registrazioni possono essere effettuate dai muscoli embrionale utilizzando una serie di tecniche standard (Broadie e Bate 1993a-c; Broadie et al 1994, 1995, 1997;. Nishikawa e Kidokoro, 1995). Qualsiasi standard di patch-clamp variazioni - cell-attached, dentro-fuori, fuori-fuori - può essere impiegato per registrare l'attività singolo canale nel muscolo o isolate macchie membrana muscolare. Singola attività dei recettori del glutammato canale (~ 12 pA a -60 mV) sono generalmente osservabili sulla fase di discesa di correnti spontanee giunzione eccitatori (sEJCs) registrate in modalità cellula intera.
4. La maggior parte di registrazione è svolta in tutto celle config registrazionegurazione, raggiunto facilmente dalla cellula-attached Stato con un leggero vuoto o un elettrico "buzz". I muscoli possono essere registrati da entrambi in voltage-clamp (tipico potenzialità detenzione di -60 a -80 mV) o in corrente-clamp configurazioni. Muscoli più giovani embrioni (<13 ore AEL) non può essere efficacemente tensione bloccato a causa di aggancio estesa tra i miotubi embrionali (Broadie e Bate, 1993a), questo di solito non è un problema durante dopo (14 + ore AEL) stadi di sviluppo (Ueda e Kidokoro, 1996).
5. Nistatina-perforata patch-clamp di registrazione può essere utilizzata per verificare i record ottenuti con standard di cellule intere tecniche (Broadie e Bate, 1993a). La soluzione di perforazione è composta come segue: 10 mg Pluronic F-127 (Molecular Probes p-1572) viene disciolto in 20 ml di DMSO, nistatina e 10 mg disciolti in questa soluzione per rendere il brodo. 100 l di stock si aggiunge a 5 ml di soluzione di pipetta filtrata per rendere la soluzione di registrazione. A cellula intera correnti sono di solito ottenute <3 minuti dopo la formazione di tenuta. Resistenza in serie è notevolmente aumentata nella maggior parte dei casi, e le cellule in grado di sviluppare una corrente maggiore dispersione (Broadie e Bate, 1993a).
6. Il tutto a cellule voltaggio-dipendenti attuali embrionale maturi (e larve) del muscolo è composto da cinque componenti importanti (Wu e Haugland, 1985; Zagotta et al 1988; Broadie e Bate, 1993b.): Un calcio verso l'interno corrente (I _Ca) e quattro le correnti di potassio verso l'esterno (Tsunoda e Salkoff, 1995), tra cui due veloci, le correnti inattivando, voltaggio-dipendenti (I _A) e calcio-dipendente (I _CF), e due in ritardo, non inattivando correnti voltaggio-dipendenti (I _K) e calcio-dipendente (I _CS). Ion-sostituzione esperimenti possono essere usati per analizzare queste correnti da tutta risposta delle cellule durante voltage-clamp (Broadie e Bate, 1993b).

