Enregistrement électrophysiologique dans le Drosophile Embryon

Summary

Enregistrements électrophysiologiques de

Abstract

Drosophile est un modèle de premier génétique pour l'étude du développement embryonnaire et à la fois fonctionnelles en neurosciences. Traditionnellement, ces champs sont assez isolées les unes des autres, avec des histoires largement indépendantes et les communautés scientifiques. Cependant, l'interface entre ces domaines généralement disparates sont les programmes de développement qui sous-tendent l'acquisition de propriétés fonctionnelles électriques de signalisation et de la différenciation des synapses chimiques fonctionnels pendant les phases finales de la formation des circuits neuronaux. Cette interface est une zone cruciale pour l'enquête. Chez la drosophile, ces phases de développement fonctionnel se produisent pendant une période de <8 heures (à 25 ° C) pendant le dernier tiers de l'embryogenèse. Cette période tardive de développement a été longtemps considérés comme insurmontables à cause enquête pour le dépôt d'un dur, la cuticule épidermique imperméable. Une percée a été l'avance de l'application de l'eau-de polymérisation de la colle chirurgicale qui peut être appliqué localement à la cuticule pour permettre une dissection contrôlée des embryons à un stade avancé. Avec une incision dorsale longitudinale, l'embryon peut être posé à plat, ce qui expose la corde nerveuse ventrale et la musculature paroi du corps d'une enquête expérimentale. Whole-cell patch-clamp techniques peuvent alors être employées pour enregistrer à partir de neurones individuellement identifiables et les muscles somatiques. Ces configurations d'enregistrement ont été utilisées pour suivre l'apparition et la maturation des courants ioniques et la propagation du potentiel d'action dans les deux neurones et les muscles. Mutants génétiques affectant ces propriétés électriques ont été caractérisées pour révéler la composition moléculaire des canaux ioniques et complexes de signalisation associés, et pour commencer l'exploration des mécanismes moléculaires de la différenciation fonctionnelle. Un accent particulier a été le montage de connexions synaptiques, à la fois dans le système nerveux central et la périphérie. Le glutamatergique jonction neuromusculaire (JNM) est plus accessible à une combinaison de l'imagerie optique et l'enregistrement électrophysiologiques. Une électrode d'aspiration de verre est utilisé pour stimuler le nerf périphérique, avec excitateur de jonction actuelle (EJC) des enregistrements réalisés dans la tension musculaire serré. Cette configuration de l'enregistrement a été utilisé pour tracer la différenciation fonctionnelle de la synapse, et de suivre l'apparition et la maturation des présynaptique propriétés de libération du glutamate. En outre, les propriétés postsynaptique peut être dosée de façon indépendante par l'intermédiaire d'iontophorèse ou l'application de pression de glutamate directement à la surface du muscle, de mesurer l'apparition et la maturation des champs récepteurs du glutamate. Ainsi, les deux éléments de pré-et post-synaptiques peuvent être suivis séparément ou en combinaison au cours synaptogenèse embryonnaire. Ce système a été largement utilisé pour isoler et caractériser des mutants génétiques qui altèrent la formation des synapses embryonnaire, et révéler ainsi les mécanismes moléculaires qui régissent la spécification et la différenciation des connexions synaptiques fonctionnelles synapse et propriétés de signalisation.

Protocol

Partie 1: matériel et fournitures

1. L'enregistrement à partir d'embryons de drosophile électrophysiologique nécessite d'abord la maîtrise des techniques de dissection embryonnaires, qui sont décrites dans une autre vidéo Jupiter.
2. L'enregistrement à partir d'embryons de drosophile électrophysiologique utilise les configurations standard d'enregistrement patch-clamp. Matériel d'enregistrement patch clamp et un logiciel adapté à de nombreuses autres préparations est également approprié pour l'enregistrement à partir d'embryons de drosophile. Parce que les embryons de drosophile sont collés sur une lamelle lors de la dissection, la chambre d'enregistrement doit accepter lamelles. L'épaisseur de la préparation et la manière dont il est monté sur la lamelle nécessite un microscope droit avec une excellente optique DIC et une lentille longue distance de travail.
3. Deux types de solutions de bain sont utilisés pour l'enregistrement électrophysiologiques; 1) «standard» (Jan et Jan, 1976a) ou "standard modifié" (Broadie, 2000) Salines, basée sur des solutions couramment utilisés pour l'enregistrement dans les systèmes d'autres invertébrés, et 2) "hémolymphe-like» (HL) Salines (Stewart et al 1994), un compromis entre la solution saline standard et les concentrations ioniques mesurés dans l'hémolymphe de drosophile. Il est à noter qu'aucun de ces salines précisément imiter les concentrations ioniques mesurées dans l'hémolymphe, qui sont défavorables pour l'enregistrement (Broadie, 2000). Saline standard contient (en mM): 135 NaCl, KCl 5, 4 MgCl _2, 1,8 CaCl2, 72 sucrose, 5 TES, pH 7,2.

