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Biology

Registro electrofisiológico en el Drosophila Embrión

Published: May 21, 2009 doi: 10.3791/1348
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Biological Sciences, University of Illinois, 2Department of Biological Sciences, Vanderbilt University

Summary

Registros electrofisiológicos de

Abstract

Drosophila es un modelo genético de primera para el estudio de ambos el desarrollo embrionario y funcional neurociencia. Tradicionalmente, estos campos son muy aislados unos de otros, con historias en gran medida independiente y la comunidad científica. Sin embargo, la relación entre estos campos por lo general diferentes programas de desarrollo es la base de adquisición de las propiedades funcionales de señalización eléctrica y la diferenciación de las sinapsis químicas funcional durante las fases finales de la formación de circuitos neuronales. Esta interfaz es una zona muy importante para la investigación. En Drosophila, estas fases de desarrollo funcional se producen durante un período de <8 horas (a 25 ° C) durante el último tercio de la embriogénesis. Este período de desarrollo tardío fue considerado durante mucho tiempo difíciles de investigación debido a la deposición de una cutícula dura, epidérmico impermeable. Un avance avance fue la aplicación de agua de polimerización pegamento quirúrgico que puede aplicarse localmente a la cutícula para permitir la disección controlada de la última etapa de embriones. Con una incisión longitudinal dorsal, el embrión puede ser en plano, dejando al descubierto el cordón nervioso ventral y la musculatura de la pared del cuerpo para la investigación experimental. Plenario de células patch-clamp técnicas se pueden utilizar para grabar en las neuronas de forma individual de identificación y los músculos somáticos. Estas configuraciones de grabación se han utilizado para realizar un seguimiento de la aparición y maduración de las corrientes iónicas y la propagación del potencial de acción, tanto en las neuronas y los músculos. Mutantes genéticos que afectan a estas propiedades eléctricas se han caracterizado para revelar la composición molecular de los canales iónicos y complejos de señalización asociados, y para empezar la exploración de los mecanismos moleculares de la diferenciación funcional. Se prestará especial atención ha sido el montaje de las conexiones sinápticas, tanto en el sistema nervioso central y la periferia. El glutamatérgica unión neuromuscular (UNM) es más accesible a una combinación de imágenes ópticas y de registro electrofisiológico. Un electrodo de succión de vidrio se utiliza para estimular el nervio periférico, con la excitación de unión actual (EJC) las grabaciones realizadas en la tensión de los enganches del músculo. Esta configuración de la grabación se ha utilizado para trazar la diferenciación funcional de la sinapsis, y realizar un seguimiento de la aparición y maduración de las propiedades de liberación de glutamato presináptica. Además, las propiedades postsinápticos se puede probar de forma independiente a través de iontoforesis o la aplicación de presión de glutamato directamente a la superficie del músculo, para medir la aparición y maduración de los campos receptores de glutamato. Por lo tanto, ambos elementos pre y postsinápticos se puede controlar por separado o en combinación durante la sinaptogénesis embrionarias. Este sistema ha sido muy utilizada para aislar y caracterizar mutantes genéticos que impiden la formación de sinapsis embrionario, por lo que revelan los mecanismos moleculares que regulan la especificación y diferenciación de las sinapsis y conexiones sinápticas propiedades funcionales de señalización.

Protocol

Parte 1: Equipos y Suministros

  1. Registro electrofisiológico de embriones de Drosophila requiere en primer lugar el dominio de las técnicas de disección de embriones, que se describen en otro video Jove.
  2. Registro electrofisiológico de embriones de Drosophila utiliza configuraciones estándar de parches de grabación de sujeción. Patch clamp equipo de grabación y el software adecuado para muchas otras preparaciones que también es adecuado para la grabación a partir de embriones de Drosophila. Porque los embriones de Drosophila se pegan a una hoja de cubierta durante la disección, la cámara de registro debe aceptar cubreobjetos. El espesor de la preparación y la forma en que se monta en el cubreobjetos requiere un microscopio vertical, con una excelente óptica DIC y una lente de largo distancia de trabajo.
  3. Hay dos tipos de soluciones para baños se utilizan para registro electrofisiológico: 1) "estándar" (Jan y Jan, 1976a) o "modificado estándar" (Broadie, 2000) salinas, en base a soluciones de uso común para la grabación en los sistemas de invertebrados, y 2) "hemolinfa-like" (HL) Salines (Stewart et al 1994), un compromiso entre la solución salina normal y las concentraciones iónicas medidas en la hemolinfa de Drosophila. Cabe señalar que ninguna de estas salinas de reproducir fielmente las concentraciones iónicas medidas en la hemolinfa, que son desfavorables para la grabación (Broadie, 2000). Salino estándar contiene (en mM): 135 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl2, CaCl2 1,8, 72 sacarosa, 5 TES, pH 7,2.

