एक इन विट्रो में त्वचा जलन टेस्ट (एसआईटी) Epiderm का उपयोग मानव Epidermal मॉडल (rhe) खंगाला

Published: July 13, 2009 doi: 10.3791/1366

Helena Kandárová¹, Patrick Hayden¹, Mitchell Klausner¹, Joseph Kubilus¹, John Sheasgreen¹

¹MatTek Corporation

Summary

इस वीडियो में, हम Epiderm त्वचा जलन (Epiderm एसआईटी) परीक्षण के लिए विकसित और मान्य का प्रदर्शन

Abstract

Epiderm त्वचा जलन परीक्षण (Epiderm एसआईटी) विकसित किया गया था

Protocol

मैं ऊतक कंडीशनिंग - 0 दिन

Epiderm किट महामारी-200-एसआईटी की प्राप्ति पर, अखंडता के लिए सभी किट घटकों (किट जानकारी के लिए विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरणों की तालिका देखें) की जाँच करें.
हर तीन Epiderm ऊतकों के लिए, एक बाँझ 6 अच्छी तरह से थाली परख माध्यम के 0.9 मिलीलीटर के साथ पहले से भरे तैयार करते हैं.
बाँझ शर्तों के तहत, 24 अच्छी तरह से युक्त थाली Epiderm ऊतकों युक्त प्लास्टिक बैग खुला और बाँझ धुंध हटायें.
बाँझ संदंश का प्रयोग करें प्रत्येक Epiderm ऊतक युक्त डालने हटाने और जगह खाली 24 अच्छी तरह से थाली में डालने. इस कदम के दौरान, किसी भी शेष शिपिंग agarose कि बाँझ फिल्टर पेपर पर सोख्ता कोमल द्वारा डालने के बाहरी पक्षों को पालन करता है हटा दें.
अगले 5 मिनट के भीतर, नेत्रहीन ऊतकों का निरीक्षण. जो पूरी तरह से तरल के साथ कवर कर रहे हैं दोषपूर्ण ऊतकों या ऊतकों का उपयोग न करें.
एक बाँझ कपास टिप झाड़ू का प्रयोग, ध्यान से ऊतकों की सतह शुष्क. नहीं ऊतक सीधे स्पर्श करने की कोशिश करो - केशिका प्रभाव ऊतक सतह से नमी हटाने के लिए पर्याप्त हैं.
ऊतक सतह सूखने के बाद, 6 अच्छी तरह से परख मध्यम 0.9 एमएल के साथ पहले से भरे प्लेटों के शीर्ष पंक्ति को तीन ऊतकों को हस्तांतरण. किसी भी हवाई बुलबुले रिलीज आवेषण नीचे फंस.
6 अच्छी तरह से 60 एक के लिए इनक्यूबेटर में आवेषण युक्त प्लेटें प्लेस ± 37 से कम 5 मिनट पूर्व ऊष्मायन ± 1 ° सी, ± 5 _1% 2 सीओ, 95% आरएच (सापेक्ष आर्द्रता) .
60 ± 5 मिनट पूर्व ऊष्मायन अवधि के अंत में, ऊपरी कुओं से 6 अच्छी तरह से थाली के निचले कुओं में आवेषण हस्तांतरण. प्लेटों इनक्यूबेटर में वापस प्लेस (37 ± 1 ° C ± 1% ₂ सीओ, 95% आरएच 5) के लिए एक पूर्व ऊष्मायन (18 ± घंटा 3) रातोंरात.
रेफ्रिजरेटर (5 ± 3 ° सी) में परख मध्यम के आराम के प्लेस पूर्व ऊष्मायन रातोंरात के बाद, परीक्षण रसायनों Epiderm ऊतकों को लागू किया जा सकता है.
नोट: पूर्व - ऊष्मायन प्रक्रिया देर ऊतक प्रसव के मामले में छोटा किया जा सकता है (जैसे अगर ऊतकों बुधवार को मंगलवार के बजाय आने) .