Partie 2: configuration de l'enregistrement

1. Pour les expériences physiologiques, la préparation d'embryon disséqué est placé dans une chambre d'enregistrement en plexiglas de petite taille (<0,5 ml) et considérée à la lumière transmise par un microscope composé verticale équipée avec un contraste d'interférence différentiel (Nomarski) optique et une longue distance de travail 40-100X ( généralement 40X) d'eau objectif à immersion (Broadie et Bate, 1993a). Les enregistrements sont généralement faites sous la température ambiante (16-22 ° C), avec une difficulté croissante à des températures élevées (22 ° C +). Nous y parvenons par le refroidissement de la salle plutôt que le refroidissement du preapartion.
2. Pipettes patch peut être tirée d'une variété de fibres de verres remplis (par exemple en verre borosilicate, 1 mm de diamètre extérieur) et les conseils doivent être polie au feu à des résistances finales de 5-10 MQ. Un fil de masse de chlorure d'argent est placé dans le bain. Les signaux sont amplifiés à l'aide d'un amplificateur de patch-clamp (par exemple Axopatch-1D, Axon Instruments), filtrée avec un filtre à 8 pôles Bessel à 2-10 Hz et échantillonnées soit en ligne ou stockées numériquement pour une analyse ultérieure.
3. Conventionnel de patch-clamp enregistrements sont le plus souvent à 18 ° C avec des pipettes de patch tiré à partir de fibres-remplie en verre borosilicate (chaleur astuces polies pour id ~ um 1). Dossiers actuels sont fabriqués à partir de fibres musculaires multinucléées, identifié au voltage-clamp (standard tenant potentiels de -60 à -80 mV) (Broadie et Bate, 1993a-d; Broadie et al, 1997;.. Fergestad et al, 1999; Featherstone et al ., 2000). La solution la pipette de patch contient (en mM): 120 KCl, 20 KOH, 4 MgCl _2, 0,25 CaCl _2, 5 EGTA, 4 Na ₂ ATP, 36 saccharose, et 5 TES, tamponné à pH 7,2. Les électrodes d'enregistrement sont remblayées.