Parte 2: Configuración de grabación

  1. Para los experimentos fisiológicos, la preparación de embriones disecados se coloca en una cámara de plexiglás de grabación pequeños (<0,5 ml) y se ve en la luz transmitida con un microscopio compuesto en posición vertical equipado con contraste de interferencia diferencial (Nomarski) óptica y una de larga distancia de trabajo 40-100X ( normalmente 40X) de inmersión en agua objetiva (Broadie y Bate, 1993). Las grabaciones se hacen típicamente por debajo de la temperatura ambiente (16-22 ° C), con creciente dificultad a temperaturas elevadas (22 ° C +). Esto lo conseguimos mediante el enfriamiento del ambiente en lugar de enfriar el preapartion.
  2. Pipetas de patch se puede extraer de una variedad de relleno con fibra de vidrios (por ejemplo, vidrio borosilicato, 1 mm de diámetro exterior) y los consejos deben ser pulida al fuego a las resistencias final de 5.10 mW. Un cable de tierra de cloruro de plata se coloca en el baño. Las señales son amplificadas mediante un amplificador de patch-clamp (por ejemplo, 1D Axopatch, Axon Instruments), se filtró con un filtro de 8 polos Bessel a 2-10 Hz, y, o bien muestras en línea o almacenados en formato digital para su posterior análisis.
  3. Convencionales patch-clamp grabaciones son más a menudo posible a 18 ° C con pipetas parche tira de fibra de vidrio de borosilicato lleno (calor puntas pulidas al id ~ m 1). Registros actuales están hechos de fibras multinucleadas identificado los músculos en tensión-clamp (estándar de la celebración de los potenciales de -60 a -80 mV) (Broadie y Bate, 1993a-d; Broadie et al, 1997;.. Fergestad et al, 1999; Featherstone et al ., 2000). La solución de la pipeta parche contiene (en mM): KCl 120, 20 de KOH, 4 MgCl 2, 0,25 CaCl 2, 5 EGTA, 4 Na 2 ATP, 36 de sacarosa, y TES 5, tamponada a pH 7,2. Electrodos de registro están de vuelta lleno.

