Elektrofizyolojik Kayıt Drosophila Embriyo

Summary

Elektrofizyolojik kayıtlarından

Abstract

Drosophila, embriyonik gelişim ve fonksiyonel nörobilim çalışma için önde gelen genetik bir model . Geleneksel olarak, bu alanlar, büyük ölçüde bağımsız geçmişleri ve bilimsel topluluklar ile, birbirinden tamamen izole edilir. Ancak, bunlar genellikle birbirinden farklı alanlar arasında arayüz fonksiyonel elektriksel sinyal özellikleri ve nöral devre oluşumu son aşamalarında fonksiyonel kimyasal sinaps farklılaşma edinimi temel gelişim programları. Bu arayüz, soruşturma için son derece önemli bir alandır. Drosophila, fonksiyonel gelişimi bu aşamalarda son embriyogenez üçüncü sırasında <8 saatlik bir süre (25 ° C) sırasında oluşur. Bu geç gelişim döneminde uzun, sert, geçirimsiz epidermal manikür birikimine soruşturma nedeniyle dirençli kabul edildi. Bir atılım önceden yerel kontrollü geç evre embriyo diseksiyonu etkinleştirmek için manikür uygulanabilir, su polimerize cerrahi yapıştırıcı uygulama oldu. Dorsal longitudinal insizyon ile deneysel olarak incelenmesi için embriyonun ventral sinir kablosu ve vücut duvarı kas açığa, düz belirtilen olabilir. Tüm hücre patch-klemp teknikleri, daha sonra ayrı ayrı tanımlanabilir nöronlar ve somatik kaslar kayıt istihdam edilebilirler. Bu kayıt yapılandırmaları görünümünü ve olgunlaşma iyonik akımlar ve nöronlar ve kaslar hem de aksiyon potansiyeli yayılma izlemek için kullanılır olmuştur. Bu elektriksel özellikleri etkileyen genetik mutantlar, iyon kanalları ve ilgili sinyalizasyon kompleksleri moleküler yapısı ortaya çıkarmak için ve fonksiyonel farklılaşmanın moleküler mekanizmaların araştırılması başlamak için karakterize edilmiştir. Belirli bir odak noktası, merkezi sinir sistemi ve çevre, hem sinaptik bağlantıları montaj edilmiştir. Glutamaterjik nöromüsküler bileşke (NMJ), optik görüntüleme ve elektrofizyolojik kayıt bir kombinasyonu en erişilebilir. Bir bardak emme elektrot gerilim kenetli kas eksitatör bileşke akım (EJC) kayıtları ile, periferik sinir uyarmak için kullanılır. Bu kayıt yapılandırma sinaps fonksiyonel farklılaşma grafik ve presinaptik glutamat salınımını özelliklerin görünümü ve olgunlaşma izlemek için kullanılır olmuştur. Buna ek olarak, postsinaptik özellikleri, görünüm ve olgunlaşma glutamat reseptör alanları ölçmek için doğrudan kas yüzeye glutamat iyontoforez veya basınç uygulaması ile bağımsız test edilebilir. Böylece, hem de pre-ve postsinaptik unsurlar embriyonik sinaptogenez sırasında ayrı ayrı veya birlikte takip edilebilir. Bu sistem, ağır embriyonik sinaps oluşumunu bozar ve dolayısıyla sinaps bağlantıları ve fonksiyonel sinaptik sinyalizasyon özellikleri şartname ve farklılaşmasını düzenleyen moleküler mekanizmaları ortaya genetik mutantları ve karakterize etmek için kullanılmaktadır.