Partie 3: Enregistrement Muscle

1. En principe, n'importe quel muscle embryonnaire peut être enregistré à partir de cette préparation. En pratique, la plupart d'enregistrement s'est concentrée sur la grande, ventrale muscles longitudinaux dans la couche musculaire interne le plus (Bate, 1990; Broadie et Bate, 1993a-c). Les enregistrements ont également été réalisés à partir des muscles dorsaux et latéraux de cette couche musculaire (Kidokoro et Nishikawa, 1994; Auld et al 1995;. Nishikawa et Kidokoro, 1995;. Baumgartner et al 1996). Cependant, la plupart des expériences se concentrer sur le groupe de quatre longitudinales, les muscles ventraux (6,7,12,13), en particulier des muscles de l'abdomen 6 antérieure (A2-A3).
2. Aucun traitement enzymatique est nécessaire avant l'enregistrement du muscle dans les embryons jeunes (<16 hrs AEL). Cependant, une gaine musculaire se développe dans l'embryon plus tard (> 16 heures AEL) et doit être enlevé avec de la collagénase (collagénase de type IV, 1 mg / ml en cations divalents libres saline, de 0,5 à 2 min à température ambiante) avant l'enregistrement de patch. Après traitement enzymatique, les résistances d'étanchéité sur le muscle sont généralement> 1 GQ.
3. Patch-clamp enregistrements peuvent être réalisés à partir des muscles embryonnaire en utilisant un certain nombre de techniques classiques (Broadie et Bate 1993a-c; Broadie et al, 1994, 1995, 1997;. Nishikawa et Kidokoro, 1995). Toute norme de patch-clamp variations - cellule attachée, dedans-dehors, en dehors de sortie - peut être utilisé pour enregistrer l'activité seul canal dans le muscle ou des parcelles isolées membrane musculaire. Simple activité des canaux récepteurs de glutamate (~ 12 Pa à -60 mV) sont généralement observables sur la phase de chute des courants spontanés de jonction excitateurs (sEJCs) enregistré en mode cellule entière.
4. La plupart enregistrement est fait dans la configuration de l'enregistrement de cellules entièresguration, atteint facilement de l'état de la cellule-attachée avec une légère aspiration ou d'une électricité «buzz». Les muscles peuvent être enregistrés à partir soit en voltage-clamp (typique des potentiels tenant de -60 à -80 mV) ou courant-clamp configurations. Les muscles de jeunes embryons (<13 hrs AEL) ne peut être efficacement tension serré en raison du couplage important entre les myotubes embryonnaires (Broadie et Bate, 1993a), ce qui n'est généralement pas un problème pendant plus tard (14 + heures AEL) stades de développement (Ueda et Kidokoro, 1996).
5. Nystatine perforé patch-clamp peut être utilisée pour vérifier les documents obtenus à la norme cellule entière techniques (Broadie et Bate, 1993a). La solution de perforation est faite comme suit: 10 mg pluronique F-127 (Molecular Probes P-1572) est dissous dans 20 ml de DMSO, et 10 mg de nystatine dissous dans cette solution pour faire du stock. 100 ul du stock est ajouté à 5 ml solution pipette filtrés pour rendre la solution d'enregistrement. Cellules entières courants sont généralement obtenus <3 min après la formation de phoque. Résistance série est nettement augmenté dans la plupart des cas et les cellules peuvent se développer un courant de fuite augmente (Broadie et Bate, 1993a).
6. La cellule entière voltage-dépendants au cours d'embryons matures (et larvaire) musculaire est composé de cinq éléments importants (Wu et Haugland, 1985; Zagotta et al 1988; Broadie et Bate, 1993b.): Une de calcium courant entrant (I _Ca) et quatre courants potassiques sortants (Tsunoda et Salkoff, 1995), dont deux rapide, les courants d'inactivation, voltage-dépendants (I _A) et calcium-dépendante (I _FC), et deux retardées, non inactivant les courants, voltage-dépendants (I _K) et calcium-dépendante (I _CS). Ion substitution expériences peuvent être utilisés pour disséquer ces courants de la réponse de cellules entières lors de voltage-clamp (Broadie et Bate, 1993b).

Partie 4: Stimulation de la jonction neuromusculaire et enregistrement

1. La méthode la plus commune et fiable de la stimulation JNM utilise une électrode de verre d'aspiration sur le nerf segmentaire périphérique. Électrodes d'aspiration peut être tirée d'une variété de fibres de verre de l'électrode-remplie (1-1,5 pm de diamètre extérieur) et devrait être polie au feu de réaliser la configuration désirée (diamètre ~ um intérieur 5). Un petit segment (<50 um) du nerf moteur segmentaire appropriée est aspiré dans la pipette avec aspiration douce pour former un joint étanche.
2. Il est commun pour stimuler le nerf intact par le dessin dans une boucle du nerf près du point de sortie du SNC. Cette approche permet une stimulation simple de la préparation intacte, mais a l'inconvénient que spontanée SNC-évoqué l'activité peut se produire superposées sur le paradigme de stimulation appliquée. Une alternative est de stimuler le nerf moteur coupé. Ceci peut être réalisé si la SNC est enlevé, bien que cette procédure a tendance à étirer le nerf et peut causer des dommages. Le nerf peut aussi être coupé avec une microélectrode de verre tranchants, mais cette procédure est fastidieuse et difficile. Il est recommandé que les dossiers soient fabriqués à partir de la préparation intacte.
3. La stimulation peut être appliquée avec une variété de paradigmes. Une stimulation brève (0,2-1 ms) qui fonctionne le mieux et l'intensité de stimulation (généralement 1-5 V) dépendront de la configuration d'aspiration et doivent être déterminées expérimentalement pour chaque cellule. La stimulation supraliminaire du nerf moteur est mieux réalisée par la mise en la force de relance légèrement au-dessus (1-2 volts) de seuil. Réponses évoquées JNM sont enregistrés à partir du patch-serré musculaire tel que décrit ci-dessus. L'artefact de choc peut être considérablement diminué avec l'utilisation d'un terrain virtuel isolé.
4. Une alternative moins fiable à la stimulation des nerfs d'aspiration d'électrode standard est la stimulation directe du système nerveux central (Nishikawa et Kidokoro, 1995). Une microélectrode remplie avec 3-4 M de KCl (ou KAC) est inséré dans le milieu du ganglion ventral et des impulsions positives de ~ 2 microampère en intensité et ~ 2 ms dans la durée sont livrés (Dietcher et al. 1998). L'extrémité de l'électrode doit être dans le neuropile le plus proche du hemisegment où la stimulation est souhaitée. La transmission synaptique est enregistré dans le patch-serré musculaire dans la configuration standard.
5. Le MNJ embryonnaire est accessible à l'ensemble des cellules patch-clamp à travers sa différenciation. Pour excitateurs jonctionnelle actuelle (EJC) les enregistrements, les signaux sont enregistrés avec un standard de patch-clamp amplificateur, filtrée (généralement à 1-2 KHz), converti en un signal numérique à l'aide d'une interface analogique-numérique, et a acquis un ordinateur à l'aide logiciel approprié.

