Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

Summary

Um protocolo curto para a coloração de proteínas com Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 em gel de poliacrilamida é descrito sem o uso de solventes orgânicos ou em ácido acético como nos procedimentos de coloração clássica com CBB.

Abstract

Em protocolos de proteína clássica coloração com Coomassie Brilliant Blue (CBB), soluções com alto teor de substâncias tóxicas e inflamáveis ​​solventes orgânicos (metanol, etanol ou 2-Propanol) e ácido acético são usados ​​para fixação, coloração e descoloração de proteínas em um gel após SDS -PAGE. Para acelerar o procedimento, o aquecimento da solução corante no forno de microondas por um tempo curto é freqüentemente usada. Isso geralmente resulta em evaporação do metanol tóxicos ou perigosos, etanol ou 2-Propanol e um forte cheiro de ácido acético no laboratório, que deve ser evitado devido a considerações de segurança. Em um protocolo publicado originalmente em dois pedidos de patente por EM Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), uma composição alternativa de solução de coloração é descrito em que nenhum solvente orgânico ou ácido é usado. A CBB é dissolvido em água bidestilada (60-80mg de CBB G-250 por litro) e 35 mM HCl é adicionado como o único composto outras na solução corante. A CBB staning do gel é feito após a lavagem SDS-PAGE e completa do gel em água bidestilada. Pelo aquecimento do gel durante a lavagem e coloração etapas, o processo pode ser concluído mais rapidamente e não compunds tóxicos ou perigosos são evaporando. A coloração das proteínas ocorre já dentro de 1 minuto após o aquecimento do gel na coloração da solução e está totalmente desenvolvido após 15-30 min com um fundo levemente azul que é totalmente descorados por lavagem prolongada do gel corado em água bidestilada, sem afetar as proteínas coradas bandas.

Protocol

Parte 1: Preparação da solução de coloração CBB

1. 60-80 mg de CBB G-250 são dissolvidos em 1 litro de água bidestilada pela agitação por 2-4 horas. Finalmente, 3 ml de HCl concentrado é adicionado à solução de azul escuro, com agitação por mais um minuto e armazenados no escuro para uso posterior. A solução pode ser armazenada por várias semanas até vários meses sem perder sua eficiência de coloração.
2. HCl concentrado deve ser tratado com o cuidado habitual und usada sob uma coifa. A solução final será em cerca de pH 2, por isso as luvas devem ser utilizadas e qualquer contacto com a pele devem ser evitados.

Parte 2: SDS-PAGE

1. Alíquotas adequadas de amostras de proteínas são misturadas com tampão de carregamento para uma concentração final de 1X tampão de carregamento. Nós usamos tampão de carregamento com 2x 125mm Tris/H3PO4 (pH 7,5 a 25 ° C), 2mM EDTA, SDS 4%, DTT 200mM, 0,02% azul de bromofenol e glicerol 50%. Buffers carregar outro para SDS-PAGE pode ser usado também.
2. Amostras de proteínas são aquecidas por cerca de 5 min antes do carregamento. Enquanto isso, a câmara de eletroforese em gel é preparado para a corrida. Usamos precast NuPAGE 4-12% © Bis-Tris géis (Invitrogen) em um SureLock XCell ® Mini-Cell (Invitrogen) com tampão MES-como o tampão de corrida, mas qualquer outro gel e um sistema de eletroforese pode ser usado também.
3. Amostras de proteínas são carregadas no gel e eletroforese de funcionar por 50 min em 220V.

Parte 3: A coloração do gel

1. A cassete de gel é desmontado eo gel colocado em uma caixa para as etapas subseqüentes de lavar roupa.
2. Cerca de 100 ml de água bidestilada é adicionado ao gel e aquecidos no forno de microondas por 30 segundos. Aquecimento deve ser interrompido antes da ebulição ocorre. A caixa com o gel é então colocada em um agitador por 3-5 min. e esta etapa de lavagem é repetida duas vezes com água fresca.
3. Solução de coloração bastante da CBB é adicionado para cobrir o gel na caixa ea caixa aquecida no microondas por 10 segundos. sem ferver. A caixa com o gel é então colocada em um agitador para o acabamento da coloração. Já depois de 1 minuto, as bandas de proteína pode ser observado, após 15-30 min. a coloração é forte o suficiente na maioria dos casos.
4. A solução de coloração é decantado e 50-100 ml de água bidestilada é adicionado a fim de prosseguir destain a luz de fundo azul do gel em uma coqueteleira. A água pode ser substituída por água fresca para mais de descoloração, se necessário.
5. O gel pode ser digitalizado, fotografado ou secas para armazenamento de longo prazo

Parte 4: Resultados Representante:

Ver fig. 1 para um gel corado adequadamente seguindo o procedimento descrito.

Ver fig. 2 para um gel que não tenha sido lavado o suficiente antes de coloração e SDS residual inibe coloração eficiente. Note-se que as faixas do marcador (*) contêm a mesma quantidade de proteínas marcadoras.

Fig. 1: Representante manchada gel após colocar as amostras de uma purificação de proteínas (*: marcador de peso molecular).

Fig. 2: CBB gel corado que não tenha sido lavado o suficiente antes de manchar CBB. As bandas de proteínas parecem mais fracos (note que o * lane marcador contém a mesma quantidade de proteína como na Fig. 1.).

Discussion

• Os passos de lavagem são críticos para a coloração eficiente das proteínas. Um menor tempo de lavagem com menos de 2 min ou volume reduzido de água (<50ml) pode resultar em pálida bandas de proteína azul, provavelmente devido a maior quantidade de SDS residuais no gel.
• Se as proteínas vão ser analisados ​​por espectrometria de massa, os passos de aquecimento no forno de microondas deve ser ignorada, o tempo para a lavagem do gel estendido para cerca de 10 min em cada etapa eo tempo de coloração prorrogado até a intensidade da banda é forte o suficiente . Aquecimento os resultados em gel de reticulação de proteínas para a matriz de gel e, assim, a detecção das proteínas por espectrometria de massa poderia ser prejudicada.
• Em vez de CBB G-250, pode-se usar CBB R-250 de acordo com o protocolo original de Wondrak. Nós não têm comparado os dois lados corantes a lado como tínhamos um estoque de CBB G-250 em nosso laboratório e teve bons resultados com este corante.
• A velocidade do processo, a omissão de solventes tóxicos ou perigosos nas etapas de lavagem e coloração são os fatores mais importantes e convincentes para a utilização deste protocolo. A sensibilidade está na mesma gama de protocolos de coloração clássica CBB e soluções de coloração comercial CBB e não foi um fator limitante para a nossa análise SDS-PAGE no campo de expressão e purificação de proteínas recombinantes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coomassie Brilliant Blue G-250	AppliChem	A3480	any other CBB G-250 could be used as well
Concentrated HCl