Parte 3: Grabación del músculo

  1. En principio, cualquier músculo embrionarias pueden ser grabadas de en esta preparación. En la práctica, la mayoría de la grabación se ha concentrado en los músculos grandes, ventral longitudinal en la capa muscular más interna (Bate, 1990; Broadie y Bate, 1993a-c). Registros también se han hecho de los músculos dorsales y laterales de la capa muscular (Kidokoro y Nishikawa, 1994; Auld et al, 1995;. Nishikawa y Kidokoro, 1995;. Baumgartner et al 1996). Sin embargo, la mayoría de los experimentos se centran en el grupo de cuatro músculos longitudinales, ventral (6,7,12,13), en especial los músculos 6 en el abdomen anterior (A2-A3).
  2. No se requiere tratamiento enzimático antes de la grabación del músculo en los embriones jóvenes (<16 horas AEL). Sin embargo, una vaina del músculo se desarrolla en el embrión más tarde (> 16 h AEL) y debe ser eliminado con colagenasa (colagenasa tipo IV, 1 mg / ml en cationes divalentes solución salina libre, 0.5-2 minutos a temperatura ambiente) antes de grabar el parche. Después del tratamiento con enzimas, las resistencias de sellado en el músculo son generalmente> 1 G.
  3. Patch-clamp grabaciones se pueden realizar desde los músculos embrionarias usando varias técnicas estándar (Broadie y Bate 1993a-c; Broadie et al, 1994, 1995, 1997;. Nishikawa y Kidokoro, 1995). Cualquier norma de patch-clamp variaciones - celular conectado, de dentro a fuera, fuera, fuera - puede ser empleado para registrar la actividad de un solo canal en el músculo aislado o parches de membrana muscular. Solo receptor glutamato actividad del canal (~ 12 Pa a -60 mV) se observa generalmente en la fase descendente de las corrientes de unión espontánea excitatorios (sEJCs) grabado en el modo de células enteras.
  4. La mayoría de la grabación se realiza en la configuración de grabación de células enterasguración, fácil de lograr desde el estado celular conectado con ligera succión eléctrica o un "zumbido". Los músculos se pueden grabar, ya sea en el voltaje-clamp (típico de los potenciales de la celebración de -60 a -80 mV) o configuraciones actuales-clamp. Los músculos de los embriones más jóvenes (<13 h AEL) no pueden ser efectivamente tensión fijada debido al acoplamiento amplia entre los miotubos embrionarias (Broadie y Bate, 1993), esto no suele ser un problema durante la tarde (14 + horas AEL) etapas de desarrollo (Ueda y Kidokoro, 1996).
  5. Nistatina perforada patch-clamp grabación se puede utilizar para comprobar los registros obtenidos con el estándar de células enteras técnicas (Broadie y Bate, 1993). La solución de la perforación se realiza de la siguiente manera: 10 mg Pluronic F-127 (Molecular Probes p-1572) se disuelve en 20 ml de DMSO y 10 nistatina mg disueltos en esta solución para hacer el caldo. 100 l de la población se añadieron a 5 ml de solución de pipeta de filtrado para la solución de grabación. De células enteras corrientes se obtienen generalmente <3 minutos después de la formación del sello. Resistencia en serie se incrementa marcadamente en la mayoría de los casos y las células pueden desarrollar una mayor corriente de fuga (Broadie y Bate, 1993).
  6. El conjunto de células dependientes de voltaje en la corriente de embriones maduros (y larvas) del músculo se compone de cinco componentes importantes (Wu y Haugland, 1985; Zagotta et al 1988; Broadie y Bate, 1993.): Una corriente de entrada de calcio (Ca I) y cuatro corrientes de potasio hacia el exterior (Tsunoda y Salkoff, 1995), dos de ellos rápidos, corrientes de inactivación, la tensión de la gated-(I A) y dependientes de calcio (I CF), y dos retardada, falta de inactivación de las corrientes, dependiente de voltaje (I K) y dependiente de calcio (I CS). La sustitución de iones experimentos se pueden utilizar para analizar estas corrientes de la respuesta de células enteras durante voltaje-clamp (Broadie y Bate, 1993).

Parte 4: La estimulación unión neuromuscular y de grabación

  1. El método más común y fiable de la estimulación NMJ utiliza un electrodo de succión de vidrio en los nervios periféricos segmentaria. Electrodos de succión se puede extraer de una variedad de electrodo de vidrio rellena de fibra (1 a 1,5 m de diámetro exterior) y debe ser pulida al fuego para conseguir la configuración deseada (~ 5 m de diámetro interior). Un segmento pequeño (<50 micras) y del nervio motor segmentario apropiado se introduce en la pipeta con una succión suave para formar un sello hermético.
  2. Es común que para estimular el nervio intacto de dibujo en un bucle del nervio cerca del punto de salida del SNC. Este enfoque permite la estimulación de la preparación fácil intacto, pero tiene el inconveniente de que el SNC espontánea evocada se realiza la actividad superpuesta en el paradigma de la estimulación aplicada. Una alternativa es estimular el nervio motor de corte. Esto se puede lograr si el sistema nervioso central se elimina, aunque este procedimiento tiende a estirar el nervio y puede causar daños. El nervio también se puede cortar con un microelectrodo de vidrio fuerte, pero este procedimiento es tedioso y difícil. Se recomienda que los registros se hizo a partir de la preparación intacto.
  3. La estimulación se puede aplicar con una variedad de paradigmas. Estimulación breve (0,2-1 mseg) que funciona mejor y la intensidad de la estimulación (generalmente 5.1 V) dependerá de la configuración de succión y debe ser determinado experimentalmente para cada celda. Por encima del umbral de estimulación del nervio motor se logra mejor mediante el establecimiento de la fuerza de estímulo ligeramente por encima (1-2 voltios) umbral. Respuestas evocadas MNJ se registran desde el parche-sujeta los músculos como se describió anteriormente. El artefacto de choque puede ser disminuido sustancialmente con el uso de un terreno virtual aislado.
  4. Una alternativa más fiable a la estimulación del nervio de succión estándar de electrodo es la estimulación directa del sistema nervioso central (Nishikawa y Kidokoro, 1995). Un microelectrodo lleno de KCl 3.4 M (o KAC) se inserta en el centro del ganglio ventral y pulsos positivos de ~ 2 microamperios en intensidad y (1998 Dietcher et al.) ~ 2 ms de duración se entregan. La punta del electrodo debe estar en el neuropilo más cercano hemisegment donde la estimulación se desea. La transmisión sináptica se registra en la revisión de los enganches del músculo en la configuración estándar.
  5. La UNM embrionarias se puede acceder a su conjunto de células patch-clamp grabación a través de su diferenciación. De excitación de la unión actual (EJC) las grabaciones, las señales se registran con un nivel de patch-clamp amplificador, filtrada (por lo general a 1-2 KHz), convertida en una señal digital que utiliza una interfaz de analógico a digital, y adquirió un equipo con el software apropiado.