Partie 5: jonction neuromusculaire applications chimiques et de drogues

1. Toute petite, molécule chargée peut être efficacement iontophoresed sur la JNM embryonnaires (Aravamudan et al, 1999;. Fergestad et al 1999, 2001). Pipettes iontophorétique peut être tiré pour des configurations spécifiques, avec des applications pour des périodes variables, en utilisant des impulsions de courant négatif ou positif. Il est essentiel pour empêcher les fuites entre PUGE avec un soutien approprié s'opposant courant (Broadie et al 1993d;. Featherstone et al 2002, 2005;.. Rohrbough et al 2007). L'ampleur de ce soutien actuels varient avec la configuration de la pipette et doit être déterminée expérimentalement.
2. De nombreuses expériences ont été réalisées avec le neurotransmetteur JNM, L-glutamate (Jan et Jan, 1976b), en utilisant une solution stock 100 mM (sel monosodique; pH 8-9) (Broadie et Bate, 1993c). Pipettes Haute résistance iontophorétique (100-200 MQ) ont été utilisés pour des récepteurs du glutamate (Glur) cartographie (Broadie et Bate, 1993d), et des pipettes faible résistance (20-50 MQ) utilisés pour estimer la réponse Glur total (Broadie et al. 1995, 1997; Featherstone et al 2002, 2005;. Rohrbough et al 2007).. Les impulsions courtes (0,1-1 ms) de courant négatif (~ 10 nA) fonctionnent bien, avec un petit soutien positif actuel pour éviter les fuites.
3. Non chargées et des molécules chargées peuvent être appliquées par l'éjection de pression (Fergestad et Broadie, 2001;. Featherstone et al 2001). Pour l'application, une pipette d'éjection de pression (<5 um de diamètre interne) contenant la solution est placée à proximité (<10 um) de la terminaison nerveuse. La solution pour être éjecté peut être appliqué en utilisant un picospritzer (psi 5-10) ou une autre source d'air pressurisé (Featherstone et al., 2002). Au cours d'expériences prolongées, la chambre d'enregistrement (volume <0,5 ml) doit être perfusé en continu (0,1 - 0,2 ml / sec) avec une solution saline normale de bain.
4. De nombreuses expériences ont été réalisées avec une solution saline pour déclencher la fusion hyperosmotiques des vésicules synaptiques (Broadie et al 1995;. Aravamudan, et al, 1999;. Fergestad et al, 1999;.. Featherstone, et al, 2000, 2002). D'autres expériences ont été réalisées avec des toxines, comme argiotoxin 636 contre les récepteurs du glutamate et le noir venin de la veuve d'araignée latroinsectotoxin contenant (Broadie et al. 1995).

