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Protocol
मानव CD40 सक्रिय PBMC से बी कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए प्रोटोकॉल को दो भागों में बांटा गया है: भाग NIH/3T3 कोशिकाओं, जो थाली बाध्य फीडर कोशिकाओं के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा व्यक्त CD40 ligand की तैयारी को दर्शाता है. पार्ट बी वास्तविक संस्कृति CD40 बी का वर्णन करता है.
फीडर कोशिकाओं ए तैयार (NIH/3T3 tCD40L)
tCD40L NIH/3T3 एक पक्षपाती murine fibroblast कोशिका लाइन है, जो पूरी तरह से मिला हुआ कभी नहीं हो जाना चाहिए है. कोशिकाओं इसलिए प्रति सप्ताह दो बार splitted रहे हैं. अधिक से अधिक 6 सप्ताह से अधिक संवर्धन अनुशंसित नहीं है.
- प्राथमिक संस्कृति से एक बाँझ विंदुक के साथ पुराने मध्यम और 1x पीबीएस के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं धोने निकालें. धोने के बाद Aspirate पीबीएस.
- 5-10 मिनट के लिए एक 75 सेमी 2 फ्लास्क में 37 पर 4 एमएल trypsin / EDTA जोड़ें डिग्री सेल्सियस कोमल दोहन का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं को अलग करने के लिए.
- जंगली प्रकार के माध्यम से 10 एमएल जोड़ें और धीरे से कुंडा.
- 50 एमएल ट्यूब में एक बाँझ विंदुक के साथ सेल निलंबन और स्थानांतरण कोशिकाओं 5 मिनट के लिए 225 XG पर नीचे स्पिन.
- निकालें सतह पर तैरनेवाला और जंगली प्रकार के माध्यम से 10 एमएल में गोली resuspend. सेल निलंबन के एक विभाज्य के सेल नंबर की गणना और कक्षों की उचित संख्या के साथ तीन 50 एमएल ट्यूबों तैयार:
- 1.5 x 10 subculturing के लिए 6 कोशिकाओं
- 0.2 x 10 6 / अच्छी तरह से कोशिकाओं CD40 बी सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल विकिरण के लिए
- शेष को स्थिर (यदि आवश्यक).
- कोशिकाओं 5 मिनट के लिए 225 XG पर नीचे स्पिन.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें.
- Subculturing के लिए: resuspend 1.5 x 10 एक 75 सेमी 2 सेल संस्कृति फ्लास्क में 10 एमएल जंगली प्रकार मध्यम (सेल घनत्व 1.5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल) में 6 कोशिकाओं, जी 418 जोड़ने [0.7 मिलीग्राम / एमएल] और कोशिकाओं सेते 37 ° 5% सीओ 2 के साथ सी . कोशिकाओं भाजित दो बार प्रति सप्ताह.
- CD40 बी सेल संस्कृति के लिए: आप 1.2 x 10 एक 6-अच्छी तरह से थाली के लिए 6 कोशिकाओं की जरूरत है . जंगली प्रकार के माध्यम से कोशिकाओं और 0.1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक घनत्व Resuspend उन्हें 78 Gy पर चमकाना . प्लेट अच्छी तरह से प्रत्येक और उन्हें 37 में सेते ° सी के साथ 5% सीओ 2 में 2 सेल निलंबन की एमएल. बी सेल उत्तेजना के लिए तैयार इस प्लेट का उपयोग जब tCD40L NIH/3T3 कोशिकाओं अनुयायी हैं (कम से कम 4 घंटे खुर्दबीन के साथ पालन की जाँच, अधिक से अधिक 24 घंटे प्रतीक्षा करने के लिए नहीं बी सेल उत्तेजना शुरू कर दिया). (बी के साथ जारी रखें)
बी 40 बी सेल संस्कृति सीडी
मैं उत्तेजना CD40 (0 दिन) के लिए PBMCs की तैयारी:
कृपया ध्यान दें: इससे पहले कि आप पता लगाना जारी रखने कि फीडर कोशिकाओं पक्षपाती हैं. हमेशा interleukin-4 और cyclosporin मध्यम विकास के लिए एक प्रयोग करने से पहले तुरंत ताजा समाधान जोड़ने.
- PBMCs लो, या तो ताजा या उचित thawed. Resuspend 50ml 1x पीबीएस में दो बार PBMCs उन्हें धोने और नीचे 7 मिनट और 7 मिनट के लिए 190 XG पर एक दूसरी बार के लिए अन्य कोशिकाओं को हटाने के लिए 265 XG पर पहली बार स्पिन. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पीबीएस के 20 एमएल में कोशिकाओं resuspend. सेल निलंबन के एक विभाज्य में सेल नंबर का निर्धारण करते हैं.
- नीचे 5 मिनट के लिए 225 XG पर कोशिकाओं के लिए आवश्यक राशि स्पिन. एक 6 अच्छी तरह से 4 प्लेट के लिए x 10 6 कोशिकाओं / अच्छी तरह से की जरूरत है, 24 x 10 प्रति प्लेट 6 कोशिकाओं इस प्रकार है.
- निकालें सतह पर तैरनेवाला और 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल CD40 - बी संस्कृति मध्यम हौसले से 50 यू / interleukin-4 एमएल के साथ पूरक में PBMC वृद्धि कारक और 0.63 cyclosporine / μg एमएल के रूप में टी कोशिकाओं के परिणाम को रोकने के लिए resuspend (देखते हुए सांद्रता एक एमएल संस्कृति मध्यम देखें!).
- से सतह पर तैरनेवाला निकालें 6-अच्छी तरह से थाली पूर्व tCD40L NIH/3T3 कोशिकाओं के साथ incubated.