Protocol

Bölüm 1: Ekipman ve Malzemeleri

1. Drosophila embriyolardan Elektrofizyolojik kayıt ilk embriyonik diseksiyon teknikleri, başka vallahi video açıklanan yeterlilik gerektirir.
2. Drosophila embriyolardan Elektrofizyolojik kayıt standart yama kelepçe kayıt yapılandırmaları kullanır. Ayrıca diğer birçok hazırlıkları için uygun yama kelepçe kayıt donanım ve yazılım Drosophila embriyolar kayıt için uygundur. Drosophila embriyolar Diseksiyon sırasında bir kapak kayma yapıştırılmış olduğundan, kayıt haznesi kapağını fişleri kabul etmelidir. Lamel monte edildiği şekilde hazırlanması ve kalınlığı, mükemmel DIC optik ve uzun çalışma mesafesi objektif dik bir mikroskop gerektirir.
3. İki tür banyo çözümleri elektrofizyolojik kayıt için kullanılır; 1) "standart" (Jan Jan, 1976a) ya da "modifiye standart" (Broadie 2000) Salines, kayıt için diğer omurgasız sistemlerinde yaygın olarak kullanılan çözümler dayalı, ve 2) "haemolymph gibi" (HL) Salines (Stewart ve ark 1994), standart tuzlu ve Drosophila haemolymph ölçülen iyon konsantrasyonları arasında bir uzlaşmadır. Bu Salines hiçbiri doğru (Broadie 2000) kayıt için olumsuz haemolymph ölçülen iyon konsantrasyonları, taklit olduğu unutulmamalıdır. Standart tuzlu su içerir (mM): 135 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl _2, 1.8 CaCl2, 72 sakaroz, 5 TES, pH 7,2.

Bölüm 2: Kayıt Yapılandırması

1. Fizyolojik deneyler için, küçük bir pleksiglas kayıt odasında disseke embriyo hazırlık yerleştirilir (<0.5 ml) ve (diferansiyel girişim kontrast (Nomarski) optik ve uzun bir çalışma mesafesi 40-100X ile donatılmış dik bir bileşik mikroskop ile iletilen ışık görüntülenebilir genellikle 40X) su daldırma amacı (Broadie ve Bate, 1993a). Kayıtlar, yüksek sıcaklıklarda artan zorluk, genellikle oda sıcaklığında (16-22 ° C) altında yapılır (22 + ° C). Biz oda soğutma preapartion soğutma yerine, bunu başarmak.
2. Patch pipetler çeşitli fiber dolu bardak (örneğin borosilikat cam, 1 mm dış çapı) çekilebilir ve ipuçları 5-10 M son dirençleri yangın parlatılmış olmalıdır. Klorür gümüş topraklama kablosu banyosuna yerleştirilir. Sinyaller 2-10 Hz 8-kutuplu bir Bessel filtre ile filtrelenmiş ve ya on-line örneklenmiş dijital ya da daha sonraki analiz için saklanan bir yama klemp amplifikatör (örneğin Axopatch-1D, Axon Instruments) kullanılarak güçlendirilir.
3. Konvansiyonel patch-kelepçe kayıtları, en sık 18 ° C (~ 1 mikron id cilalı ipuçları ısı), borosilikat cam elyaf dolgulu çekti yama pipetler. Broadie et al, 1997;. Fergestad ve ark, 1999; Featherstone ve ark voltaj kelepçe (Standart holding potansiyelleri -60 -80 mV) (Broadie ve Bate, 1993a-d tespit multinucleate kas lifleri Şu kayıtları yapılır , 2000). Pipet yama çözüm içerir (mM): 120 KCl 20 KOH, 4 MgCl _2, 0.25 CaCl _2, 5 EGTA, pH 7,2 tamponlu 4 Na ₂ ATP, Sakkaroz, 36 ve 5 TES. Kayıt elektrotları geri doldurulur.