Partie 6: Techniques complémentaires neuromusculaires Junction Imaging Vital

1. Cinétique des vésicules synaptiques peuvent être surveillées avec les colorants lipophiles fluorescents stryl (Fergestad et Broadie, 2001;. Rohrbough et al 2004). La distribution des vésicules peuvent être observés directement, et les taux d'endocytose et d'exocytose mesurée. Plusieurs variantes ont été pris avec différentes propriétés fluorescentes (FM1-43, la fluorescéine-comme; FM4-64, la rhodamine-like). Modifications de la teinture d'origine ont cédé aux produits modifiés propriétés hydrophobes, et donc avec une cinétique différente de lavage, par exemple, FM2-10 se dissocie beaucoup plus rapide de la membrane.
2. Pour l'étiquette du NMJ embryonnaire avec des colorants stryl, 10 uM FM1-43 peut être chargé pendant 1-5 minutes en utilisant élevées de potassium extracellulaire (50-90 mM) (Fergestad et Broadie, 2001). Une approche plus physiologique peut être atteint via la stimulation par une électrode d'aspiration nerveuses. Les préparatifs sont ensuite lavés à plusieurs reprises dans Ca ^{2 +} sans tampon pour 5 minutes, et retenu par fluorescence (représentant teints vésicules synaptiques) mesurée. Pour mesurer l'exocytose, on peut décharger le colorant en utilisant soit le potassium élevée ou nerveuses stimulation électrique.
3. Des protéines de fusion avec des variantes de GFP ont été produites en permettant l'étiquetage multicolore de la synapse embryonnaire JNM (Brand, 1999;. Zhang et al 2002). Beaucoup transgéniques exprimant la GFP-protéines étiquetées sont disponibles, y compris marqueurs membranaires général (par exemple mCD8-GFP), les marqueurs postsynaptique (par exemple, Shaker-GFP, GluRIIA-GFP), du cytosquelette (actine-GFP par exemple, moésine-GFP, la tubuline-GFP) et mitochondrial marqueurs (par exemple, cytochrome C-GFP) et des marqueurs des vésicules synaptiques (par exemple synaptobrévine-GFP, GFP-synaptotagmine;. Zhang et al, 2002).
4. Journalistes GFP étiquette compartiments qui sont très dynamiques et peuvent être utilisés pour évaluer les caractéristiques de développement ou phénotypes mutants (Featherstone et Broadie, 2000). Blanchiment et puis en observant la récupération de la fluorescence (FRAP) a été montré pour être réalisable, du moins au NMJ larves de drosophile (Zhang et al, 2002;. Yan et Broadie, 2007). Un mot de prudence, toutefois: certains de ces marqueurs ne sont pas pleinement le sauvetage des mutants nuls et peuvent même modifier la normale JNM physiologie.

Partie 7: Enregistrement à partir de neurones moteur central

1. Beaucoup de neurones embryonnaires peuvent être identifiés individuellement selon la position et la morphologie de projection Soma (Bate et Martinez-Arias, 1993; Goodman et Doe, 1993; Landgraf et al 1997). En outre, le système GAL4/UAS (Brand et Perrimon, 1993) permet de cibler l'expression de GFP pour visualiser les populations de neurones identifiables (Baines et al., 1998). Enregistrement des études à ce jour se sont concentrées sur un groupe de cinq superficielles, les neurones dorsaux dans la corde nerveuse ventrale embryonnaires (VNC), quatre neurones moteurs (ACC et RP1-4) et un interneurone PCC (Baines et al, 1998, 1999, 2001. ; Rohrbough et Broadie, 2002; Featherstone et al 1995)..
2. Corps cellulaires des neurones identifiés sont accessibles à l'ensemble des cellules électrodes d'enregistrement de patch-clamp. La gaine VNC neurolemme doit d'abord être enlevé avec le traitement focal brève avec la protéase (Baines et Bate, 1998; Baines et al, 1999;. Rohrbough et Broadie, 2002). Dorsale corps cellulaires neuronaux sont exposés en utilisant un grand diamètre (~ 20 um) pipettes de patch contenant de la protéase 0.5-1% (type XIV (Sigma) dans une solution saline d'enregistrement). Le matériau de la gaine du SNC est aspiré dans la pipette pendant 1-2 minutes jusqu'à ce que les ruptures de gaine (Featherstone et al. 1995). Pour confirmer l'identité cellulaire lors des enregistrements, Lucifer jaune (sel dipotassique, 1-2 mg / ml) peut être ajouté à la solution de patch afin de visualiser la position et la morphologie de la cellule.
3. Standard de cellules entières de tension et de courant-clamp enregistrements peuvent être réalisés (Rohrbough et Broadie, 2002;. Featherstone et al, 2005). Les salins d'enregistrement externe contient (en mM): 140 NaCl, KCl 3, 2 CaCl _2, MgCl ₂ 4, 5 HEPES, 10 saccharose, 2 NaOH (pH 7,2). La solution de patch contient (en mM): 140 K-acétate, 2 MgCl _2, 0,1 CaCl2, 10 HEPES, 1,1 EGTA, 2 Na2-ATP, ~ 6 KOH (pH 7,2). Voltage-clamp enregistrements sont effectués à des potentiels tenue de -60 mV à 18 ° C. Typiques non ajustés des potentiels de repos sont de l'ordre de -45 à -65 mV (-52,9 ± 7,5 mV, moyenne ± SD, n = 78).
4. Dosages disponibles révèlent voltage-dépendants des courants ioniques (Baines et Bate, 1998), les potentiels d'action répétitive, synaptiquement médiée par l'activité et agoniste-dépendants réponses (Baines et al., 2001). Entrée Synaptic pour les neurones moteurs est enregistrée sous la forme d'à la fois rapide AP-médiée excitateur rapide courants synaptiques (CES), et des épisodes périodiques, soutenue (jusqu'à 1 sec durée) des entrées excitatrices survenant plusieurs fois ou plus par minute (Baines et al ., 1999; Baines et al, 2001)..
5. Corps cellulaire de répondre à l'acétylcholine par iontophorèse appliquée (ACh) et l'émetteur inhibiteur GABA (Baines et Bate, 1998;. Featherstone et al 2005). ACh peut être appliqué par iontophorèse au soma neuronal par une microélectrode forte contenant 100 mM ACh dans dH ₂ 0, à pH 4-5 en faveur iontophorèse agoniste par un courant positif.