द्वितीय. रासायनिक जोखिम - दिवस 1

0.9 मिलीलीटर के साथ ही प्रति अच्छी तरह से परख माध्यम की ऊपरी पंक्ति को भरने के द्वारा एक परीक्षण रासायनिक प्रति 6 अच्छी तरह से थाली तैयार करो.
पहले की योजना बनाई रसायनों के संपर्क में लगभग 5 मिनट, 6 अच्छी तरह प्लेटें इनक्यूबेटर से पूर्व वातानुकूलित ऊतकों युक्त हटा दें.
ऊतकों की सतह का मूल्यांकन करें और किसी भी बाँझ कपास सुझावों का उपयोग नमी को हटा दें.
सभी 6 अच्छी तरह से थाली lids के परीक्षण सामग्री या कोड नाम के साथ लेबल.
खुराक 1 मिनट के अंतराल पर परीक्षण रसायनों के साथ ऊतकों को सुविधाजनक बनाने के लिए प्रदर्शन के बाद परीक्षण रसायनों के rinsing. बाँझ हुड में dosed ऊतकों के साथ प्लेटें रखें, जब तक पिछले ऊतक dosed है.
तरल रसायन का परीक्षण करने के लिए, ऊतक के ऊपर सीधे समाधान के 30 μL बांटना और ऊतकों की सतह पर नायलॉन जाल जगह. यदि आवश्यक हो, धीरे से गिलास पाश्चर विंदुक अध्यक्षता में बल्ब का उपयोग जाल स्थिति. ऊतक की सतह पर प्रेस मत करो.
परीक्षण semisolids के लिए, एक सकारात्मक विस्थापन विंदुक का उपयोग करने के लिए सीधे ऊतक के ऊपर 30 μL बग़ैर. यदि आवश्यक प्रसार पाश्चर विंदुक के साथ रासायनिक ऊतक जितना संभव सतह को कवर करने के लिए
ठोस सामग्री के लिए, शीघ्र ही परीक्षण पदार्थ के आवेदन से पहले, बाँझ DPBS के 25 μL के साथ ऊतकों की सतह गीला. यह परीक्षण रसायन के साथ ऊतक की सतह के संपर्क में सुधार होगा. पतले जमीन परीक्षण सामग्री का लगभग 25 मिलीग्राम के साथ एक 25 मिलीग्राम कैलिब्रेटेड तेज आवेदन चम्मच (या किसी अन्य उपयुक्त उपकरण) भरें. ठोस ऊतक सतह परीक्षण के लिए रासायनिक लागू करें. यदि आवश्यक हो, पाश्चर पिपेट अध्यक्षता बल्ब का उपयोग करें चम्मच को पूरी तरह खाली है. धीरे आवेषण मिलाने के लिए सतह पर ठोस के प्रसार में सुधार.
मोमी संगति के साथ परीक्षण पदार्थों के लिए, के बारे में 8 मिमी टुकड़ा व्यास में एक फ्लैट की तरह कुकी "और फार्म ऊतक है, जो पहले बाँझ DPBS के साथ गीला था के ऊपर यह जगह का प्रयास करें. परीक्षण पदार्थ और ऊतकों के बीच संपर्क में सुधार करने के लिए, नीचे एक स्टेनलेस स्टील या प्लास्टिक सहायता के साथ "कुकी" तौलना.
नकारात्मक नियंत्रण और एसडीएस नियंत्रण ऊतकों को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में 5% के रूप में लागू DPBS.
पिछले ऊतक dosing के बाद, 35 के लिए सभी प्लेटों ± 1 मिनट हस्तांतरण humidified (37 ± 1 ° सी, ± 5) 1% ₂ सीओ, 95% आरएच इनक्यूबेटर.
35 के बाद ± 1 मिनट 37 ऊष्मायन डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से सभी प्लेटों को हटा दें. बाँझ हुड में प्लेटें प्लेस और इंतजार जब तक 60 मिनट रासायनिक जोखिम के एक अवधि पहले dosed ऊतक के लिए पूरा हो गया है.
बाद में कपड़े धोने की प्रक्रिया शुरू मिनट का समय अंतराल के अनुसार एक डालने का उपयोग (करने के लिए बीमाई है कि हर डालने के लिए कुल जोखिम समय 60 मिनट है).
एक धोने की बोतल का उपयोग करने के लिए बाँझ DPBS साथ ऊतकों कुल्ला. DPBS के एक निरंतर प्रवाह का उपयोग करके 15 बार सम्मिलित ऊतक और भरण इसे खाली (ध्यान दें: एक नायलॉन जाल के साथ ऊतकों के लिए, ऊतक सतह 5 बार धोने और जाल बताया, तेज संदंश के साथ सावधानी से निकाल बाद में, शेष के साथ जारी 10) washes.
बाद 15 धोने की बोतल का उपयोग कर, पूरी तरह से डूब 150 मिलीलीटर DPBS में डालने 3 बार कुल्ला और परीक्षण सामग्री का शेष निकालने के लिए हिला.
अंत में, ऊतक डालने के अंदर से एक बार और कुल्ला बाँझ DPBS के साथ एक बार बाहर से.
धीरे डालने मिलाते हुए, और यह बाँझ सोख्ता कागज पर सोख्ता द्वारा ऊतक से DPBS के किसी भी अतिरिक्त निकालें.
नई 6 अच्छी तरह से पहले परख के माध्यम से पहले से भरे थाली blotted ऊतक आवेषण स्थानांतरण. इन कदमों के सभी (14-18) प्रत्येक डालने के लिए 1 मिनट के भीतर किया जाना चाहिए.
बाद पिछले ऊतक rinsed है, ध्यान से एक बाँझ कपास के साथ प्रत्येक ऊतक की सतह सूखी झाड़ू इत्तला दे दी.
अगले ± 24 2 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में ऊतकों सेते (37 ± 1 ° सी, 5 ± _1% 2 सीओ, 95% आरएच) .
नोट: प्रत्येक परख अधिक से अधिक 6 तकनीशियन एक एकल परीक्षण रन (सेट) में नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण सहित परीक्षण पदार्थों परीक्षण नहीं है, के रूप में नीचे वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करने में सक्षम होना चाहिए