Parte 5: la unión neuromuscular Aplicaciones Químicas y Drogas

  1. Cualquier molécula pequeña, cargada puede ser efectivamente iontophoresed en la UNM embrionarias (Aravamudan et al, 1999;. Fergestad et al, 1999, 2001). Pipetas iontoforético se puede tirar para configuraciones específicas, las solicitudes de períodos variables, utilizando pulsos de corriente negativa o positiva. Es de vital importancia para evitar las fugas entre los puempresas grandes con un respaldo adecuado oposición actual (Broadie et al 1993d;. Featherstone et al 2002, 2005,.. Rohrbough et al 2007). La magnitud de este apoyo actual puede variar con la configuración de la pipeta y se debe determinar experimentalmente.
  2. Muchos experimentos se han hecho con el neurotransmisor UNM, L-glutamato (Jan y Jan, 1976), utilizando una solución de reserva de 100 mm (sal monosódica, pH 9.8) (Broadie y Bate, 1993c). Pipetas de alta resistencia a la iontoforesis (100-200 MW) se han utilizado para los receptores de glutamato (GluR) Cartografía (Broadie y Bate, 1993d), y menor resistencia a las pipetas (20-50 MW) para estimar la respuesta GluR total (Broadie et al. 1995, 1997, Featherstone et al 2002, 2005;. Rohrbough et al 2007).. Pulsos cortos (0,1-1 m) de la corriente negativa (~ 10 nA) funcionan bien, con un respaldo pequeño, positivo actual para evitar fugas.
  3. Sin carga y las moléculas cargadas se pueden aplicar por la presión de eyección (Fergestad y Broadie, 2001;. Featherstone et al 2001). Para su aplicación, una pipeta de presión de eyección (<5 micras de diámetro interior), que contiene la solución se coloca cerca (<10 micras) a partir de la terminación nerviosa. La solución a ser expulsados ​​pueden ser aplicados utilizando una picospritzer (5-10 psi) o cualquier otra fuente de aire presurizado (Featherstone et al., 2002). Durante los experimentos prolongada, la cámara de grabación (volumen <0,5 ml) debe ser perfundida en forma continua (0,1 a 0,2 ml / seg) con solución salina baño normal.
  4. Muchos experimentos se han realizado con solución salina hiperosmótico para desencadenar la fusión de las vesículas sinápticas (Broadie et al, 1995;. Aravamudan, et al, 1999;. Fergestad et al, 1999;.. Featherstone, et al, 2000, 2002). Otros experimentos han sido realizados con toxinas, como argiotoxin 636 contra los receptores de glutamato y la viuda de negro latroinsectotoxin veneno de la araña que contiene (Broadie et al. 1995).

