In Vitro Раздражение кожи испытаний (ГСИ), используя эпидермиса реконструкции человеческого эпидермального (RHE) Модель

Published: July 13, 2009 doi: 10.3791/1366

Helena Kandárová¹, Patrick Hayden¹, Mitchell Klausner¹, Joseph Kubilus¹, John Sheasgreen¹

¹MatTek Corporation

Summary

В этом видео, мы демонстрируем раздражение эпидермиса кожи испытаний (эпидермиса SIT) разработаны и утверждены для

Abstract

Раздражение кожи эпидермиса тест (эпидермиса SIT) была разработана

Protocol

И. ткани кондиционирования - день 0

После получения эпидермиса EPI-200-SIT комплект, проверьте все компоненты набора для целостности (для комплекта подробнее см. Таблица специфических реагентов и оборудования).
На каждые три тканей эпидермиса, подготовить один стерильный 6-луночный планшет предварительно заполнены 0,9 мл анализа среды.
В стерильных условиях, откройте пластиковый пакет с 24-луночного планшета содержащие эпидермиса ткани и удалить стерильной марлей.
Используйте стерильные щипцы для удаления каждого вкладышем, содержащим эпидермиса ткани и место вставки в пустой 24-луночного планшета. На этом шаге, удалите все оставшиеся доставки агарозы, что придерживается внешней стороны, осторожно вставить промокательной на стерильную фильтровальную бумагу.
В течение следующих 5 минут, осмотрите тканей. Не используйте дефектные ткани или ткани, которые полностью покрыты жидкостью.
Использование стерильного тампона наконечник хлопок, тщательно просушите поверхность ткани. Старайтесь не прикасаться к ткани напрямую - капиллярные эффекты являются достаточными, чтобы удалить влагу с поверхности ткани.
После высыхания поверхности ткани, передачу три тканей к верхней строке 6-луночных предварительно заполнены 0,9 мл анализа среды. Выпуск любых воздушных пузырьков под вставками.
Место 6-луночных содержащих вставки в инкубатор для 60 ± 5 мин предварительной инкубации при температуре 37 ± 1 ° C, 5 ± 1% СО _2, 95% RH (относительная влажность).
В конце 60 ± 5 мин предварительно инкубационного периода, передача вставками из верхних скважин в нижнюю скважин 6-луночный планшет. Место пластины обратно в инкубатор (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% СО _2, 95% относительной влажности) на ночь предварительной инкубации (18 ± 3 ч).
Место остальной анализа среды в холодильнике (5 ± 3 ° С). После ночи предварительной инкубации, испытание химических веществ могут быть применены к эпидермиса тканей.
Примечание: предварительной инкубации процедура может быть сокращен в случае поздней доставки ткани (например, если ткани прибыть в среду вместо вторника).