III. मध्यम विनिमय - 2 दिन

24 के बाद ± 2 घंटे बाद ऊष्मायन, 6 अच्छी तरह से थाली, पूर्व मीडिया की 0.9 मिलीलीटर के साथ भरा के निचले हिस्से में आवेषण हस्तांतरण. ऊपरी पंक्तियों से मीडिया अतिरिक्त endpoints (साइटोकिन्स, chemokines आदि) के विश्लेषण के लिए एकत्र किया जा सकता है. माध्यमिक endpoints के विश्लेषण से वैकल्पिक है.
बाद ऊष्मायन के साथ जारी रखें (37 ± 1 डिग्री सेल्सियस, 5 ± _1% 2 सीओ, 95% आरएच) दूसरे ± 18 3 घंटे के लिए.

चतुर्थ. व्यवहार्यता MTT परख - 3 दिन

लेबल दो रासायनिक नाम या कोड के साथ 24 अच्छी तरह प्लेटें. एक थाली ऊतक ऊष्मायन लिए MTT के साथ सेवा और निष्कर्षण कदम के लिए अन्य.
MTT ध्यान केंद्रित (5 मिलीग्राम / एमएल) विगलन और MTT मंदक के साथ गिराए MTT समाधान तैयार है. MTT समाधान के अंतिम एकाग्रता 1 मिलीग्राम / एमएल है.
पिपेट 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में 300 MTT समाधान के μL.
इनक्यूबेटर से 6 अच्छी तरह प्लेटें निकालें, एक सोख्ता कागज पर आवेषण के नीचे दाग, और उन्हें 24 MTT के साथ अच्छी तरह से पूर्व से भरे थाली में स्थानांतरण.
इनक्यूबेटर में 24 अच्छी तरह से थाली प्लेस (37 ± 1 डिग्री सेल्सियस, ± 1% ₂ सीओ, 95% आरएच 5) और 3 घंटे के लिए सेते ± 5 मिनट. कड़ाई से 3 घंटे का पालन ± 5 मिनट ऊष्मायन समय के लिए अलग MTT रीडिंग के बीच विचलन से बचने के.
जब MTT ऊष्मायन पूरा हो गया है, एक चूषण पंप का उपयोग करने के लिए धीरे सभी कुओं से MTT मध्यम aspirate.
कुओं DPBS के साथ फिर से भरना और फिर aspirate. इस rinsing के दो से अधिक बार दोहराएँ और यकीन है कि ऊतकों पिछले आकांक्षा के बाद सूख रहे हैं.
Washes के बाद एक नया 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए आवेषण हस्तांतरण. धीरे प्रत्येक डालने में 2 एमएल extractant समाधान (Isopropanol) pipetting द्वारा आवेषण विसर्जित कर दिया. स्तर डालने के ऊपरी किनारों से ऊपर उठकर इस तरह पूरी तरह से ऊतकों submerging.
24 अच्छी तरह से थाली (Parafilm या सील बैग का उपयोग कर के साथ उदाहरण के लिए) सील extractant वाष्पीकरण को बाधित. ऊतकों से कमरे के तापमान पर कम से कम 2 घंटे के लिए एक थाली प्रकार के बरतन (~ 120 rpm) पर कोमल झटकों के साथ MTT निकालें. मिलाते हुए बिना ओवरनाइट निकासी भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
निष्कर्षण अवधि के बाद पूरा हो गया है, बींधना एक इंजेक्शन सुई या बल्ब पाश्चर विंदुक मनके और निकालने के लिए अच्छी तरह से जो डालने लिया गया था में चलाने के लिए अनुमति देते हैं के साथ आवेषण.
हवा निकाल डालने त्यागें और विंदुक समाधान अच्छी तरह से और नीचे तीन बार में जब तक यह समरूप है.
प्रत्येक ऊतक के लिए, एक 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे microtiter प्लेट में दो बैंगनी formazan समाधान के 200 μL aliquots हस्तांतरण. तय थाली स्प्रेडशीट में इस वीडियो प्रोटोकॉल के साथ दिए गए डिजाइन के अनुसार डुप्लिकेट स्थानांतरण. कारतूस के लिए, isopropanol का उपयोग करें.
MTT के अर्क के ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) एक 96 अच्छी तरह से थाली एक संदर्भ फिल्टर के बिना 570 एनएम (540-580) की एक तरंग दैर्ध्य का उपयोग स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में पढ़ें.
परिणामों के स्वचालित गणना (चित्रा 1) के लिए स्प्रेडशीट में परिणाम दर्ज करें.
एक परीक्षण 'अड़चन' (R38 या GHS वर्ग 2) रासायनिक लेबल है अगर प्रतिशत ऊतक MTT परख द्वारा निर्धारित व्यवहार्यता <50% नकारात्मक नियंत्रण के सापेक्ष है.
नोट: MTT विषैला होता है, तो सुरक्षात्मक दस्ताने पहनते हैं, जब से निपटने के लिए सुनिश्चित हो. MTT और इसकी इतनी की रक्षाप्रकाश से, MTT के बाद lutions प्रकाश संवेदनशील है. तैयारी के बाद कुछ घंटे के भीतर MTT समाधान का उपयोग करें, क्योंकि यह समय के साथ degrades.

