Summary
בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את גירוי בעור EpiDerm הבדיקה (EpiDerm SIT) פיתחו ומאומתים עבור
Abstract
גירוי בעור EpiDerm הבדיקה (EpiDerm SIT) פותחה
Protocol
I. מיזוג רקמות - יום 0
- עם קבלת ערכת EpiDerm EPI-200-SIT, לבדוק את כל מרכיבי הערכה שלמות (לפירוט ראה לוח ערכה של ריאגנטים ספציפיים וציוד).
- במשך כל שלוש רקמות EpiDerm, להכין צלחת אחת סטרילי 6-היטב מראש מלאים 0.9 מ"ל של מדיום assay.
- בתנאים סטריליים, פתח את שקית הניילון המכילה את צלחת 24 היטב המכיל את הרקמות ולהסיר את EpiDerm גזה סטרילי.
- שימוש במלקחיים סטרילי כדי להסיר כל להכניס המכיל את רקמת EpiDerm והמקום להכניס בצלחת 24 גם ריק. במהלך שלב זה, להסיר כל שנותר משלוח agarose כי שומרת על הצדדים החיצוניים של להכניס את ידי בעדינות על נייר סופג סינון סטרילי.
- בתוך 5 הדקות הבאות, ויזואלית לבדוק את הרקמות. אין להשתמש רקמות פגומות או רקמות אשר מכוסים לגמרי בנוזל.
- בעזרת צמר גפן סטרילי קצה, יבש בזהירות את פני השטח של הרקמות. נסה לא לגעת ישירות רקמה - תופעות נימי מספיקים כדי להסיר את הלחות מפני השטח רקמות.
- לאחר ייבוש השטח רקמות, רקמות כדי להעביר three בשורה העליונה של 6 צלחות היטב מראש מלאים 0.9 מ"ל של מדיום assay. שחרור כל בועות אוויר שנלכדו מתחת מוסיף את.
- מניחים את 6 צלחות המכילות גם מחדיר לתוך החממה במשך 60 ± 5 דקות מראש דגירה על 37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% לחות יחסית (לחות יחסית).
- בסוף של 60 ± 5 דקות תקופת טרום הדגירה, העברת מוסיף מבארות העליון לתוך בארות התחתון של צלחת 6-הבאר. מקמי את הצלחות בחזרה לתוך החממה (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% לחות יחסית) עבור לילה מראש הדגירה (18 ± 3 שעות).
- מניחים את שאר המדיום assay לתוך המקרר (5 ± 3 ° C). בעקבות לילה מראש דגירה, כימיקלים המבחן יכול להיות מיושם על הרקמות EpiDerm.
הערה: תהליך הדגירה מראש ניתן לקצר במקרה של משלוח רקמות מאוחר (למשל אם רקמות להגיע ביום רביעי במקום יום שלישי).
השנייה. חשיפה כימית - יום 1
- הכן אחד 6-גם צלחת לכל כימיים לבדוק באמצעות מילוי השורה העליונה רק עם 0.9 מ"ל לכל טוב של המדיום assay.
- כ 5 דקות לפני החשיפה המתוכננת לכימיקלים, להסיר את 6 גם צלחות המכילות מראש מותנה רקמות מן החממה.
- להעריך את פני השטח של הרקמות ולהסיר כל רטיבות באמצעות טיפים כותנה סטרילי.
- לייבל כל 6-מכסים היטב צלחת עם חומר קודי מבחן או שמות.
- מנה הרקמות עם כימיקלים מבחן ב 1 מרווחי דקה כדי להקל על שטיפה של כימיקלים מבחן לאחר החשיפה. שמור על צלחות עם רקמות במינון בשכונה סטרילי, עד רקמת האחרונה היא במינון.
- כדי לבדוק כימיקלים נוזליים, לוותר על 30 μL הפתרון ישירות על גבי רקמת והמקום רשת ניילון על פני הרקמות. אם יש צורך, בעדינות עמדת רשת באמצעות נורת בראשות זכוכית פיפטה פסטר. אל תלחץ על פני הרקמה.
- עבור semisolids בדיקות, להשתמש פיפטה תזוזה חיובית לוותר על 30 μL ישירות על גבי הרקמה. אם יש צורך להפיץ את החומר הכימי עם פיפטה פסטר כדי לכסות את פני השטח רקמות כמה שיותר.