Bölüm 3: Kas Kaydı

1. Prensip olarak, herhangi bir embriyonik kas bu hazırlık kaydedilebilir. Uygulamada, çoğu kayıt en iç kas tabakası (Broadie ve Bate, 1993a-c Bate, 1990), ventral uzunlamasına kaslar üzerinde yoğunlaşmıştır. Kayıtları da bu kas tabakası dorsal ve lateral kasları (; Auld ve ark 1995; Nishikawa ve Kidokoro, 1995; arkadaşları Baumgartner 1996 Kidokoro ve Nishikawa, 1994) yapılmıştır. Ancak, çoğu deneyleri dört uzunlamasına, karın kasları grup (6,7,12,13), (A2-A3) ön karın özellikle kas 6 odaklanmak.
2. Genç embriyolar (<16 saat AEL) kas kayıt önce yok enzimatik tedavi gereklidir. Ancak, bir kas kılıfı daha sonra embriyo gelişir (> 16 saat AEL) ve yama kayıt önce kollajenaz (kollajenaz tip IV, 1 mg / ml kalsiyum katyon ücretsiz salin, RT 0.5-2 dakika) ile temizlenmesi gerekir. Enzim tedavisi, kas üzerindeki mühür dirençleri genellikle> 1 GΩ.
3. Patch-klemp kayıtları bir dizi standart teknikler kullanarak embriyonik kasları (; Broadie ve ark 1994, 1995, 1997; Broadie ve Bate 1993a-c Nishikawa ve Kidokoro, 1995). Bağlı hücre, herhangi bir standart yama kelepçe varyasyonlar, iç-dış-out - kas veya izole kas zarı yamaları tek kanal aktivitesini kaydetmek için istihdam edilebilir. Tek glutamat reseptör kanal aktivitesini (-60 mV ~ 12 pA) genellikle tüm hücre modunda kaydedilen spontan eksitatör birleşme akımlar (sEJCs) düşen faz üzerinde gözlemlenebilir.
4. Çoğu kayıt tam hücreli kayıt config yapılıraraya getirilir, hafif bir emme ya da bir elektrik "buzz" hücre bağlı devlet kolaylıkla başarılabilir. Kaslar voltaj kelepçe ya (-60 ile -80 mV tipik tutma potansiyelleri) veya akım kelepçe yapılandırmaları kaydedilebilir. Genç embriyoların (<13 saat AEL) kasları etkili bir şekilde embriyonik myotubes (Broadie ve Bate, 1993a) arasındaki geniş kaplin nedeniyle gerilim-kelepçeli olarak değil.; Bu (14 + AEL saat) gelişim evreleri (Ueda sonra sırasında genellikle bir sorun değil. Kidokoro, 1996).
5. Nystatin delikli yama klemp kayıt tam hücreli standart teknikleri (Broadie ve Bate, 1993a) ile elde edilen kayıtlar doğrulamak için kullanılabilir. Perforasyonu çözüm aşağıdaki gibi yapılır: 10 mg pluronic F-127 (Molecular Probes p-1572), 20 ml DMSO çözülür ve 10 mg Nystatin stok yapmak için bu çözüm çözülmüş. Stokunun 100 ul kayıt çözümü için 5 ml filtreli pipet çözüm eklenir. Tüm hücre akıntıları, genellikle mühür oluşumu <3 dakika sonra elde edilir. Seri direnç çoğu durumda belirgin şekilde artar ve hücreler (Broadie ve Bate, 1993a) artan bir kaçak akım gelişebilir.
6. Içe kalsiyum akımı (I _Ca): olgun embriyonik hücre tam voltaj kapılı akımı (larva) kas beş önde gelen bileşenleri (; Zagotta ve ark 1988 Broadie ve Bate, 1993b Wu ve Haugland, 1985) oluşur iki hızlı, inaktive akımları, gerilim-kapılı _(A) ve kalsiyum-bağımlı (I _CF) olmak üzere dört dışa potasyum akımları (Tsunoda ve Salkoff, 1995), ve iki gecikmiş, non-inaktive akımları, gerilim-kapılı (I _K) ve kalsiyum-bağımlı _(CS). İyon-ikame deneyler voltaj-klemp sırasında tüm hücre yanıtı (Broadie ve Bate, 1993b) bu ​​akımları incelemek için kullanılabilir.