Les résultats représentatifs

Ventrale muscle longitudinal 6 est segments A2-A3 est la cible la plus couramment utilisée pour l'enregistrement (Broadie et Bate, 1993a-d; Harrison et al, 1994;. Sweeney et al 1995;. Renden et al 2001;. Huang et al 2006.; Mohrmann et al. 2008). Dans l'embryon mature et nouvellement éclos larve de premier stade (20-21 AEL heures à 25 ° C d'incubation =), le muscle 6 cellules entières capacité est généralement de 25 à 30 pF, et les résistances d'entrée de 20 à 40 MQ, évolue avec l'âge de développement. Maximal JNM large synaptique courants de dizaines de picoamps (13-14 heures AEL) pour 1-2nA (20-21 heures AEL), augmente rapidement en fonction de l'âge. Mesure directe du glutamate courants de rendement réponses maximales de centaines de picoamps (13-14 heures AEL) pour 1,5 4NA juste avant l'éclosion. Erreurs résistance en série (résistance totale actuelle séries X) sont généralement <5 mV, mais, en maturité, de pré-incubation de embryons, peut être aussi élevé que 10 + mV et donc la compensation résistance en série conseillée. Muscles embryonnaires avec un diamètre moyen de 10-30 um, et la durée moyenne de 40-80 um, semblent montrer presque idéal paramètres pince espace. Les constantes de cellule pince de temps (R _série XC _cellulaire) en moyenne moins de 0,25 ms.

Dans l'embryon mature et larves nouvellement écloses, la population de neurones moteur dorsal a été soumis à un enregistrement plus limitée. Enregistrements soma neuronal révèlent la capacité de cellules entières dans la gamme de 1.8 à 2.5 pF (2,0 pF en moyenne), la résistance série de 40-60 MQ et de résistance d'entrée de ~ 5 GQ (Baines et Bate, 1998; Featherstone et al 2005). Ces cellules bien grandir en taille et en complexité lors de la maturation embryonnaire, et cette croissance se poursuit tout au long du développement larvaire. Dans stades tiers, la capacité cellule entière est de 17 à 20 pF, la résistance série est de 25 à 37 MQ et moyennes résistance d'entrée ~ 900 MQ (Rohrbough et Broadie, 2002; Baines Richard, communication personnelle). Conductances ioniques augmenter tout au long du développement, mais la densité de courant (pA / pF) reste remarquablement constant. Dans les embryons matures, les courants synaptiques en moyenne de 75 100Pa en amplitude, avec deux événements ESC rapide et prolongée des courants en moyenne ~ 500 msec (Baines et Bate, 1998; Featherstone et al 2005). Dans les embryons, ces événements soutenus 3-5 en moyenne par minute, augmentant d'environ 20 par minute dans le premier stade larvaire (Baines Richard, communication personnelle). Notez que la complexité morphologique et propriétés des membranes des neurones de la drosophile, il est pratiquement impossible de bien la tension de serrage grande partie de la cellule au-delà des soma. Il faut donc interpréter avec prudence les enregistrements.