Parte 4: stimolazione giunzione neuromuscolare e Registrazione

1. Il metodo più comune e affidabile di stimolazione NMJ utilizza un elettrodo di vetro di aspirazione sul nervo periferico segmentale. Elettrodi di aspirazione può essere tirato da una varietà di fibra di vetro riempiti di elettrodi (1-1.5 micron di diametro esterno) e dovrebbe essere il fuoco lucidato per ottenere la configurazione desiderata (~ 5 micron di diametro interno). Un segmento di piccole dimensioni (<50 micron) del nervo motore appropriato segmentale è disegnato nella pipetta di aspirazione delicata per formare una tenuta ermetica.
2. E 'comune per stimolare il nervo intatto da disegno in un ciclo del nervo in prossimità del punto di uscita SNC. Questo approccio consente la stimolazione facile della preparazione intatto, ma ha lo svantaggio che spontanea SNC-evocata attività può verificarsi sovrapposti sul paradigma stimolo applicato. Un'alternativa è quella di stimolare il nervo motore taglio. Ciò può essere ottenuto se il sistema nervoso centrale viene rimossa, anche se questa procedura tende ad allungare il nervo e può causare danni. Il nervo può anche essere tagliato con un microelettrodo di vetro affilato, ma questa procedura è noioso e difficile. Si consiglia di effettuare registrazioni dalla preparazione intatto.
3. La stimolazione può essere applicata con una varietà di paradigmi. Stimolazione breve (0,2-1 msec) funziona meglio e l'intensità di stimolazione (di solito 1-5 V) dipenderà dalla configurazione di aspirazione e deve essere determinato sperimentalmente per ogni cella. Suprathreshold stimolazione del nervo motore è migliore ottenuto impostando la forza stimolo leggermente superiore (1-2 volt) soglia. Evocate risposte NMJ sono visualizzate da patch-bloccato muscolare come descritto sopra. L'artefatto shock può essere sostanzialmente ridotto con l'uso di un terreno isolato virtuale.
4. Un'alternativa meno affidabile per lo standard stimolazione del nervo elettrodo di aspirazione è la stimolazione diretta del sistema nervoso centrale (Nishikawa e Kidokoro, 1995). Un microelettrodo riempito con 3-4 M KCl (o KAC) viene inserito nel mezzo del ganglio ventrale e impulsi positivi di circa 2 microampere in intensità e ~ 2 msec di durata sono consegnati (Dietcher et al. 1998). La punta dell'elettrodo deve essere nel neuropilo più vicina hemisegment in cui si desidera stimolazione. Trasmissione sinaptica è registrato nel patch-muscolo bloccato nella configurazione standard.
5. Il NMJ embrionale è accessibile a whole-cell patch-clamp registrazione per tutta la sua differenziazione. Per eccitatorio giunzionale corrente (EJC) le registrazioni, i segnali sono registrati con uno standard di patch-clamp amplificatore, filtrata (di solito a 1-2 KHz), convertito in un segnale digitale tramite un convertitore analogico-digitale di interfaccia, e ha acquisito con un computer utilizzando software appropriato.

Parte 5: giunzione neuromuscolare applicazioni chimiche e farmaci

1. Qualsiasi piccola, molecola carica può essere efficacemente iontophoresed sul NMJ embrionali (Aravamudan et al, 1999;. Fergestad et al 1999, 2001). Pipette iontoforesi può essere tirato per configurazioni specifiche, con applicazioni per periodi variabili, utilizzando impulsi di corrente negativa o positiva. È di vitale importanza per evitare perdite tra pulses con un supporto appropriato opposte correnti (Broadie et al 1993d;. Featherstone et al 2002, 2005;.. Rohrbough et al 2007). L'entità di questo sostegno corrente varia con la configurazione pipetta e devono essere determinati sperimentalmente.
2. Molti esperimenti sono stati fatti con il neurotrasmettitore NMJ, L-glutammato (Jan e Jan, 1976b), utilizzando una soluzione 100mM magazzino (sale monosodico; pH 8-9) (Broadie e Bate, 1993c). Pipette alta resistenza iontoforesi (100-200 MΩ) sono stati utilizzati per recettori del glutammato (GluR) mappatura (Broadie e Bate, 1993d), pipette e minore resistenza (20-50 MΩ) utilizzato per stimare la risposta totale GluR (Broadie et al. 1995, 1997; Featherstone et al 2002, 2005;. Rohrbough et al 2007).. Impulsi brevi (0,1-1 ms) di corrente negativo (~ 10 nA) funzionano bene, con un piccolo supporto corrente positiva per evitare perdite.
3. Non carica e molecole cariche può essere applicato con espulsione di pressione (Fergestad e Broadie, 2001;. Featherstone et al 2001). Per l'applicazione, una pipetta espulsione di pressione (<5 micron di diametro interno) contenente la soluzione si trova nei pressi (<10 micron) dal terminale nervoso. La soluzione a essere espulso può essere applicato utilizzando un picospritzer (psi 5-10) o altra fonte di aria pressurizzata (Featherstone et al., 2002). Durante gli esperimenti prolungati, la camera di registrazione (volume <0,5 ml) deve essere continuamente perfuso (0,1 - 0,2 ml / sec) con soluzione salina normale bagno.
4. Molti esperimenti sono stati fatti con soluzione salina iperosmotico per innescare la fusione delle vescicole sinaptiche (Broadie et al 1995;. Aravamudan, et al, 1999;. Fergestad et al, 1999;.. Featherstone, et al, 2000, 2002). Altri esperimenti sono stati fatti con le tossine, come argiotoxin 636 contro i recettori del glutammato e nero vedova latroinsectotoxin veleno di ragno che contiene (Broadie et al. 1995).