Bölüm 4: Nöromüsküler Kavşak Uyarılma ve Kayıt

1. NMJ stimülasyon en yaygın ve güvenilir bir yöntem segmental periferik sinir bir cam üzerindeki emme elektrot kullanır. Emme elektrotlar fiber dolu elektrot cam (1-1.5 mikron dış çapı) çeşitli çıkarılmış olabilir ve istenen yapılandırma (~ 5 mikron iç çapı) elde etmek için yangın parlatılmış olmalıdır. Sıkı bir mühür formu için uygun segmental motor sinir küçük bir segment (<50 mikron) hafif bir emme ile pipet içine çekilir.
2. CNS çıkış noktasının yakınında sinir bir döngü içinde çizerek sağlam sinir teşvik etmek yaygındır. Bu yaklaşım, sağlam hazırlanması kolay stimülasyon sağlar, ancak spontan MSS-uyarılmış aktivite uygulanan stimülasyon paradigma üzerine bindirilmiş oluşabilir dezavantajı vardır. Bir alternatif kesim motor sinir teşvik etmektir. MSS kaldırılırsa, bu yordamı sinir streç eğilimi ve zarar görmesine neden olabilir etse de, bu elde edilebilir. Sinir, aynı zamanda keskin bir cam mikroelektrot ile kesilmiş, ancak bu prosedür sıkıcı ve zor olabilir. Bu kayıtlar bozulmamış hazırlık yapılmış olması tavsiye edilir.
3. Uyarım çeşitli paradigmalar ile uygulanabilir. Kısa stimülasyonu (0,2-1 msn) en iyi şekilde çalışır ve stimülasyon yoğunluğu emme yapılandırma (genellikle 1-5 V) bağlıdır ve her hücre için deneysel olarak tespit edilmelidir. Motor sinir stimülasyonu Suprathreshold en iyi biraz üstünde uyaran gücünü (1-2 volt) eşik ayarlayarak elde edilir. Yukarıda açıklandığı gibi Uyarılmış NMJ yanıtları yama kenetli kas kaydedilir. Şok artifakı ölçüde izole bir sanal zemin kullanımı ile azaltılabilir.
4. Standart emme elektrot sinir stimülasyonu daha az güvenilir bir alternatif, merkezi sinir sisteminin (Nishikawa ve Kidokoro, 1995) doğrudan uyarılması. 3-4 M KCl (veya KAC) ile dolu bir mikroelektrot ventral ganglion ve yoğunluğu microamp ~ 2 ~ süresi 2 milisaniye teslim edilir (Dietcher ve ark 1998) pozitif bakliyat ortasına yerleştirilir. Elektrot ucu stimülasyonu istenilen hemisegment yakın neuropil olmalıdır. Sinaptik iletim standart yapılandırma yama kenetli kas kaydedilir.
5. Embriyonik NMJ, farklılaşma boyunca tüm hücre patch-kelepçe kayıt erişilebilir. Eksitatör junctional akımı (EJC) kayıtları için, sinyalleri, (genellikle 1-2 KHz) filtreli, standart bir yama klemp amplifikatör ile kayıt altına alınır, bir analog-dijital arabirimi kullanan bir dijital sinyal dönüştürülür ve kullanarak bir bilgisayarla birlikte satın aldı uygun yazılım.