वी. परख गुणवत्ता नियंत्रण

Epiderm महामारी-200-एसआईटी किट स्वीकृति मानदंड:
इन विट्रो rhe मॉडल में सत्यापन प्रक्रिया ⁽⁸⁾ के दौरान न सिर्फ समय के साथ लगातार, उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्रदान करना चाहिए . अनुशंसित दिशा निर्देशों के लिए लंबी अवधि परख reproducibility और प्रदर्शन को सुनिश्चित करने के कोशिकाओं या ऊतकों के पूर्ण लक्षण, प्रत्येक स्थल का नमूना ... प्रदर्शन के लिए, और नियंत्रण और बेंचमार्क रसायनों का नियमित उपयोग करने के लिए परख प्रदर्शन की ^{निरंतरता का आश्वासन} प्रदान "(9) शामिल हैं . परख स्वीकृति नीचे उल्लिखित मानदंडों के अलावा, Epiderm के प्रत्येक उत्पादन बहुत गुणवत्ता नियंत्रण के खिलाफ एक अतिरिक्त बेंचमार्क रासायनिक निर्माता द्वारा परीक्षण (1% ट्राइटन X-100) है. जोखिम समय ट्राइटन X-100 निर्धारित किया जाता है के लिए 50% (एट 50) के लिए ऊतक की व्यवहार्यता को कम करने की जरूरत है. Epiderm के लिए, वार्षिक औसत एट मान 50-7.5 5.9 बजे से बजे तक लेकर है. बहुत नकारात्मक नियंत्रण ऊतकों के लिए बहुत CV (यानी आधारभूत व्यवहार्यता में परिवर्तनशीलता) के तहत 1996 के बाद से हर साल के लिए 7.5% औसत है. में आदेश प्रत्येक उत्पादन बहुत की ET50 मूल्य ऐतिहासिक 100 एक्स ट्राइटन ET50 औसत में स्थापित 1996 (; लोअर स्वीकृति सीमा = 4.8h ऊपरी स्वीकृति सीमा 8.7h = यानी एट 50 = 6.7 घंटे) के 2 मानक विचलन के भीतर गिर चाहिए निर्माता द्वारा इस्तेमाल के लिए जारी किया.
महामारी-200 एसआईटी परख स्वीकृति मानदंड: 1 नकारात्मक नियंत्रण:
MTT-परीक्षण में नकारात्मक नियंत्रण (नेकां) ऊतकों (बाँझ DPBS के साथ इलाज) के पूर्ण आयुध डिपो ऊतक परीक्षण प्रयोगशाला में शिपिंग और भंडारण प्रक्रियाओं के बाद और उपयोग की विशिष्ट परिस्थितियों के तहत प्राप्त की व्यवहार्यता का एक संकेतक है. परख स्वीकृति कसौटी को पूरा अगर नेकां ऊतकों का _मतलब 570 आयुध डिपो ≥ 1.0 और 2.5 ≤ है .
महामारी-200-एसआईटी परख स्वीकृति मानदंड 2: सकारात्मक नियंत्रण
एक 5% एसडीएस (एच ₂ हे में) समाधान सकारात्मक नियंत्रण (पीसी) के रूप में प्रयोग किया जाता है और परीक्षण के रसायनों के साथ समवर्ती परीक्षण किया. समवर्ती का मतलब है कि पीसी के लिए प्रत्येक परख में परीक्षण किया है, लेकिन एक पीसी से अधिक नहीं दिन परीक्षण के प्रति आवश्यक है. सकारात्मक नियंत्रण की व्यवहार्यता ऐतिहासिक डेटा के 95% विश्वास अंतराल के भीतर होना चाहिए. परख स्वीकृति कसौटी मिलता है यदि पीसी के ऊतकों का मतलब व्यवहार्यता व्यक्त के रूप में नकारात्मक नियंत्रण ऊतकों की% 20% है.
महामारी-200 एसआईटी परख स्वीकृति मानदंड 3: मानक विचलन (एसडी)
त्वचा irritancy मतलब 3 एकल ऊतकों पर निर्धारित व्यवहार्यता से भविष्यवाणी की है और इसलिए ऊतक की परिवर्तनशीलता replicates acceptably कम किया जाना चाहिए. परख स्वीकृति कसौटी को पूरा अगर हूबहू इलाज 3 के व्यक्तिगत% ऊतक viabilities से गणना एसडी प्रतिकृति <18% है.