II. Химическое воздействие - День 1

Подготовка одного 6-луночный планшет на тест химической, заполняя верхний ряд только с 0,9 мл на лунку анализа среды.
Примерно за 5 минут до запланированного воздействия химических веществ, удалить 6-луночных содержащие предварительно обусловленной тканей из инкубатора.
Оценка поверхность ткани и удалить влагу использованием стерильных советы хлопка.
Этикетка всех 6-и крышки пластинку с тестового материала коды или имена.
Доза тканей с химическими тест интервалом в 1 минуту, чтобы облегчить промывку испытаний химических веществ после воздействия. Храните пластины с дозированной тканей в стерильных капот, до последнего ткани дозируется.
Для проверки жидких химикатов, дозируют 30 мкл раствора непосредственно поверх ткани и поместите нейлоновая сетка на поверхности ткани. При необходимости, мягко позиции меш, используя лампу возглавлял стекло пипетки Пастера. Не нажимайте на поверхности ткани.
Для тестирования semisolids, использовать положительный пипетки смещение обойтись 30 мкл прямо поверх ткани. При необходимости распространения химического с пипетки Пастера для покрытия поверхности ткани как можно больше.
Для твердых материалов, незадолго до применения исследуемого вещества, смочите ткань поверхность с 25 мкл стерильной DPBS. Это позволит улучшить контакт с поверхностью ткани химического теста. Заполнить 25 мг калиброванный резкое ложку приложение (или любой другой подходящий инструмент) с приблизительно 25 мг мелко материала полигоне. Применение твердых химических тест поверхности ткани. Если необходимо, используйте лампу возглавлял пипетки Пастера в пустой ложкой полностью. Осторожно встряхните вставками для улучшения распространения твердого тела на поверхность.
Для тестовых веществ с восковой консистенции, попытаться сформировать плоскую "печенья, как" кусок около 8 мм в диаметре и поместите его поверх ткани, которая ранее была смоченной стерильным DPBS. Для улучшения контакта между испытуемого вещества и ткани, весят вниз "Маркер" с нержавеющей стали или пластика помощи.
Применить DPBS как отрицательный контроль и 5% SDS как положительного контроля в контроль тканей.
После дозирования последних ткани, передать все пластины для 35 ± 1 минуты до увлажненного инкубатора (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% СО _2, 95% относительной влажности).
После 35 ± 1 мин инкубации при температуре 37 ° C удалить все пластины из инкубатора. Место пластины в стерильную капот и ждать, пока в течение 60 минут воздействия химических веществ не завершится первый дозированного ткани.
После начала процедуры промывки использованием одной вставить в минуту интервал времени (для страхованияе, общее время экспозиции для каждого вставка 60 минут).
Используйте мыть бутылки для полоскания тканей стерильным DPBS. Заполните ткани вставить в 15 раз с помощью постоянного потока DPBS и проводить его (Примечание:. Для тканей с нейлоновой сеткой, мыть поверхности ткани в 5 раз и удалить сетку осторожно отметил, острые щипцы После этого продолжить оставшиеся 10 моет).
После 15-го промыть использованием мыть бутылки, полностью погрузить в воду вставить 3 раза в 150 мл DPBS и встряхнуть, чтобы удалить оставшуюся часть тестового материала.
Наконец, прополощите ткань вставить один раз изнутри и как только снаружи стерильной DPBS.
Удалите излишки из DPBS из ткани, слегка встряхивая вставки и промокательной его на стерильную промокательной бумаги.
Передача уничтожены вставками ткани на новый 6-луночный планшет ранее предварительно заполнены анализа среды. Все эти шаги (14-18) должно быть сделано в течение 1 мин для каждой вставки.
После последнего ткань промыть, тщательно просушите поверхность каждой ткани с стерильным ватным тампоном наконечником тампоном.
Инкубируйте тканей в инкубаторе в течение следующих 24 ± 2 часа (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% СО _2, 95% относительной влажности).
Примечание: Каждое определение техник не должны проверить более 6 испытаний веществ, включая отрицательные и положительные элементы управления в один прогон тестирования (комплект), чтобы иметь возможность следовать протоколу, как описано ниже

III. Средний курс - 2-й день

После 24 ± 2 часа после инкубации, передачи вставляет в нижней части 6-луночный планшет, предварительно заполненные с 0,9 мл среды. СМИ с верхних строк могут быть собраны для анализа дополнительных конечных точек (цитокинов, хемокинов и др.). Анализ вторичных конечных точек не является обязательным.
Продолжить после инкубации (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% СО _2, 95% относительной влажности) еще на 18 ± 3 часов.