Parte 6: Tecniche di imaging complementari giunzione neuromuscolare Vital

1. Cinetica delle vescicole sinaptiche possono essere monitorati con coloranti fluorescenti lipofili stryl (Fergestad e Broadie, 2001;. Rohrbough et al 2004). La distribuzione delle vescicole possono essere osservate direttamente, e tassi di endocitosi e di esocitosi misurato. Diverse varianti sono state fatte con diverse proprietà fluorescente (FM1-43, fluoresceina-come; FM4-64, rodamina-like). Le modifiche del colorante originale hanno prodotto i prodotti alterati con proprietà idrorepellenti, e quindi con cinetica dilavamento diversi: ad esempio, FM2-10 dissocia molto più velocemente dalla membrana.
2. Per etichettare il NMJ embrionale con coloranti stryl, 10 mM FM1-43 può essere caricato per 1-5 minuti con elevato di potassio extracellulare (50-90 mm) (Fergestad e Broadie, 2001). Un approccio più fisiologico può essere ottenuto attraverso la stimolazione di un elettrodo di aspirazione del nervo. I preparativi sono poi lavati ripetutamente a Ca ^{2 +} senza tampone per 5 minuti, e conservati fluorescenza (in rappresentanza tinti vescicole sinaptiche) misurata. Per misurare esocitosi, si può scaricare il colorante utilizzando potassio elevati o la stimolazione elettrica dei nervi.
3. Proteine ​​di fusione con varianti GFP sono stati prodotti permettendo l'etichettatura multicolore del NMJ embrionale sinapsi (Brand, 1999;. Zhang et al 2002). Molti transgenici che esprimono GFP-tagged proteine ​​sono disponibili anche i marcatori di membrana generale (ad esempio mCD8-GFP), marcatori postsinaptica (ad esempio Shaker-GFP, GluRIIA-GFP), del citoscheletro (ad esempio actina-GFP, moesina-GFP, tubulina-GFP) e mitocondriale marcatori (es. citocromo C-GFP) e marcatori delle vescicole sinaptiche (ad esempio synaptobrevin-GFP, synaptotagmin-GFP;. Zhang et al, 2002).
4. Reporter GFP etichetta comparti che sono molto dinamici e possono essere utilizzati per valutare le caratteristiche di sviluppo o fenotipi mutanti (Featherstone e Broadie, 2000). Sbiancamento e poi osservare il recupero della fluorescenza (FRAP) ha dimostrato di essere fattibile, almeno a Drosophila larvale NMJ (Zhang et al, 2002;. Yan e Broadie, 2007). Una parola di cautela, però: alcuni di questi marcatori non completamente salvataggio mutanti nulla e può anche alterare NMJ normale fisiologia.

Parte 7: Registrazione da Central motoneuroni

1. Molti neuroni embrionali possano essere identificati individualmente in base alla posizione soma e la morfologia di proiezione (Bate e Martinez-Arias, 1993; Goodman e Doe, 1993; Landgraf et al 1997). Inoltre, il sistema GAL4/UAS (Brand e Perrimon, 1993) può avere come bersaglio l'espressione GFP di visualizzare le popolazioni dei neuroni identificabili (Baines et al., 1998). Studi di registrazione fino ad oggi si sono concentrati su un gruppo di cinque superficiali, dorsali neuroni nel midollo embrionale nervo ventrale (VNC), quattro neuroni motori (ACC e RP1-4) ed un interneurone PCC (Baines et al, 1998, 1999, 2001. ; Rohrbough e Broadie, 2002; Featherstone et al 1995)..
2. Corpi cellulari dei neuroni identificati sono accessibili a whole-cell patch-clamp elettrodi di registrazione. La guaina VNC neurolemma deve prima essere rimosso con breve trattamento con focale della proteasi (Baines e Bate, 1998; Baines et al, 1999;. Rohrbough e Broadie, 2002). Dorsale corpi cellulari neuronali sono esposti con un grande diametro (~ 20 micron) pipetta patch che contiene 0,5-1% della proteasi (tipo XIV (Sigma) in soluzione salina di registrazione). La guaina SNC materiale è tratto dal aspirazione nella punta della pipetta per 1-2 minuti fino a quando la rottura della guaina (Featherstone et al. 1995). Per confermare l'identità cellulare durante le registrazioni, lucifer giallo (sale dipotassico, 1-2 mg / ml) può essere aggiunto alla soluzione di patch per visualizzare la posizione e morfologia della cellula.
3. Normale a cellula intera tensione e corrente-clamp registrazioni possono essere effettuate (Rohrbough e Broadie, 2002;. Featherstone et al, 2005). Le saline di registrazione esterno contiene (in mm): 140 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl _2, 4 MgCl _2, 5 HEPES, 10 saccarosio, 2 NaOH (pH 7,2). La soluzione cerotto contiene (in mm): 140 K-Acetato, 2 MgCl _2, 0,1 CaCl2, 10 HEPES, 1,1 EGTA, 2 Na2-ATP, ~ 6 KOH (pH 7,2). Voltage-clamp registrazioni vengono effettuate presso i potenziali possesso di -60 mV a 18 ° C. Tipico potenzialità non aggiustato di riposo sono nella gamma di -45 a -65 mV (-52,9 ± 7,5 mV, media ± DS, n = 78).
4. Test disponibili rivelano correnti ioniche voltaggio-dipendenti (Baines e Bate, 1998), potenziali d'azione ripetitivi, sinapticamente attività mediata e agonista-dipendenti delle risposte (Baines et al., 2001). Ingresso Synaptic al motore neuroni è registrato sotto forma di due veloci AP-mediata veloci correnti sinaptica eccitatoria (CES), e periodici episodi, sostenuti (fino a 1 sec la durata) di input eccitatori che si verificano più volte o più al minuto (Baines et al ., 1999; Baines et al, 2001)..
5. Soma delle cellule rispondono a acetilcolina iontophoretically applicata (ACh) e il trasmettitore inibitorio GABA (Baines e Bate, 1998;. Featherstone et al 2005). ACh può essere applicato iontophoretically al soma neuronale attraverso un microelettrodo forte contenente 100mM ACh in DH ₂ 0, a pH 4-5 a favore ionoforesi agonista di corrente positiva.