- 2 एमएल प्रति अच्छी तरह से पीबीएस पहली और CD40 बी धोने के माध्यम के 2 एमएल के साथ एक दूसरे चरण में पक्षपाती tCD40L NIH/3T3 कोशिकाओं धो लें.
- धीरे PBMC निलंबन के 4 एमएल (1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल) 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ सकते हैं.
- 37 में कोशिकाओं सेते ° सी के साथ 5% सीओ 2.
- 7 दिन, कोशिकाओं (3.2 के साथ जारी रखें.) Reculture.
द्वितीय. CD40 - बी कोशिकाओं (7 दिन और फिर हर 3-4 दिन) के Recultivation:
- एक 10 एमएल और 50 एमएल ट्यूब में उन्हें पूल विंदुक के साथ resuspending CD40 - बी 6 अच्छी तरह से थाली से कोशिकाओं के समूहों हार्वेस्ट.
- 7 मिनट के लिए 225 XG पर नीचे स्पिन और CD40 बी धोने के माध्यम के साथ पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला जगह. जबकि एक विभाज्य के सेल राशि की गणना, कोशिकाओं स्पिन नीचे 5 मिनट के लिए 225 XG. Resuspend 1 10 6 कोशिकाओं / एमएल एक्स के एक एकाग्रता में CD40 बी CD40 बी मध्यम संस्कृति में कोशिकाओं.
- 50 यू / एमएल के एक एकाग्रता और 0.63 μg / एमएल मध्यम cyclosporine एक इंटरल्यूकिन -4 के ताजा समाधान जोड़ें.
- 6 अच्छी तरह से थाली पूर्व tCD40L NIH/3T3 कोशिकाओं के साथ - incubated से सतह पर तैरनेवाला निकालें.
- 2 एमएल प्रति अच्छी तरह से पीबीएस पहली और CD40 बी धोने के माध्यम के 2 एमएल के साथ एक दूसरे चरण में पक्षपाती कोशिकाओं धो लें.
- 37 में प्लेटें सेते 5% के साथ डिग्री सेल्सियस सीओ 2 .
- Subculture कोशिकाओं को फिर से हर 3-4 दिनों के लिए अत्यधिक शुद्ध मानव CD40 सक्रिय कुल 14 दिनों के बाद बी कोशिकाओं के साथ अंत.
सी. मुसीबत - शूटिंग - क्या अगर CD40 - बी कोशिकाओं हो जाना नहीं है?
- क्या तुमने फीडर कोशिकाओं के CD40 ligand अभिव्यक्ति के लिए जाँच?
- प्लेट बाध्य फीडर उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं 24 घंटों से अधिक पुराने नहीं होना चाहिए?
- Mycoplasma संभव के साथ एक संदूषण है?
- Interleukin-4 पूरकता के लिए इस्तेमाल किया समाधान हौसले से thawed और उपयुक्त जैविक गतिविधि था?
- था cyclosporin एक सही एकाग्रता में जोड़ा?
चित्रा 1 संख्या 1 के एक बड़े संस्करण के लिए यहाँ क्लिक करें कृपया .
चित्रा 2. कृपया आंकड़ा 2 का एक बड़ा संस्करण के लिए यहाँ क्लिक करें .
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Preparation of Media: | |||
| 1. Feeder cell wild type medium | |||
| DMEM-Ham’s / F12 | |||
| L-Glutamine (365 μg/mL) | |||
| FBS (10%) | |||
| HEPES (10 mM) | |||
| Gentamycin (15 μg/mL) | |||
| 2. Feeder cell selection medium | |||
| DMEM-Ham’s / F12 | |||
| L-Glutamine (365 μg/mL) | |||
| FBS (10%) | |||
| HEPES (10 mM) | |||
| Gentamycin (15 μg/mL) | |||
| G-418 (0.7 mg/mL) | |||
| 3. CD40-B washing medium | |||
| IMDM | |||
| L-Glutamine (584 μg/mL) | |||
| HEPES (25 mM) | |||
| Gentamycin (15 μg/mL) | |||
| 4. CD40-B culture medium | |||
| IMDM | |||
| L-Glutamine (584 μg/mL) | |||
| HEPES (25 mM) | |||
| Gentamycin (15 μg/mL) | |||
| rh Transferrin (50 μg/mL) | |||
| rh Insulin (5 μg/mL) | |||
| AB-Humanserum (10%) | |||
| B. Miscellaneous Reagents: | |||
| DMEM / Ham’s F12 | PAA Laboratories | Cat No: E15-813 | |
| IMDM | Invitrogen | REF 21980-032 | |
| Dulbecco’s PBS (10x) | PAA Laboratories | Cat No H15-011 | |
| AB-Human Serum | Invitrogen | Cat No 34005100 | |
| holo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | Cat No T0665 | |
| Insulin human | Sigma-Aldrich | Cat No I2643 | |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 | |
| Recombinant Human Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 11130045 | |
| Cyclosporin A | Novartis AG | Cat No NDC 0078-0109-01 | |
| FBS | Lonza Inc. | Cat No DE14-802C | |
| HEPES Buffer | PAA Laboratories | Cat No S11-001 | |
| G-418 Sulphate | PAA Laboratories | Cat No P02-012 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen | REF 15400-054 | |
| C. Miscellaneous Supplies: | |||
| Sterile pipette tips | Sarstedt Ltd | ||
| 6-well plate | Nalge Nunc international | Cat No 140675 | |
| 50mL conical tube | BD Biosciences | Cat No 352070 | |
| Tissue culture flask | Sarstedt Ltd | Cat No 83.1813.002 | |
References
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- Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).
- Bergwelt-Baildon, M. von CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107, 2786-2789 (2006).
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- Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).
- Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15, 955-965 (2008).
