Un In Vitro Test di Irritazione (SIT) con l'epidermide umana ricostituita epidermica (RHE) Modello

Summary

In questo video, dimostriamo il test di irritazione cutanea EpiDerm (EpiDerm SIT) sviluppato e validato per

Abstract

Il test di irritazione cutanea EpiDerm (EpiDerm SIT) è stato sviluppato

Protocol

I. condizionamento del tessuto - Giorno 0

1. Una volta ricevuta la EPI-200-SIT kit EpiDerm, controllare tutti i componenti del kit per l'integrità (per i dettagli vedi tabella kit di reagenti e attrezzature specifiche).
2. Per ogni tre tessuti EpiDerm, preparare uno sterile 6 pozzetti pre-riempite con 0,9 ml di terreno di coltura.
3. In condizioni sterili, aprire il sacchetto di plastica contenente il 24 pozzetti contenenti i tessuti EpiDerm e rimuovere la garza sterile.
4. Usa pinza sterile per rimuovere ogni inserto contenente il tessuto EpiDerm e posto l'inserto nel vuoto a 24 pozzetti. Durante questa fase, rimuovere qualsiasi residuo di spedizione agarosio che aderisce ai lati esterni della inserto assorbente da dolci su carta da filtro sterile.
5. Entro i prossimi 5 minuti, ispezionare visivamente i tessuti. Non utilizzare tessuti difettosi o tessuti che sono completamente coperti di liquido.
6. Utilizzando un tampone sterile punta del cotone, accuratamente asciugare la superficie dei tessuti. Cerca di non toccare il tessuto direttamente - effetti capillari sono sufficienti per eliminare l'umidità dalla superficie del tessuto.
7. Dopo l'essiccazione la superficie del tessuto, il trasferimento di tre tessuti alla riga superiore del 6-pozzetti pre-riempite con 0,9 ml di terreno di coltura. Fuoriuscire eventuali bolle d'aria intrappolate sotto gli inserti.
8. Luogo il 6-pozzetti contenenti gli inserti in incubatore per 60 ± 5 minuti di pre-incubazione a 37 ± 1 ° C, 5 ± 1% di CO _2, 95% RH (umidità relativa).
9. Alla fine del ± 60 5 minuti pre-periodo di incubazione, trasferire gli inserti dai pozzetti superiori nei pozzi inferiore del 6 pozzetti. Posizionare le piastre di nuovo nel incubatore (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% di CO _2, 95% UR) per una notte di pre-incubazione (18 ± 3 ore).
10. Mettere il resto del terreno di coltura in frigorifero (5 ± 3 ° C). Dopo la notte di pre-incubazione, sostanze chimiche in esame può essere applicata ai tessuti EpiDerm.

    Nota: La procedura di pre-incubazione può essere abbreviato in caso di consegna tardiva dei tessuti (ad esempio se i tessuti arriva il Mercoledì, invece di Martedì).