Bölüm 5: Nöromüsküler Kavşak Kimyasal ve İlaç Uygulamaları

1. Herhangi bir küçük, ücret molekül etkili embriyonik NMJ (Fergestad ve ark 1999, 2001 Aravamudan ve ark, 1999) üzerine iontophoresed olabilir. Iyontoforez pipetler, değişken süreler için uygulamaları ile olumlu ya da olumsuz akım darbeleri kullanarak belirli yapılandırmalar için çekilmiş olabilir. Pu arasındaki sızıntıyı önlemek için hayati önem taşımaktadıruygun bir karşıt desteğiyle lses mevcut (1993d Broadie ve ark. Featherstone ve ark 2002, 2005;. Rohrbough ve ark 2007). Bu desteğiyle mevcut büyüklüğünü pipet yapılandırma ile değişir ve deneysel olarak tespit edilmelidir.
2. (Broadie ve Bate, 1993c); pek çok deney, 100 mM stok solüsyonu (pH 8-9 Monosodyum tuz) kullanarak NMJ nörotransmitter, L-glutamat (Jan Jan, 1976b) ile yapılır olmuştur. Yüksek direnç iyontoforez pipetler (M 100-200), glutamat reseptör (gluR) haritalama (Broadie ve Bate, 1993d) için kullanılabilir ve düşük direnç pipetler (M 20-50) toplam gluR yanıt (Broadie ve ark tahmin etmek için kullanılmıştır. 1995, 1997; Featherstone ve ark 2002, 2005; Rohrbough ve ark 2007). Kısa akım sızıntısını önlemek için küçük, pozitif destek ile olumsuz akım (~ 10 nA) çalışması, bakliyat (0.1-1 ms).
3. Sigara-ücret ve ücret molekülleri basınç ejeksiyon (Fergestad ve Broadie, 2001; Featherstone ve ark 2001) tarafından uygulanabilir. Başvuru için, çözüm içeren bir basınç ejeksiyon pipet (<5 mm iç çap) sinir terminali (<10 mikron) yakın konumlandırılmış. Çıkarılabilen çözüm picospritzer (5-10 psi) veya diğer basınçlı hava kaynağı (Featherstone ve ark, 2002) kullanılarak yapılabilir. Normal banyo salin ile uzun süreli deneyler sırasında, kayıt odası (hacmi <0.5 ml) (0.2 ml / sn 0.1) sürekli perfüze edilmelidir.
4. Pek çok deney, füzyon sinaptik veziküller (Aravamudan, ve ark, 1999; Fergestad ve ark, 1999;. Featherstone, ve ark, 2000, 2002 Broadie ve ark 1995) tetiklemek için Hiperozmatik tuzlu su ile yapılmıştır. Gibi glutamat reseptörleri ve kara dul örümceğinin zehir içeren latroinsectotoxin (Broadie ve ark 1995) karşı argiotoxin 636 gibi toksinler, Diğer deneyler yapılmıştır.

Bölüm 6: Tamamlayıcı Nöromusküler Junction Vital Görüntüleme Teknikleri

1. Sinaptik vezikül kinetiği floresan lipofilik stryl boyalar (; Rohrbough ve ark 2004 Fergestad ve Broadie, 2001) ile izlenebilir. Veziküllerin doğrudan dağıtım gözlenen ve endositoz ve ekzositoz oranları ölçülen olabilir. Birçok varyasyonları farklı floresan özellikleri (FM4-64, rodamin-FM1-43, floresein gibi) ile yapılmıştır. Orijinal boya Değişiklikler değişmiş hidrofobik özellikleri olan ürünler elde edildi ve bu nedenle farklı yıkanmaya kinetiği; çok daha hızlı membran örneğin, FM2-10 ayrışmaktadır.
2. Stryl boya ile embriyonik NMJ etiketlemek için, 10 mcM FM1-43 artmış ekstraselüler potasyum (50-90 mM) (Fergestad ve Broadie, 2001) kullanarak 1-5 dakika yüklenebilir. Daha fizyolojik bir yaklaşım, bir sinir emme elektrot tarafından uyarılması ile elde edilebilir. Hazırlıklar, ^{Ca 2} + ücretsiz tampon 5 dakika sonra tekrar tekrar yıkanıp, floresan (boyalı sinaptik veziküller temsil) ölçülen korudu . Ekzositoz ölçmek için, bir yüksek potasyum veya sinir elektrik stimülasyonu kullanarak boya boşaltın.
3. GFP türevleri ile füzyon proteinleri, çok renkli etiketleme (. Zhang ve ark 2002 Marka, 1999) embriyonik NMJ sinaps izin üretilmiştir. GFP etiketli proteinlerin ifade birçok transgenik genel membran belirteçleri (örneğin mCD8-GFP), postsinaptik belirteçleri (örneğin Shaker GFP, GluRIIA-GFP), sitoskeletal (örneğin aktin-GFP, moesin-GFP, tubulin GFP) ve mitokondriyal dahil olmak üzere mevcut belirteçleri (örneğin Sitokrom C-GFP) ve sinaptik vezikül işaretleri (örneğin synaptobrevin-GFP, synaptotagmin-GFP; Zhang ve ark, 2002).
4. GFP gazetecilere, son derece dinamik ve gelişimsel özellikleri ya da mutant fenotipleri (Featherstone ve Broadie, 2000) değerlendirmek için kullanılabilir bölmeleri etiketi. Ağartma ve ardından floresan (sıkı bağlamak) kurtarma gözlemleyerek en az larva Drosophila NMJ (Yan ve Broadie, 2007; Zhang ve ark, 2002), mümkün olduğu gösterilmiştir. Ancak dikkatli bir kelime, bu belirteçlerin bazıları tamamen boş mutantlar kurtarmak değil ve hatta normal NMJ fizyolojisini değiştirebilir.