Discussion

L'enregistrement à partir d'embryons de drosophile électrophysiologique nécessite une manipulation manuelle et de dissection. La santé de la préparation, et la qualité conséquente des enregistrements, dépend d'un seul être capable de préparer rapidement et proprement les tissus fragiles embryonnaires à des fins d'enregistrement, et ensuite exécuter l'expérience. Les expérimentateurs doivent être compétents dans les deux dissections embryonnaire et l'électrophysiologie patch clamp avant d'essayer de s'attaquer à la fois à la fois.

Les enregistrements peuvent se faire dans un des plusieurs variantes du "standard modifié" ou "hémolymphe-like» (HL) Salines. Les principales différences entre ces deux classes salins sont 1) la concentration de Na ⁺ (120 à 135 mm standard vs 70 mM HL) et 2) la concentration de Mg ^{2 +} (4 mm standard vs 20 mM HL). Le principal avantage de la forte concentration de Na ⁺ dans la solution standard est de faciliter l'action potentielle de propagation et, par conséquent, le maintien de la normale, la transmission synaptique à motifs. Les Salines HL supprimer l'action potentiel de transmission synaptique médiée. La différence de Mg ^{2 +,} qui bloque les canaux calciques voltage-dépendants, modifie l'amplitude de la transmission synaptique et déplace vers le haut de Ca ^{2 +-large} de dépendance dans les salines HL (Stewart et al. 1994). HL Salines montrent donc beaucoup plus faible amplitude de la transmission synaptique à un moment donné [Ca ^{2 +].} Un contrôle minutieux de l'osmolarité élimine vacuolisation cellulaire dans les deux salines, et la morphologie apparaît aussi bien conservée dans une solution saline. Puisque ni salée reproduit hémolymphe réelle, le choix d'une solution saline devrait refléter les besoins de la question à l'étude.

Il ya plusieurs directives importantes pour maximiser la réussite des enregistrements embryonnaire. Premièrement, la capacité de réussir à former des joints gigaohm sur le muscle embryonnaire diminue avec l'âge du développement. Cela est probablement dû principalement à l'aménagement de la membrane basale entourant les muscles de maturation. Pour contrer cela, le traitement de la collagénase plus long (1-2 min) est nécessaire. Cependant, il faut prendre soin, car ce traitement enzymatique sera allongé rapidement compromettre l'attachement des muscles de la paroi du corps, et peut facilement mener à un décollement du muscle. Une règle que nous avons trouvé efficace est de limiter le traitement enzymatique à ~ 50% du temps que provoque le décollement du muscle détectable. Deuxièmement, il est crucial que le nerf a un ajustement serré dans l'électrode d'aspiration pour une stimulation adéquate; trop lâche et la stimulation échoue, trop serré et il n'est pas possible de stimuler une section adéquate du nerf. Dans notre expérience, c'est certainement la plus grande limitation unique pour JNM enregistrement réussi. Le diamètre approprié pour l'électrode d'aspiration doit être déterminée empiriquement, mais tous les efforts devraient être faits pour préserver une électrode de stimulation de bons, qui peuvent facilement être utilisés pour une journée entière de l'enregistrement. Troisièmement, pour les applications de neurotransmetteurs et de drogue réussie de la JNM, il est essentiel de se familiariser avec le placement des synapses. Avec l'expérience, les terminaisons stéréotypés peuvent être trouvés facilement avec optique DIC. Pour le débutant, les terminaisons nerveuses de l'embryon peut être révélé avec membrane mitochondriale colorants fluorescents perméants, tels que la rhodamine 123 ou 4-di-2-Asp (Yoshikami et Okun, 1984; Broadie et Bate, 1993a). L'embryon est tout simplement disséqué exposés à la teinture de teinture (5mm, 5 min) et l'excès enlevé avec plusieurs lavages de solution saline. La préparation est ensuite considérée avec une pièce jointe épifluorescence et de filtres appropriés. Des approches similaires peuvent utiliser des constructions transgéniques GFP marquant la synapse embryonnaire.