- עבור חומרים מוצקים, זמן קצר לפני יישום של חומר הבדיקה, להרטיב את המשטח עם רקמה μL 25 של DPBS סטרילית. זו תשפר את הקשר של פני השטח רקמות עם כימיים הבדיקה. מלאו 25 מ"ג מכויל כפית חדה יישום (או כל כלי מתאים אחר) עם כ 25 מ"ג של חומר טחון הבדיקה. החלת מבחן כימי מוצק על פני השטח רקמות. במידת הצורך, להשתמש בנורה בראשות פיפטה פסטר לרוקן את הכף לחלוטין. נער בעדינות את מוסיף כדי לשפר את הפצת מוצק על פני השטח.
- עבור חומרים מבחן עם עקביות דונגי, לנסות להקים "עוגיה כמו" חתיכת שטוח על 8 מ"מ בקוטר למקם אותו על גבי רקמות, שהיה בעבר עם הרטובות DPBS סטרילית. כדי לשפר את הקשר בין חומר הבדיקה רקמות, לשקול את "עוגייה" עם פלדה אל חלד או סיוע פלסטיק.
- החל DPBS כמו שליטה שלילי SDS 5% כמו שליטה חיובית על הרקמות שליטה.
- לאחר מינון הרקמה שעברה, להעביר את כל הצלחות 35 ± 1 דקות החממה humidified (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% לחות יחסית).
- לאחר 35 ± 1 הדגירה דקות ב 37 מעלות צלזיוס להסיר את כל הצלחות מן החממה. מקמי את הצלחות אל מכסה המנוע סטרילית לחכות עד תקופה של 60 דקות חשיפה כימיים הושלמה עבור הרקמה במינון הראשון.
- לאחר מכן להתחיל את ההליך כביסה באמצעות להכניס אחד לכל מרווח זמן דקה (כדי insurדואר כי זמן החשיפה הכולל של הכנס היא כל 60 דקות).
- השתמש בקבוק לשטוף לשטוף את רקמות עם DPBS סטרילית. מלאו את רקמת להכניס 15 פעמים באמצעות זרם בלתי פוסק של DPBS ולרוקן אותו (הערה:. רקמות עם רשת ניילון, לשטוף את פני השטח רקמה 5 פעמים להסיר את רשת בזהירות עם מלקחיים, הצביע חדה לאחר מכן, המשך הנותר 10 שוטף).
- אחרי 15 השטיפה באמצעות בקבוק לשטוף, לחלוטין להטביע את 3 פעמים להוסיף 150 מ"ל DPBS ולנער כדי להסיר את שאריות החומר למבחן.
- לבסוף, לשטוף את הכנס רקמה פעם מבפנים ופעם מבחוץ עם DPBS סטרילית.
- הסר את כל העולה על DPBS מרקמת ידי בעדינות לוחץ את הכנס, והוא סופג את זה על נייר סופג סטרילית.
- העברת מוסיף רקמת מחק לצלחת 6-באר חדשה בעבר טרום מלאים בינוני assay. כל הצעדים האלה (14-18) חייב להיעשות בתוך דקות 1 עבור להכניס כל אחד.
- לאחר רקמות האחרון הוא שטף, יבש בזהירות את פני השטח של כל רקמות עם כותנה סטרילי היטה ספוגית.
- דגירה הרקמות בחממה של 24 הבא ± 2 שעות (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% לחות יחסית).
הערה: כל טכנאי assay לא צריך לבדוק יותר מ -6 חומרים מבחן כולל בקרות שליליות וחיוביות בטווח בדיקה אחת (סט), כדי להיות מסוגל לעקוב אחר פרוטוקול כמתואר להלן
ג. בתמורה בינונית - יום 2
- לאחר 24 ± 2 שעות שלאחר הדגירה, העברת מוסיף לתוך החלק התחתון של צלחת 6-הבאר, טרום מלאים 0.9 מ"ל של התקשורת. מדיה מן השורות העליונות ניתן לאסוף עבור ניתוח של נקודות קצה נוספות (ציטוקינים, chemokines וכו '). ניתוח של נקודות הקצה המשנית היא אופציונלית.
- המשך דגירה שלאחר (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% לחות יחסית) לעוד 18 ± 3 שעות.
IV. MTT Assay ליכולת הקיום - יום 3
- Two לייבל 24 גם צלחות עם שמות כימיים או קודים. צלחת אחת ישמש הדגירה רקמה עם MTT והשני בשלב החילוץ.
- הכן את הפתרון MTT על ידי הפשרת להתרכז MTT (5 מ"ג / מ"ל) ו דילול זה עם diluent MTT. הריכוז הסופי של פתרון MTT הוא 1 מ"ג / מ"ל.