II. Esposizione chimica - Giorno 1

1. Preparare un 6 pozzetti per composto chimico in esame, compilando la riga superiore solo con 0,9 ml per pozzetto di terreno di coltura.
2. Circa 5 minuti prima della prevista esposizione a sostanze chimiche, rimuovere il 6-pozzetti contenenti la pre-condizione tessuti dal termostato.
3. Valutare la superficie dei tessuti e rimuovere l'umidità con punte di cotone sterile.
4. Etichettare tutti i 6 e coperchi piastra con i codici del materiale di prova o di nomi.
5. Dose i tessuti con i prodotti chimici prova a intervalli di 1 minuto per facilitare il risciacquo delle sostanze chimiche di prova dopo l'esposizione. Mantenere le piastre con i tessuti dosato nel cappuccio sterile, fino a quando il tessuto ultima è dosato.
6. Per testare sostanze chimiche liquide, dispensare 30 microlitri della soluzione direttamente in cima al tessuto e posizionare la rete di nylon sulla superficie dei tessuti. Se necessario, delicatamente posizione la maglia con il bulbo di vetro a capo pipetta Pasteur. Non premere sulla superficie del tessuto.
7. Per semisolidi prova, utilizzare una pipetta spostamento positivo per erogare 30 microlitri direttamente sopra il tessuto. Se necessario diffondere la chimica con pipetta Pasteur per coprire la superficie del tessuto il più possibile.
8. Per i materiali solidi, poco prima applicazione della sostanza in esame, inumidire la superficie del tessuto con 25 ml di DPBS sterile. Ciò permetterà di migliorare il contatto della superficie del tessuto con la sostanza chimica di prova. Riempire un cucchiaio 25 mg calibrato applicazione vivi (o qualsiasi altro strumento appropriato) con circa 25 mg di materiale finemente prova a terra. Applicare la chimica solida prova sulla superficie del tessuto. Se necessario, utilizzare una lampadina a capo pipetta Pasteur di svuotare completamente il cucchiaio. Agitare delicatamente gli inserti di migliorare la diffusione del solido sulla superficie.
9. Per le sostanze test con consistenza cerosa, cercare di formare un "cookie come" piatto pezzo di circa 8 mm di diametro e metterlo in cima al tessuto, che è stato precedentemente bagnato con DPBS sterile. Per migliorare il contatto tra la sostanza di prova e dei tessuti, appesantire il "cookie" con un acciaio inossidabile o di un aiuto di plastica.
10. Applicare DPBS come il controllo negativo e il 5% SDS come controllo positivo ai tessuti di controllo.
11. Dopo la somministrazione del tessuto scorso, il trasferimento di tutti i piatti per 35 ± 1 minuti alla umidificata incubatore (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% di CO _2, 95% di UR).
12. Dopo il 35 ± 1 minuti di incubazione a 37 ° C togliere tutti i piatti dal termostato. Posizionare le piastre all'interno della cappa sterile e attendere un periodo di 60 minuti di esposizione chimica è completata per il tessuto prima dosato.
13. Successivamente avviare la procedura di lavaggio utilizzando il un inserto per intervallo di tempo minuto (per assicurazionee che il tempo di esposizione totale per ogni inserto è di 60 minuti).
14. Utilizzare una bottiglia di lavaggio per lavare i tessuti con DPBS sterile. Riempire il tessuto inserire 15 volte utilizzando un flusso costante di DPBS e svuotarlo (Nota:. Per i tessuti con una maglia di nylon, lavare la superficie del tessuto 5 volte e rimuovere la rete accuratamente con la punta, pinze taglienti In seguito, proseguono con gli altri 10 lavaggi).
15. Dopo il 15 risciacquare con la bottiglia di lavaggio, completamente immergere il 3 volte inserto in 150 DPBS ml e agitare per rimuovere il resto del materiale di prova.
16. Infine, sciacquare l'inserto tessuto una volta dal di dentro e una volta dall'esterno con DPBS sterile.
17. Rimuovere l'eccesso di DPBS dal tessuto agitando delicatamente l'inserto, e assorbente che sulla carta assorbente sterile.
18. Trasferire gli inserti di tessuto cancellati per la nuova piastra a 6 e in precedenza pre-riempite con terreno di coltura. Tutti questi passaggi (14-18) deve essere effettuata entro 1 minuto per ogni inserto.
19. Dopo l'ultima tessuto è risciacquato accuratamente asciugare la superficie di ogni tessuto con un tampone di cotone sterile con punta.
20. Incubare i tessuti nell'incubatrice per i prossimi 24 ± 2 ore (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% di CO _2, 95% di UR).

    Nota: Ogni tecnico saggio non dovrebbe testare più di 6 sostanze in esame inclusi i controlli negativi e positivi in una corsa di prova singola (set), per poter seguire il protocollo come descritto di seguito

III. Mezzo di scambio - Giorno 2

1. Dopo il 24 ± 2 ore post-incubazione, trasferire gli inserti nella parte inferiore del 6 pozzetti, pre-riempita con 0,9 ml di media. Media da file superiori possono essere raccolti per l'analisi degli endpoint addizionale (citochine, chemochine, ecc.) Analisi degli endpoint secondario è facoltativo.
2. Continuare con la post-incubazione (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% di CO _2, 95% UR) per un altro 18 ± 3 ore.