Bölüm 7: Orta Motor Nöronlar Kaydı

1. Birçok embriyonik nöronların soma konumu ve projeksiyon morfolojisi (Goodman ve Yılmaz, 1993; Landgraf ve ark 1997 Bate ve Martinez-Arias, 1993) göre ayrı ayrı tespit edilebilir. Ayrıca, GAL4/UAS sistemi (Marka ve Perrimon, 1993) tanımlanabilir nöron popülasyonları (Baines ve ark, 1998) görselleştirmek için GFP ifade hedefleyebilir. Dört motor nöronların (ACC ve RP1-4) ve bir interneuron PCC (Baines ve ark, 1998, 1999, 2001; güncel Kayıt çalışmalar embriyonik ventral sinir kablosu (VNC) içinde beş yüzeysel, dorsal nöronlar bir grup üzerinde yoğunlaştı. Rohrbough ve Broadie, 2002; Featherstone ve ark 1995).
2. Tespit nöronların hücre gövdeleri tam hücreli yama kelepçe kayıt elektrotları erişilebilir. VNC neurolemma kılıf ilk proteaz (Baines ve Bate, 1998 ile kısa odak tedavi ile temizlenmesi gerekir; Baines et al, 1999; Rohrbough ve Broadie, 2002). Dorsal nöronal hücre gövdeleri% 0.5-1 proteaz (kayıt salin yazın XIV (Sigma)) içeren geniş çaplı bir yama (~ 20 mikron) pipet kullanarak maruz kalmaktadır. MSS kılıf malzemesi kılıf rüptürlerinin (Featherstone ve ark 1995) kadar 1-2 dakika pipet içine emme çizilir. Sırasında hücresel kimlik kayıtları, lucifer sarı (Dipotasyum tuz, 1-2 mg / ml) onaylamak için hücrenin konumu ve morfolojisi görselleştirmek için yama çözüm eklenebilir.
3. Standart tam hücreli voltaj ve akım-klemp kayıtları (Featherstone ve ark, 2005 Rohrbough ve Broadie, 2002) yapılabilir. Dış kayıt tuzlu su içerir (mM): 140 NaCl, 3 KCl, 2 MgCl ₂ CaCl _2, 4, 5 Hepes, 10 sakaroz, 2 NaOH (pH 7,2). Yama çözümü içermektedir (mM): 140 K-Asetat, 2 MgCl _2, 0.1 CaCl2, 10 HEPES, 1.1 EGTA, 2 Na2-ATP, ~ 6 KOH (pH 7,2). Gerilim-klemp kayıtları 18 ° C -60 mV tutma potansiyelleri yapılır Tipik düzeltilmemiş dinlenme potansiyelleri -45 ile -65 mV aralığında (-52,9 ± 7.5 mV, ortalama ± SD, n = 78).
4. Kullanılabilir Testler gerilim-kapılı iyon akımları (Baines ve Bate, 1998), tekrarlayan aksiyon potansiyelleri, synaptically aracılı aktivite ve agonist-kapılı yanıtları (Baines ve ark, 2001) ortaya koymaktadır. Motor nöronların sinaptik giriş dakikada birkaç kez veya daha fazla (Baines ve ark meydana gelen AP-aracılı hem hızlı hızlı eksitatör sinaptik akımları (EKH) ve eksitatör giriş, periyodik ve sürekli (1 sn kadar süre) bölüm şeklinde kaydedilir. , 1999; Baines ve ark, 2001).
5. Hücre soma iontophoretically uygulanan asetilkolin (Ach) ve inhibitör verici GABA (Featherstone ve ark 2005 Baines ve Bate, 1998) cevap. ACh dH ₂ 0 100 mM ACh içeren bir keskin mikroelektrot ile pozitif akım tarafından agonist iyontoforez lehine 4-5 pH nöronal soma iontophoretically uygulanan olabilir.