Parte 6: Técnicas Complementarias de la unión neuromuscular Vital imágenes

  1. Cinética de la vesícula sináptica pueden ser controlados con los tintes fluorescentes lipofílicos stryl (Fergestad y Broadie, 2001;. Rohrbough et al 2004). La distribución de vesículas puede ser observado directamente, y midieron las tasas de endocitosis y exocitosis. Varias variantes se han hecho con diferentes propiedades fluorescentes (FM1-43, con fluoresceína como; FM4-64, rodamina-like). Modificaciones de la tintura original de los productos han dado con alteración de las propiedades hidrofóbicas, y por lo tanto con una cinética de lavado diferentes, por ejemplo, FM2-10 se disocia mucho más rápido de la membrana.
  2. Para etiquetar la UNM embrionarias con tintes stryl, 10 M FM1-43 puede ser cargado durante 1-5 minutos con el potasio extracelular elevado (50-90 mM) (Fergestad y Broadie, 2001). Un enfoque más fisiológico se puede lograr a través de la estimulación de un electrodo de succión del nervio. Los preparativos se lavan varias veces en Ca 2 + libre de búfer durante 5 minutos, y mantuvo la fluorescencia (en representación de teñido de las vesículas sinápticas) medido. Para medir la exocitosis, se puede descargar el medio de contraste utilizando potasio altos o la estimulación eléctrica del nervio.
  3. Las proteínas de fusión con GFP variantes se han producido lo que permite el etiquetado multicolor de la sinapsis embrionarias MNJ (Brand, 1999;. Zhang et al 2002). Muchos transgénicos que expresan GFP-etiquetados proteínas están disponibles, incluyendo marcadores de membrana en general (por ejemplo, mCD8-GFP), marcadores postsinápticos (por ejemplo, Shaker-GFP, GluRIIA-GFP), citoesqueleto (por ejemplo, la actina-GFP, moesina-GFP, tubulina-GFP) y mitocondrial los marcadores (por ejemplo, citocromo C-GFP) y los marcadores sinápticos de vesículas (por ejemplo, sinaptobrevina-GFP, sinaptotagmina-GFP;. Zhang et al, 2002).
  4. Reporteros GFP etiqueta compartimentos que son muy dinámicos y pueden ser utilizados para evaluar las características del desarrollo o fenotipos mutantes (Featherstone y Broadie, 2000). Blanqueo y la observación de la recuperación de la fluorescencia (FRAP), ha demostrado ser factible, al menos en la UNM larvas de Drosophila (Zhang et al, 2002;. Yan y Broadie, 2007). Una palabra de advertencia, sin embargo: algunos de estos marcadores no son totalmente de rescate mutantes nulos e incluso puede alterar la fisiología normal NMJ.

Parte 7: Grabación del centro de las neuronas motoras

  1. Muchas neuronas embrionarias pueden ser identificados individualmente sobre la base de la posición de soma y la morfología de proyección (Bate y Martínez-Arias, 1993; Goodman y Pérez, 1993; Landgraf et al 1997). Además, el sistema GAL4/UAS (Brand y Perrimon, 1993) pueden dirigirse a la expresión de GFP para visualizar las poblaciones de neuronas de identificación (Baines et al., 1998). Los estudios de grabación hasta la fecha se han concentrado en un grupo de cinco neuronas superficial, dorsal en el cordón nervioso ventral embrionarias (VNC), cuatro neuronas motoras (ACC y RP1-4) y una interneurona PCC (Baines et al, 1998, 1999, 2001. ; Rohrbough y Broadie, 2002; Featherstone et al 1995)..
  2. Cuerpos celulares de las neuronas identificadas son accesibles a toda la célula electrodos de registro de patch-clamp. La vaina de VNC neurolemma debe ser removido con un breve tratamiento focal con la proteasa (Baines y Bate, 1998; Baines et al, 1999;. Rohrbough y Broadie, 2002). Dorsal cuerpos de las células neuronales están expuestos con un gran diámetro (~ 20 m) pipeta parche que contiene 0.5-1% de la proteasa (tipo XIV (Sigma) en solución salina de grabación). El material de la envoltura del SNC se extrae por medio de succión en la punta de la pipeta durante 1-2 minutos hasta que se rompe la vaina (Featherstone et al. 1995). Para confirmar la identidad de celulares durante las grabaciones, amarillo lucifer (sal dipotásico, 1.2 mg / ml) se puede agregar a la solución de parche con el fin de visualizar la posición y la morfología de la célula.
  3. Estándar de células enteras de voltaje y corriente-clamp grabaciones se pueden hacer (Rohrbough y Broadie, 2002;. Featherstone et al, 2005). La solución salina de grabación externo contiene (en mM): NaCl 140, KCl 3, 2 CaCl2, MgCl2 4, 5 HEPES, 10 de sacarosa, 2 NaOH (pH 7,2). La solución parche contiene (en mM): 140 K-acetato, 2 MgCl 2, 0,1 CaCl2, 10 HEPES, EGTA 1,1, 2 Na2-ATP, ~ 6 KOH (pH 7,2). Fijación de voltaje, las grabaciones se realizan en los potenciales de celebración de -60 mV a 18 ° C. Típica potenciales de reposo no ajustados están en el rango de -45 a -65 mV (-52,9 ± 7,5 mV, media ± DE, n = 78).
  4. Los ensayos disponibles revelan voltaje de las corrientes iónicas (Baines y Bate, 1998), los potenciales de acción repetitiva, la actividad sinápticamente y mediada por el agonista respuestas cerradas (Baines et al., 2001). Entrada sináptica de las neuronas motoras se registra en forma de tanto rápido AP-mediada rápidas corrientes de excitación sináptica (CES), y episodios periódicos, sostenido (hasta 1 segundo de duración) de la entrada de excitación que ocurren varias veces o más por minuto (Baines et al ., 1999; Baines et al, 2001)..
  5. Soma celular responden a la acetilcolina iontoforética aplicada (ACh) y el inhibidor GABA transmisor (Baines y Bate, 1998;. Featherstone et al 2005). ACh se puede aplicar iontoforética al soma neuronal a través de un microelectrodo fuerte que contiene 100 mM de ACh en dH 2 0, a un pH de 4-5 a favor de la iontoforesis agonista de la corriente positiva.