IV. MTT Assay Fattibilità - Giorno 3

1. Etichettare due piastre da 24 pozzetti con i nomi chimici o codici. Una piastra servirà per l'incubazione del tessuto con MTT e l'altra per la fase di estrazione.
2. Preparare la soluzione MTT da scongelamento il concentrato MTT (5 mg / ml) e diluire con il diluente MTT. Concentrazione finale della soluzione MTT è di 1 mg / ml.
3. Pipettare 300 ml di soluzione MTT in ciascun pozzetto della piastra 24 pozzetti.
4. Rimuovere il 6-pozzetti da incubatore, asciugare la parte inferiore degli inserti su una carta assorbente, e trasferirli in 24 pozzetti pre-riempite con MTT.
5. Posizionare il 24 pozzetti in incubatrice (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% di CO _2, 95% UR) e incubare per 3 ore ± 5 min. Rispettare rigorosamente le 3 ore ± 5 minuti il ​​tempo di incubazione per evitare di scostamento tra MTT letture diverse.
6. Quando l'incubazione MTT è completo, utilizzare una pompa di aspirazione per aspirare delicatamente il medium MTT da tutti i pozzi.
7. Riempire i pozzetti con DPBS ed aspirare di nuovo. Ripetere questa lavaggio due volte di più e fare in modo che i tessuti sono a secco dopo l'aspirazione ultima.
8. Dopo il trasferimento lava gli inserti di un nuovo 24-pozzetti. Immergere gli inserti pipettando gentilmente 2 ml di soluzione estraente (isopropanolo) in ogni inserto. Il livello si alzerà sopra il bordo superiore dell'inserto, così completamente sommergere i tessuti.
9. Sigillare il 24 pozzetti (per esempio con Parafilm o con borsa di tenuta) per inibire l'evaporazione estraente. Estrarre il MTT dai tessuti per almeno 2 ore a temperatura ambiente agitando delicatamente su un agitatore (~ 120 rpm). Estrazione durante la notte senza agitazione può anche essere usato.
10. Dopo il periodo di estrazione è completa, perforare gli inserti con un ago da iniezione o bulbo perline pipetta Pasteur e consentire l'estratto a correre nel pozzo da cui ha tratto l'inserto.
11. Scartare l'inserto forato e pipetta la soluzione nel bene su e giù per tre volte fino a quando non è omogenea.
12. Per ogni tessuto, trasferire due aliquote 200 microlitri della soluzione viola formazano in un piatto fondo piatto da 96 pozzetti per microtitolazione. Trasferire i duplicati secondo il disegno piastra fissa dato nel foglio di calcolo che accompagna questo protocollo video. Per spazi vuoti, usare isopropanolo.
13. Leggere la densità ottica (OD) degli estratti MTT in uno spettrofotometro piastra a 96 pozzetti utilizzando una lunghezza d'onda di 570 nm (540-580), senza un filtro di riferimento.
14. Inserire i risultati nel foglio di calcolo per il calcolo automatico dei risultati (Figura 1).
15. Una sostanza in esame è etichettato 'irritante' (R38 o categoria GHS 2) la vitalità del tessuto percentuale determinata mediante test MTT è <50% rispetto al controllo negativo.
    

    Nota: MTT è tossico, quindi assicuratevi di indossare guanti protettivi quando si maneggia. Proteggere MTT e il suo modolutions dalla luce, dal momento che MTT è sensibile alla luce. Usare la soluzione MTT poche ore dopo la preparazione perché si degrada nel tempo.

Qualità saggio V. Controlli

• EpiDerm EPI-200-SIT kit Criteri di accettazione:

  Modelli in vitro RHE dovrebbero fornire dati coerenti, di alta qualità nel tempo, non solo durante il processo di convalida ^(8). Linee guida consigliate per assicurare a lungo termine la riproducibilità del test e le prestazioni sono "caratterizzazione completa di cellule o tessuti, il campionamento di ciascun lotto ... per le prestazioni e l'uso regolare dei controlli e prodotti chimici di riferimento per fornire garanzia di costanza di rendimento saggio" ⁽⁹⁾ . Oltre a criteri di accettazione del test descritta di seguito, ogni lotto di produzione di EpiDerm è il controllo di qualità testati dal produttore nei confronti di un prodotto chimico di riferimento aggiuntivo (1% Triton X-100). Il tempo di esposizione necessario per ridurre la vitalità del tessuto al 50% (ET-50) per il Triton X-100 è determinata. Per EpiDerm, media annua ET-50 i valori hanno spaziato da 5,9 ore a 7,5 ore. Il lotto di CV molto per tessuti di controllo negativo (cioè la variabilità della redditività di base) è stato in media sotto il 7,5% per ogni anno dal 1996. Il ET50 valore di ogni lotto di produzione deve rientrare nel 2 deviazioni standard rispetto alla media storica Triton X-100 ET50 fondata nel 1996 (cioè ET-50 = 6.7 ore, limite inferiore = 4.8h accettazione; limite di accettazione superiore = 8.7h), al fine per essere rilasciato per l'utilizzo da parte del fabbricante.

• EPI-200-SIT Assay accettazione Criterio 1: controllo negativo:

  L'OD assoluto del controllo negativo (NC), tessuti (trattati con DPBS sterili) nel MTT-test è un indicatore della vitalità del tessuto ottenuto in laboratorio di test dopo la spedizione e l'archiviazione delle procedure e in particolari condizioni di utilizzo. Il saggio soddisfa il criterio di accettazione, se la media OD ₅₇₀ di tessuti NC è ≥ 1,0 e ≤ 2,5.

• EPI-200-SIT Assay accettazione Criterio 2: controllo positivo

  Una soluzione al 5% SDS (in H ₂ O) è usato come controllo positivo (PC) e testato in concomitanza con le sostanze chimiche di prova. Significa Concurrent che il PC deve essere testato in ogni test, ma non più di un PC di test è richiesto per giorno. Vitalità del controllo positivo dovrebbe essere entro l'intervallo di confidenza al 95% dei dati storici. Il saggio soddisfa il criterio di accettazione, se la vitalità dei tessuti PC media espressa come% del tessuto di controllo negativo è del 20%.

• EPI-200-SIT Assay accettazione Criterio 3: Deviazione Standard (SD)

  L'irritazione cutanea è previsto dalla vitalità medio determinato il 3 singoli tessuti e quindi la variabilità delle repliche di tessuto devono essere accettabilmente basso. Il saggio soddisfa il criterio di accettazione, se la SD calcolato Viabilità singoli tessuti% dei 3 identicamente trattati replica è <18%.

Rappresentante Risultati

Figura 1 I risultati ottenuti per 6 articoli di prova, CN e controllo da PC -. Parte del foglio di calcolo automatico per il calcolo dei risultati. Test di prodotti chimici che hanno ridotto la vitalità del tessuto al di sotto del 50% riferito a NC sono classificate come irritanti. Il test è ottimizzato per fornire risultati che sono sufficientemente lontano dalla classificazione cut-off (50% vitalità), aumentando così la robustezza del test.

Materiale

Discussion

In questo video, abbiamo dimostrato il test di irritazione cutanea EpiDerm (EpiDerm SIT) sviluppato e validato per i test di irritazione cutanea in vitro di sostanze chimiche, tra cui ingredienti cosmetici e farmaceutici. Quando si esegue questo metodo, è importante lavorare in condizioni asettiche e di seguire rigorosamente il protocollo validato, in quanto deviazione dal protocollo possono causare risultati diversi. Alcune modifiche del test sono possibili, tuttavia, le modifiche al protocollo dovrebbero essere discusse direttamente con gli autori.

L'unica limitazione di questo metodo è una possibile interferenza della sostanza in esame con l'endpoint MTT. Una sostanza colorata o quella che riduce direttamente MTT (e mima quindi deidrogenasi dei mitocondri cellulari) possono interferire con l'endpoint MTT. Tuttavia, queste sostanza in esame sono un problema solo se al momento del test MTT (ossia 42 ore dopo l'esposizione della sostanza in esame), una quantità sufficiente di sostanza in esame sono ancora presenti sul (o nel) tessuti. Nel caso di questa eventualità, il (vero) riduzione MTT metabolica e il contributo di un materiale di prova o di colore (false) riduzione MTT diretto da parte del materiale in esame può essere quantificata mediante una procedura descritta in dettaglio nella procedura standard di funzionamento del test forniti da MatTek Corp.