IV. МТТ Жизнеспособность Пробирной - День 3

Этикетка два 24-луночных планшетах с химические названия или коды. Одна пластина будет служить для ткани инкубации с МТТ, а другой для извлечения шаг.
Подготовка МТТ решение таянием МТТ концентрата (5 мг / мл) и разбавляя его разбавителя МТТ. Конечная концентрация раствора МТТ составляет 1 мг / мл.
Внесите 300 мкл МТТ раствора в каждую лунку 24-луночный планшет.
Удалите 6-луночных из инкубатора, промокните нижней части вставки на промокательной бумаге, и передача их в 24-луночный планшет предварительно заполнены МТТ.
Место 24-луночного планшета в инкубаторе (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% СО _2, 95% относительной влажности) и выдержать в течение 3 часов ± 5 мин. Строго придерживаться 3 часа ± 5 мин инкубации время, чтобы избежать отклонения между различными показаниями МТТ.
При инкубации МТТ завершения использовать всасывающий насос, чтобы мягко аспирата МТТ среды из всех скважин.
Refill скважин с DPBS и аспирации снова. Повторите эту промывку еще два раза и убедиться, что ткань сухой после последней аспирации.
После мойки передачи вставки для нового 24-луночного планшета. Погрузите вставками, осторожно пипеткой 2 мл экстрагента решение (изопропанол) в каждой вставки. Уровень поднимется выше верхнего края вставки, тем самым полностью погружаясь тканей.
Печать 24-луночного планшета (например, с парафильмом или с помощью уплотнения мешок) для подавления экстрагента испарения. Извлечение МТТ из тканей, по крайней мере 2 часа при комнатной температуре при осторожном встряхивании на планшетном шейкере (~ 120 оборотов в минуту). Ночь добычи без встряхивания также может быть использован.
После извлечения период завершится, прокалывают вставки с иглой для инъекций или лампы бисером пипетки Пастера и позволяют извлекать бежать в колодец, из которого вставить принято не было.
Откажитесь от проколотых вставки и пипетки раствор в хорошо вверх и вниз три раза, пока не будет однородной.
Для каждой ткани, передачу двух 200 мкл аликвоты фиолетовый раствор формазана в 96-луночных планшет плоской нижней. Передача дубликатов в соответствии с фиксированной дизайн пластин приведены в таблице сопровождающих это видео протокол. Для бланков, использование изопропанола.
Прочитано оптической плотности (ОП) МТТ экстрактов в 96-луночного планшета спектрофотометр использованием длины волны 570 нм (540-580) без ссылки фильтра.
Введите результатов в электронную таблицу для автоматического расчета результатов (рис. 1).
Химический анализ называется 'раздражающий' (R38 или СГС категория 2), если жизнеспособность процентов ткани определяли с помощью МТТ <50% по сравнению с отрицательным контролем.
Примечание: МТТ является токсичным, поэтому не забудьте надеть защитные перчатки при работе. Защита МТТ и его такlutions от света, так как МТТ светочувствительным. Используйте МТТ решение в течение нескольких часов после приготовления, потому что деградирует с течением времени.

В. Анализ Контроль качества

Эпидермиса EPI-200-SIT Критерии комплект принятии:
В пробирке модели RHE должна обеспечивать стабильно высокого качества данных с течением времени, а не только во время процесса проверки ^(8). Рекомендуемые руководящие принципы для обеспечения долгосрочной воспроизводимости анализа и производительности включают "полной характеристики клеток или тканей, отбор проб из каждой партии ... для повышения производительности, и регулярное использование средств управления и контрольные химические вещества для обеспечения гарантии согласованности качества анализа" ⁽⁹⁾ . В дополнение к принятию анализа критериев, изложенных ниже, каждый производственный много эпидермиса является контроль качества проверены изготовителем против дополнительных химических тестов (1% Тритон Х-100). Время экспозиции, необходимых для снижения жизнеспособности тканей до 50% (ET-50) для Тритона Х-100 определяется. Для эпидермиса, среднегодовая ET-50 значения колебались от 5,9 часа до 7,5 часов. Партии к партии CV для отрицательного контроля тканей (то есть изменчивость базовых жизнеспособности) в среднем под 7,5% за каждый год с 1996 года. ET50 стоимость каждой партии продукции должны находиться в пределах 2 стандартных отклонения от исторического среднего Тритон Х-100 ET50 основана в 1996 году (то есть ЕТ-50 = 6,7 часа, нижний допустимый предел = 4.8h; верхний допустимый предел = 8.7h) для того, который будет выпущен для использования производителем.
EPI-200-SIT Пробирной Принятие Критерий 1: Отрицательный контроль:
Абсолютная ОП отрицательного контроля (НК) тканей (лечение стерильным DPBS) в МТТ-тест является показателем жизнеспособности тканей, полученных в лабораторных испытаниях после отгрузки и хранения процедур и при определенных условиях эксплуатации. Анализ отвечает критерий приемлемости, если средний диаметр ₅₇₀ НК тканей ≥ 1,0 и ≤ 2,5.
EPI-200-SIT Пробирной Принятие Критерий 2: положительный контроль
5% SDS (в H ₂ O) решение используется в качестве положительного контроля (ПК) и испытаны одновременно с тест химикатов. Параллельное означает, что компьютер должен быть испытан в каждом анализе, но не более одного ПК требуется на тестирование день. Жизнеспособность положительного контроля должна быть в пределах 95% доверительный интервал исторических данных. Анализ отвечает критерий приемлемости, если среднее жизнеспособность тканей ПК в виде% от отрицательного контроля тканей составляет 20%.
EPI-200-SIT Пробирной Принятие Критерий 3: стандартное отклонение (SD)
Раздражение кожи прогнозируется от среднего жизнеспособность определяется на 3-х разовое ткани и, следовательно, изменчивость ткани воспроизводит должна быть достаточно низкой. Анализ отвечает критерий приемлемости, если SD рассчитывается из отдельных% ткани viabilities из 3-х одинаково рассматриваться повторяет составляет <18%.