Temsilcisi Sonuçlar

Harrison ve arkadaşları 1994; Sweeney 1995 ve ark. Renden ve ark 2001; Huang ve ark 2006; ventral uzunlamasına kas 6 A2-A3 kayıt için en sık kullanılan hedef (Broadie ve Bate, 1993a-d segmentleri. Mohrmann ve ark 2008). Olgun embriyo ve yeni yumurtadan ilk instar larva (20-21 saat AEL 25 ° C = kuluçka), kas 6 tüm hücre kapasitans genellikle 25-30 pF ve M giriş dirençleri 20-40, gelişimsel yaşla birlikte değişiyor. Picoamps onlarca (13-14 saat AEL) 1-2NA (20-21 saat AEL) Maksimal NMJ sinaptik akımları aralığı, yaş bir fonksiyonu olarak hızla artmaktadır. Doğrudan ölçüt glutamat kapılı akımları kuluçka için sadece önceden picoamps yüzlerce (13-14 saat AEL) 1.5 4NA maksimal cevaplar verir. Seri direnç hataları (toplam akım X serisi direnç) genellikle <5 mV, ancak, olgun, ön kuluçka embriyolar, 10 gibi yüksek olabilir + mV ve böylece seri direnç tazminat tavsiye edilir. Embriyonik kaslar, ortalama 10-30 mm çap ve 40-80 mikron ortalama uzunluğu neredeyse ideal bir alan kelepçe parametrelerini göstermek için görünür. Hücre kelepçe zaman sabitleri (R _serisi XC _hücre) ortalaması 0.25 'den daha az msn.

Olgun embriyo ve yeni yumurtadan larva, dorsal motor nöron nüfus, daha sınırlı bir kayıt konu olmuştur. Nöronal soma kayıtları, 1,8-2,5 pF (2.0 pF ortalama), M 40-60 seri direnç ve ~ 5 GΩ (; Featherstone ve ark 2005 Baines ve Bate, 1998) giriş direnci aralığında tüm hücre kapasitans ortaya koymaktadır. Bu hücreler embriyonik olgunlaşması sırasında açıkça boyut ve karmaşıklık olarak büyümeye ve bu büyümenin larva gelişimi boyunca devam eder. Üçüncü instars, tüm hücre kapasitans, 17-20 pF, seri direnç M 25-37 ve giriş direnci ortalama ~ 900 M (Rohrbough ve Broadie, 2002; Richard Baines, kişisel iletişim). İyonik conductances gelişimi boyunca artış, ancak akım yoğunluğu (pA / pF) dikkate değer sabit kalır. Olgun embriyolar, hızlı ESC olaylar ve ortalama ~ 500 milisaniye (Baines ve Bate, 1998; Featherstone ve ark 2005) uzun süreli akımlar ile genlik 75-100pA ortalama sinaptik akımları,. Embriyolar, bu sürekli olaylar dakikada ortalama 3-5, ilk instar (Richard Baines, kişisel iletişim) ~ 20 dakikada artan. Drosophila nöronlar morfolojik karmaşıklığı ve membran özellikleri, neredeyse imkansız soma ötesinde hücrenin düzgün gerilim kelepçe hale getirdiğini unutmayın . Bu yüzden dikkatli kayıtları yorumlanması gerekir.

Discussion

Drosophila embriyolardan Elektrofizyolojik kayıt manuel manipülasyon ve diseksiyon gerektirir. Hazırlanması, sağlık, ve bunun sonucunda kalite kayıtları, kayıt için kırılgan embriyonik dokularda hızla ve özenle hazırlamak mümkün bağlıdır ve sonra deney çalıştırmak. Deneyci bir kerede çözmek için çalışıyoruz önce embriyonik diseksiyonlar ve yama kelepçe elektrofizyoloji yeterli olmalıdır.