Resultados representante

Músculo ventral longitudinal 6 está constituido por segmentos A2-A3 es el objetivo más comúnmente utilizados para la grabación (Broadie y Bate, 1993a-d, Harrison et al 1994;. Sweeney et al, 1995;. Renden et al 2001;. Huang et al 2006.; Mohrmann et al. 2008). En el embrión maduro y larvas recién nacidas de primer estadio (20-21 AEL horas a 25 ° C la eclosión =), los músculos 6 capacidad de células enteras es típicamente 25 a 30 pF, y las resistencias de entrada de 20 a 40 mW, cambiando con la edad del desarrollo. Máximo rango MNJ corrientes sinápticas de decenas de picoamperios (13-14 hrs AEL) a 1-2Na (20-21 hrs AEL), el rápido aumento en función de la edad. Medida directa de glutamato corrientes rendimiento máximo de las respuestas de cientos de picoamperios (13-14 hrs AEL) a 1,5 4NA justo antes de la eclosión. Los errores de la resistencia serie (resistencia total actual serie X) son por lo general <5 mV, pero en madurar, antes de la eclosión de embriones, puede ser tan alta como 10 + mV y por lo tanto la compensación serie de la resistencia que se aconseja. Los músculos de embriones con un diámetro medio de 10-30 micras, y la duración promedio de 40 a 80 micras, parecen mostrar los parámetros de espacio casi ideal de sujeción. Celular constantes pinza tiempo (R serie de células XC) promedio de menos de 0,25 milisegundos.

En el embrión maduro y larvas recién nacidas, la población de la neurona motora dorsal ha sido objeto de registro más limitado. Grabaciones revelan soma neuronal capacitancia de célula entera en el rango de 1,8 a 2,5 pF (2,0 pF promedio), resistencia a la serie de 40 a 60 mW y resistencia de entrada de ~ 5 GΩ (Baines y Bate, 1998; Featherstone et al 2005). Estas células claramente creciendo en tamaño y complejidad durante la maduración del embrión, y este crecimiento continúa durante todo el desarrollo larval. En estadios en tercer lugar, la capacitancia de célula entera es 17 a 20 pF, la resistencia en serie es 25 a 37 mW y un promedio de entrada de la resistencia ~ 900 mW (Rohrbough y Broadie, 2002; Richard Baines, comunicación personal). Conductancias iónicas a través de aumentar el desarrollo, pero la densidad de corriente (pA / pF) permanece notablemente constante. En los embriones maduros, las corrientes sinápticas promedio de 75 100pA en amplitud, con dos rápidos eventos ESC y corrientes prolongado promedio de ~ 500 ms (Baines y Bate, 1998; Featherstone et al 2005). En los embriones, estos eventos sostenido promedio de 3.5 por minuto, aumentando a aproximadamente 20 por minuto en la primera etapa (Baines Richard, comunicación personal). Tenga en cuenta que la complejidad morfológica y propiedades de la membrana de las neuronas de Drosophila hace que sea prácticamente imposible correctamente pinza de voltaje tanto de la célula más allá del soma. Así pues, hay grabaciones interpretar con cuidado.