Представитель Результаты

Рисунок 1 Результаты, полученные в течение 6 тест статей, Северная Каролина и управление ПК -. Частью автоматизированной таблицу для подсчета результатов. Испытание химических веществ, которые снижение жизнеспособности тканей ниже 50% ссылки на НК, классифицируются как раздражители. Тест оптимизированы для обеспечения результатов, которые достаточно далеко от классификации отсечки (50% жизнеспособности) тем самым увеличивая надежность анализа.

Материалы

Discussion

В этом видео, мы продемонстрировали, раздражение эпидермиса кожи испытаний (эпидермиса SIT) разработаны и утверждены для экстракорпорального раздражение кожи испытания химических веществ, в том числе косметических и фармацевтических ингредиентов. При выполнении этого метода, очень важно для работы в асептических условиях и строго соблюдать протокол проверки, так как отклонение от протокола может привести к различным результатам. Некоторые модификации данного метода возможны, однако, изменения в протоколе должны обсуждаться непосредственно с авторами.

Единственным ограничением этого метода является возможное вмешательство испытуемого вещества с конечной точкой МТТ. Цветные испытуемого вещества или тот, который непосредственно уменьшает МТТ (и тем самым имитирует активность дегидрогеназы сотовой митохондрии) могут помешать МТТ конечной точки. Однако, эти испытания вещества проблемой, только если на момент теста МТТ (т.е. 42 часов после испытания воздействия вещества) достаточное количество испытуемого вещества все еще присутствуют на (или в) тканей. В случае, если этого маловероятном случае, (истина), метаболические снижение МТТ и вклад цветного материала теста или (ложь) прямого восстановления МТТ по тестового материала может быть количественно процедура подробно описана в анализе Стандартная процедура Операция предоставляемые Маттек корпорации

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить ZEBET на BfR (Германия), BASF SE (Германия), IIVS Inc (США), Зет-LSL (Австрия) для участия в Multi-центр Международный Проверка Изучение изменения эпидермиса SIT ^{(5 ).}

References

Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. ngrid, Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests. ALTEX. 21, 107-114 (2004).
Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test. ATLA. 33, 351-367 (2005).
Kandárová, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication. ATLA. , Forthcoming (2009).
Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H. The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA. 35, 559-601 (2007).
Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances. Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Schäfer, M. R., Schäfer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kandárová, H. 15th Congress on Alternatives to Animal Experimentation, 2008 September 19-21, Linz Austria, , (2008).
United Nations. Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS). , Second revised edition, UN. New York and Geneva. (2007).
ESAC. Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing. , ESAC. (2008).
Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers. Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).
Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice. Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).