Rappresentante Risultati

Ventrale del muscolo longitudinale 6 è segmenti A2-A3 è il bersaglio più comunemente utilizzati per la registrazione (Broadie e Bate, 1993a-d; Harrison et al 1994;. Sweeney et al 1995;. Renden et al 2001;. Huang et al 2006.; Mohrmann et al. 2008). Nell'embrione maturo e appena nati larva di primo stadio (20-21 AEL ore a 25 ° C = cova), il muscolo 6 capacità cellula intera è del 25-30 pF, e le resistenze di ingresso 20-40 MΩ, cambia con l'età dello sviluppo. Massima NMJ gamma sinaptica correnti da decine di picoamps (13-14 ore AEL) per 1-2na (20-21 ore AEL), in rapido aumento in funzione dell'età. Misura diretta di glutammato-dipendenti correnti risposte resa massima di centinaia di picoamps (13-14 ore AEL) a 1.5-4NA appena prima della schiusa. Errori di resistenza in serie (totale attuale resistenza in serie X) sono di solito <5 mV, ma, in maturità, pre-cova embrioni, può essere alto come 10 + mV e quindi la resistenza di compensazione serie è consigliato. Muscoli embrionale con un diametro medio di 10-30 micron e lunghezza media di 40-80 micron, sembrano mostrare quasi ideale parametri morsetto spazio. Cellula morsetto costanti di tempo _(serie R _cellula XC) media inferiore a 0,25 msec.

Nell'embrione maturo e larve appena schiuse, la dorsale popolazione motoneurone è stata oggetto di registrazione più limitata. Registrazioni soma neuronale rivelare capacità cellule intere, nel range di 1,8-2,5 pF (2,0 pF media), la resistenza serie di 40-60 MΩ e la resistenza di ingresso di ~ 5 GΩ (Baines e Bate, 1998; Featherstone et al 2005). Queste cellule chiaramente crescere in dimensioni e complessità embrionale durante la maturazione, e questa crescita continua durante lo sviluppo larvale. In stadi terzo, capacità cellula intera è 17-20 pF, la resistenza serie è 25-37 MΩ e medie resistenza di ingresso ~ 900 MΩ (Rohrbough e Broadie, 2002; Richard Baines, comunicazione personale). Conduttanze ioniche aumentano durante lo sviluppo, ma la densità di corrente (pA / pF) rimane straordinariamente costante. Negli embrioni maturi, le correnti sinaptiche media 75-100Pa in ampiezza, con entrambi gli eventi rapida ESC e correnti prolungata media ~ 500 msec (Baines e Bate, 1998; Featherstone et al 2005). Negli embrioni, questi eventi sostenuta medio per 3-5 minuti, aumentando di circa 20 al minuto nel instar prima (Richard Baines, comunicazione personale). Si noti che la complessità morfologica e le proprietà della membrana della Drosophila neuroni rende praticamente impossibile per bloccare correttamente tensione gran parte della cellula al di là del soma. Si deve quindi interpretare le registrazioni con cura.