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Discussion

Registro electrofisiológico de embriones de Drosophila requiere de la manipulación manual y la disección. La salud de la preparación y la calidad como consecuencia de las grabaciones, depende de un ser capaz de preparar de forma rápida y ordenada de los tejidos frágiles embrionarias para la grabación, y luego ejecutar el experimento. Experimentadores debe dominar tanto la disección de embriones y la electrofisiología de patch clamp antes de tratar de hacer frente a ambos a la vez.

Las grabaciones se pueden realizar de distintas variantes de la "norma modificada" o "como hemolinfa-" salinas (HL). Las principales diferencias entre estas dos clases de solución salina son: 1) concentración de Na + (120 a 135 mm estándar frente a 70 mM HL) y 2) la concentración de Mg 2 + (4 mm estándar frente a 20 mM HL). La principal ventaja de la alta concentración de Na + en la solución estándar para facilitar la acción potencial de propagación y, por lo tanto, el mantenimiento de la transmisión normal, patrón sináptico. Las salinas HL suprimir la acción potencial de la transmisión sináptica mediada. La diferencia en el Mg 2 +, que bloquea el voltaje canales de calcio, altera la amplitud de la transmisión sináptica y los cambios de la Ca 2 +-dependencia hacia arriba en el rango de las salinas HL (Stewart et al. 1994). HL salinas muestran, por tanto mucho menor amplitud de la transmisión sináptica en un momento dado [Ca 2 +]. El control cuidadoso de la osmolaridad elimina vacuolización celular tanto en salinas, y la morfología parece igual de bien conservados en solución salina. Ya que ni solución salina replica hemolinfa real, la selección de una solución salina debe reflejar las necesidades de la cuestión en estudio.

Existen varias pautas importantes para maximizar el éxito de las grabaciones de embriones. En primer lugar, la capacidad de formar con éxito sellos gigaohm en el músculo embrionario disminuye con la edad del desarrollo. Esto es probablemente debido principalmente al desarrollo de la membrana basal que rodea los músculos de maduración. Para contrarrestar esto, un tratamiento más prolongado colagenasa (1-2 min) es necesario. Sin embargo, se debe tener cuidado porque este tratamiento alarga enzimática rápidamente poner en peligro la inserción muscular en la pared del cuerpo, y puede conducir fácilmente a la separación del músculo. Una regla que hemos encontrado eficaz es la de limitar el tratamiento enzimático a ~ 50% del tiempo que provoca desprendimiento del músculo detectable. En segundo lugar, es crucial que el nervio tiene un ajuste forzado en el electrodo de succión para la estimulación adecuada, demasiado flojo y no el estímulo, demasiado apretado y no es posible estimular una sección adecuada del nervio. En nuestra experiencia, este es sin duda la mayor limitación para el éxito de una sola grabación NMJ. El diámetro adecuado para el electrodo de succión debe ser determinada empíricamente, sino todo lo posible para preservar un electrodo de estimulación buena, que puede ser utilizado fácilmente por un día entero de grabación. En tercer lugar, para las aplicaciones de éxito de neurotransmisores y drogas de la UNM, es muy importante que se familiarice con la colocación de sinapsis. Con la experiencia, las terminaciones estereotipos se pueden encontrar fácilmente con la óptica DIC. Para el principiante, las terminaciones nerviosas en el embrión puede ponerse de manifiesto con fluorescentes permeable a la membrana mitocondrial colorantes, tales como rodamina 123 o 4-Di-2-Asp (Yoshikami y Okun, 1984; Broadie y Bate, 1993). El embrión no es más que disecados expuestos a la tintura de colorante (5 mM, a 5 minutos) y elimina el exceso con varios lavados de suero fisiológico. La preparación se ve con un archivo adjunto de epifluorescencia y filtros adecuados. Enfoques similares se pueden utilizar las construcciones transgénicas que las buenas prácticas agrarias que marca la sinapsis embrionarias.

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Acknowledgments

KB es apoyado por el NIH subvención GM54544.

References

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Neurociencia Número 27 Drosophila el embrión células enteras patch-clamp músculo neuronas la unión neuromuscular sinapsis
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Chen, K., Featherstone, D. E.,… More

Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo. J. Vis. Exp. (27), e1348, doi:10.3791/1348 (2009).

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