- פיפטה 300 μL של פתרון MTT לבאר כל צלחת 24 הבאר.
- הסר את 6 צלחות היטב מן האינקובטור, כתם התחתון של מוסיף על נייר סופג, ולהעביר אותם לתוך צלחת 24 היטב מראש מלא MTT.
- מניחים את צלחת 24 גם בחממה (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% לחות יחסית) ו דגירה במשך 3 שעות ± 5 דקות. להקפיד על 3 שעות ± 5 דקות זמן הדגירה, כדי למנוע חריגה בין קריאות MTT שונים.
- כאשר הדגירה MTT הושלמה, השתמש משאבת יניקה בעדינות כדי לשאוב את המדיום MTT מכל הבארות.
- מילוי בארות עם DPBS ואת לשאוב שוב. חזור על פעולה זו שטיפה פעמיים נוספות ולוודא כי רקמות יבשות לאחר השאיפה האחרונה.
- לאחר שוטפת את העברת מוסיף לצלחת 24 באר חדשה. לטבול מחדיר בעדינות על ידי pipetting 2 extractant מ"ל פתרון (Isopropanol) להכניס לתוך כל אחד. רמת יעלו מעל בשוליו העליונים של הכנס, ובכך לחלוטין שוקע ברקמות.
- חותם את הצלחת 24 היטב (למשל, עם Parafilm או באמצעות שקית איטום) לעכב אידוי extractant. חלץ את MTT מן הרקמות לפחות 2 שעות בטמפרטורת החדר עם עדין רועדת על שייקר צלחת (~ 120 סל"ד). מיצוי לילה בלי לרעוד יכול לשמש גם.
- לאחר תקופת השאיבה היא מוחלטת, לנקב מחדיר מחט עם זריקה או נורת חרוזים פיפטה פסטר ולאפשר לחלץ את לרוץ לתוך הבאר שממנה להכניס נלקח.
- בטל להכניס ניקב ו פיפטה פתרון טוב למעלה ולמטה שלוש פעמים עד שהיא הומוגנית.
- במשך כל רקמה, העברת two 200 aliquots μL הפתרון formazan סגול לתוך צלחת שטוחה 96-היטב microtiter התחתונה. מעבירים את כפילויות על פי תכנון צלחת קבוע נתון בגיליון האלקטרוני הנלווית פרוטוקול וידאו. עבור החסר, להשתמש isopropanol.
- קרא את צפיפות אופטית (OD) של תמציות MTT ב ספקטרופוטומטר צלחת 96-היטב באמצעות אורך גל של 570 ננומטר (540-580) ללא מסנן התייחסות.
- הזן את התוצאות בגיליון האלקטרוני לצורך חישוב אוטומטי של התוצאות (איור 1).
- בדיקה כימית נקראת "מגרה" (R38 או קטגוריה GHS 2) אם הרקמה אחוז הכדאיות נקבעת על ידי assay MTT הוא <50% ביחס שליטה שלילית.
הערה: MTT רעיל, כדי להיות בטוח ללבוש כפפות מגן בעת הטיפול. הגן MTT וכך שלהlutions מן האור, שכן MTT אור רגיש. השתמש פתרון MTT בתוך כמה שעות לאחר הכנה כי זה מבזה לאורך זמן.
איכות V. Assay שולט
EpiDerm EPI-200-SIT ערכת הקריטריונים לקבלה:
במודלים חוץ גופית RHE אמור לספק עקבי, נתונים באיכות גבוהה לאורך זמן, לא רק במהלך תהליך האימות (8). בהנחיות מומלץ להבטיח לטווח ארוך reproducibility assay וביצועים כוללים "אפיון מלא של תאים או רקמות, דגימה של כל אחד ... הרבה עבור ביצועים, שימוש קבוע של בקרות וכימיקלים benchmark לספק הבטחת עקביות בביצועים assay" (9) . בנוסף הקריטריונים לקבלה assay המפורטים להלן, כל הרבה הייצור של EpiDerm הוא בקרת איכות נבדק על ידי היצרן נגד כימיים benchmark נוספות (1% Triton X-100). זמן החשיפה הדרוש כדי להפחית את הכדאיות רקמות כדי% 50 (ET-50) עבור Triton X-100 נקבעת. עבור EpiDerm, שנתי ממוצע ET-50 הערכים נעים בין 5.9 שעות עד 7.5 שעות. הרבה הרבה קורות חיים עבור רקמות בקרה שלילית (כלומר משונות כדאיות בסיסית) יש בממוצע פי 7.5% עבור כל שנה מאז 1996. הערך ET50 הרבה כל הייצור חייב ליפול בתוך 2 סטיות תקן מהממוצע ההיסטורי טריטון X-100 ET50 הוקמה בשנת 1996 (כלומר ET-50 = 6.7 שעות; להגביל קבלה תחתון = 4.8h; להגביל קבלה העליון = 8.7h) כדי להשתחרר לשימוש על ידי היצרן.