Kayıtlar "şekli değiştirilmiş standart" ya da "haemolymph gibi" (HL) Salines çeşitli türevleri birinde yapılabilir. Bu iki tuzlu sınıflar arasındaki başlıca fark 1) Na ⁺ konsantrasyonu (120-135 mM, 70 mM HL vs standart) ve 2) Mg ^{2 +} konsantrasyonu (4 mM standart vs HL 20 mM). Standart bir çözüm yüksek Na ⁺ konsantrasyonu en büyük avantajı, aksiyon potansiyel yayılma ve bu nedenle, normal, desenli sinaptik iletim bakım kolaylaştırmaktır . HL Salines aksiyon potansiyel aracılı sinaptik iletim bastırır. Fark voltaj kapılı kalsiyum kanalları engeller ^+, Mg ^2, sinaptik iletim genliğini değiştirir ve HL Salines (Stewart ve ark 1994) Ca ^{2 +-bağımlılık} aralığı yukarı doğru kaydırır. HL bu nedenle daha düşük sinaptik iletim genlikleri göstermek Salines belirli bir [Ca ^{2 +].} Ozmolarite dikkatli kontrol hem Salines hücresel vacuolation ortadan kaldırır ve morfolojisi eşit derecede iyi korunmuş ya da tuzlu su görünür. Ne salin gerçek haemolymph çoğaltır, bir salin seçim çalışması söz konusu ihtiyaçlarını yansıtmalıdır.

Embriyonik kayıtları başarısını en üst düzeye çıkarmak için bazı önemli kurallar vardır. İlk olarak, embriyonik kas gigaohm mühürler başarıyla kurma yeteneği gelişimsel yaşla birlikte azalır. Bu büyük olasılıkla öncelikle olgunlaşan kasları çevreleyen bazal membran gelişimi nedeniyle. Buna karşı önlem için, kollajenaz tedavi daha uzun süre (1-2 dk) gereklidir. Ancak, bu uzatılmış enzimatik tedavi hızla vücut duvarı kas eki uzlaşma olacak, çünkü dikkatli olmalı ve kolayca kas dekolmanına yol açabilir. Etkili bulduk bir kural saptanabilir kas dekolmanı neden ~% 50 enzim tedavisi sınırlamaktır. Çok gevşek ve stimülasyon başarısız, çok sıkı ve sinir yeterli bir bölümünde teşvik etmek mümkün değildir; İkincisi, sinir emme elektrot yeterli uyarılması için sıkı bir uyum olduğunu çok önemlidir. Bizim tecrübelerimize göre, bu kesinlikle başarılı NMJ kayıt için en büyük tek bir sınırlama yoktur. Emme elektrot için uygun çaplı deneysel olarak belirlenmiş olmalıdır, ama bütün bir gün için kayıt kolayca kullanılabilir iyi bir stimülasyon elektrot, korumak için her türlü çabayı yapılmalıdır. Üçüncü olarak, NMJ başarılı nörotransmitter ve ilaç uygulamaları için, sinaps yerleştirme aşina olmak için kritik öneme sahiptir. Tecrübesi ile kalıplaşmış sonlar DIC optik ile kolayca bulunabilir. Yeni başlayanlar için, embriyo sinir terminalleri rodamin 123 veya 4-Di-2-Asp (Broadie ve Bate, 1993a Yoshikami ve Okun, 1984) gibi membran permeant floresan mitokondriyal boyalar, ortaya çıkabilmektedir. Disseke embriyo sadece serum fizyolojik birkaç yıkama ile temizlenebilir boya (5mM, 5 dakika) ve aşırı boya maruz kalmaktadır. Hazırlanması, daha sonra bir epi-floresans eki ve uygun filtreler ile görüntülenebilir. Benzer yaklaşımlar embriyonik sinaps münasebetiyle transgenik GFP yapıları yararlanabilirler.