Discussion

Registrazione elettrofisiologica da embrioni di Drosophila richiede la manipolazione manuale e dissezione. La salute della preparazione, e la conseguente qualità delle registrazioni, dipende da un solo essere in grado di preparare rapidamente e ordinatamente i tessuti fragili embrionali per la registrazione, e quindi eseguire l'esperimento. Sperimentatori dovranno essere in grado in entrambe le dissezioni embrionale e di patch clamp elettrofisiologia prima di tentare di affrontare entrambi contemporaneamente.

Le registrazioni possono essere fatta in una delle diverse varianti del "modificato standard" o "emolinfa-like" (HL) saline. Le principali differenze tra queste due classi salina sono: 1) Na ⁺ concentrazione (120-135 mm standard vs 70 mm HL) e 2) Mg ^{2 +} concentrazione (4 mm standard vs 20 mM HL). Il principale vantaggio della alta concentrazione di Na ⁺ nella soluzione standard è quello di facilitare l'azione potenziale di propagazione e, quindi, il mantenimento della normale trasmissione sinaptica fantasia. Le saline HL sopprimere azione potenziale trasmissione sinaptica mediata. La differenza di Mg ^{2 +,} che blocca i canali voltaggio-dipendenti del calcio, altera l'ampiezza della trasmissione sinaptica e sposta la ^+-dipendenza verso l'alto gamma Ca ² nel saline HL (Stewart et al. 1994). HL saline quindi mostrare molto più basse ampiezze trasmissione sinaptica in un dato [Ca ^{2 +].} Attento controllo della osmolarità elimina vacuolizzazione cellulare in entrambe le saline, e la morfologia appare altrettanto ben conservati in soluzione salina. Dal momento che né salina replica emolinfa reale, la selezione di una soluzione salina dovrebbe riflettere le esigenze della questione in esame.

Ci sono diversi importanti linee guida per massimizzare il successo delle registrazioni embrionale. In primo luogo, la capacità di formare con successo foche gigaohm sul muscolo embrionale diminuisce con l'età dello sviluppo. Ciò è probabilmente dovuto principalmente allo sviluppo della membrana basale che circonda i muscoli stagionatura. Per contrastare questo, un trattamento più lungo collagenasi (1-2 minuti) è obbligatorio. Tuttavia, occorre fare attenzione, perché questo trattamento enzimatico allungato rapidamente compromesso di inserzione del muscolo alla parete del corpo, e può facilmente portare al distacco del muscolo. Una regola che abbiamo trovato efficace è quello di limitare il trattamento enzimatico per circa il 50% del tempo che provoca il distacco rilevabili muscolare. In secondo luogo, è fondamentale che il nervo ha una perfetta aderenza al aspirazione elettrodo per la stimolazione adeguata; troppo sciolti e la stimolazione non riesce, troppo stretto e non è possibile stimolare una sezione adeguata del nervo. Nella nostra esperienza, questo è sicuramente il più grande limitazione singolo di successo di registrazione NMJ. Il diametro appropriato per l'elettrodo di aspirazione deve essere empiricamente determinato, ma ogni sforzo dovrebbe essere fatto per preservare un elettrodo buona stimolazione, che può facilmente essere utilizzato per un'intera giornata di registrazione. In terzo luogo, per il successo delle applicazioni neurotrasmettitore e droga al NMJ, è fondamentale per acquisire familiarità con il posizionamento delle sinapsi. Con l'esperienza, le terminazioni stereotipati possono essere facilmente trovati con ottica DIC. Per il principiante, terminazioni nervose in embrione può essere rivelato con membrana mitocondriale permeanti coloranti fluorescenti, come rodamina 123 o 4-Di-2-Asp (Yoshikami e Okun, 1984; Broadie e Bate, 1993a). L'embrione sezionato è semplicemente esposto al colorante colorante (5mm, 5 minuti) e l'eccesso rimosso con numerosi lavaggi di soluzione fisiologica. La preparazione è quindi visualizzati con un epi-fluorescenza attaccamento e filtri appropriati. Approcci simili possono utilizzare i costrutti GFP transgenici che segna il sinapsi embrionale.