EPI-200-SIT Assay קבלה קריטריון 1: שליטה שליליות:
OD המוחלט של השלילית (NC) רקמות מלאה (שטופלו DPBS סטרילי) במבחן-MTT הוא אינדיקטור של הכדאיות רקמות שהושג במעבדה בדיקות לאחר משלוח ואחסון נהלים בתנאים מסוימים של שימוש. Assay עונה על קריטריון לקבלה אם OD כלומר 570 של רקמות NC היא ≥ ≤ 1.0 ו - 2.5.
EPI-200-SIT Assay קבלה קריטריון 2: שליטה חיובית
פתרון SDS (ב H 2 O) 5% משמש בקרה חיובית (PC) נבדק במקביל הכימיקלים הבדיקה. אמצעי במקביל כי המחשב צריך להיבדק אצל כל assay, אך לא יותר ממחשב אחד נדרש לכל בדיקה יום. הכדאיות של בקרה חיובית צריך להיות בתוך 95% של נתונים היסטוריים. Assay עונה על קריטריון לקבלה אם אומר את הכדאיות של רקמות PC כפי שבאה לידי ביטוי% מכלל הרקמות שליטה שלילי הוא 20%.
EPI-200-SIT Assay קבלה קריטריון 3: סטיית תקן (SD)
Irritancy העור הוא ניבא מן הכדאיות הממוצע נקבע על 3 רקמות יחיד ולכן השתנות של רקמת משכפל צריכה להיות נמוכה מקובלת. Assay עונה על קריטריון לקבלה אם SD מחושב מן הפרט רקמות viabilities% של 3 מטופלים זהה משכפל הוא <18%.
נציג תוצאות
Discussion
בסרטון הזה, אנחנו הדגימו את גירוי בעור EpiDerm הבדיקה (EpiDerm SIT) פיתחו ומאומתים עבור בדיקות עור במבחנה גירוי של כימיקלים, כולל מרכיבים קוסמטיים ותרופות. בעת ביצוע בשיטה זו, חשוב לעבוד בתנאים היגיינית להקפיד לעקוב אחר פרוטוקול תוקף, שכן סטייה בפרוטוקול עלול לגרום לתוצאות שונות. כמה שינויים של assay אפשריים, לעומת זאת, שינויים בפרוטוקול יש לדון ישירות עם המחברים.
המגבלה היחידה של שיטה זו היא התערבות אפשרית של החומר למבחן עם הקצה MTT. חומר הבדיקה בצבע אחד או ישירות מפחית MTT (ובכך מחקה פעילות dehydrogenase של המיטוכונדריה הסלולר) עלולים להפריע הקצה MTT. עם זאת, אלה חומר הבדיקה הם בעיה רק אם בעת הבדיקה MTT (כלומר 42 שעות לאחר החשיפה לחומר המבחן) כמות מספקת של חומר הבדיקה עדיין קיימות על (או) ברקמות. במקרה של אירוע זה סביר, הפחתת (נכון) MTT מטבוליות את התרומה על ידי חומר בדיקה או בצבע (שקר) הפחתה MTT ישירה של החומר למבחן ניתן לכמת באמצעות הליך תיאר בפרוטרוט את סדר assay תקן מבצע המסופקים על ידי MatTek קורפ
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות ל ZEBET בבית BFR (גרמניה), BASF SE (גרמניה), IIVS בע"מ (ארה"ב), מחנה הריכוז-LSL (אוסטריה) להשתתפות במחקר בינלאומי רב מרכזי אימות של EpiDerm השתנה SIT (5 ).
References
- Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. ngrid, Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests. ALTEX. 21, 107-114 (2004).
- Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test. ATLA. 33, 351-367 (2005).
- Kandárová, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication. ATLA. , Forthcoming (2009).
- Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H. The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA. 35, 559-601 (2007).
- Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances. Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Schäfer, M. R., Schäfer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kandárová, H. 15th Congress on Alternatives to Animal Experimentation, 2008 September 19-21, Linz Austria, , (2008).
- United Nations. Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS). , Second revised edition, UN. New York and Geneva. (2007).
- ESAC. Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing. , ESAC. (2008).
- Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers. Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).
- Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice. Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).