प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1 6 परीक्षण लेख, नेकां और पीसी पर नियंत्रण के लिए प्राप्त परिणाम - स्वचालित स्प्रेडशीट के परिणामों की गणना के लिए भाग . टेस्ट रसायनों है जो 50% से नीचे ऊतक व्यवहार्यता नेकां को संदर्भित कम परेशानी के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं. परीक्षण के परिणाम है कि पर्याप्त कटौती बंद वर्गीकरण (50% व्यवहार्यता) इस प्रकार परख की मजबूती बढ़ाने से दूर कर रहे हैं प्रदान करने के लिए अनुकूलित है.

माल

Discussion

इस वीडियो में, हम Epiderm त्वचा जलन (Epiderm एसआईटी) परीक्षण विकसित और कॉस्मेटिक और दवा सामग्री सहित रसायनों के इन विट्रो त्वचा जलन परीक्षण में के लिए मान्य प्रदर्शन किया है. जब इस पद्धति का प्रदर्शन, यह महत्वपूर्ण है सड़न रोकनेवाला परिस्थितियों में काम करने के लिए और सख्ती से मान्य प्रोटोकॉल का पालन करें, प्रोटोकॉल से विचलन के बाद से अलग परिणामों का कारण हो सकता है. परख के कुछ संशोधनों संभव हो रहे हैं, तथापि, लेखकों के साथ प्रोटोकॉल के लिए परिवर्तन सीधे चर्चा की जानी चाहिए.

इस पद्धति का ही सीमा MTT endpoint के साथ परीक्षण पदार्थ के एक संभव हस्तक्षेप है. एक रंग का पदार्थ परीक्षण या एक है (और इस तरह सेलुलर mitochondria के डिहाइड्रोजनेज गतिविधि mimics) है कि सीधे MTT कम कर देता है MTT endpoint के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. हालांकि, इन परीक्षण पदार्थ एक समस्या केवल MTT (यानी 42 घंटे परीक्षण पदार्थ प्रदर्शन के बाद) परीक्षण परीक्षण पदार्थ की पर्याप्त मात्रा के समय में अगर पर अभी भी मौजूद हैं (या) ऊतकों हैं. इस अप्रत्याशित घटना है, (सही) चयापचय MTT कमी और एक रंग का परीक्षण सामग्री द्वारा योगदान या (झूठी) परीक्षण सामग्री द्वारा प्रत्यक्ष MTT कमी परख मानक ऑपरेशन द्वारा प्रदान की प्रक्रिया में विस्तार में वर्णित प्रक्रिया द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है है के मामले में MatTek कॉर्प

Acknowledgments

लेखकों को संशोधित Epiderm एसआईटी ⁽⁵ मल्टी केंद्र अंतर्राष्ट्रीय मान्यता अध्ययन में भाग लेने के के लिए (जर्मनी) BfR, BASF एसई (जर्मनी), IIVS इंक (यूएसए), Zet - LSL (ऑस्ट्रिया) में ZEBET धन्यवाद करना चाहते हैं ^).

References

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