Summary
ويتسبب مرض باركنسون بفقدان تعصيب الدوبامين في المخطط ، والذي يمكن أن يتسبب تجريبيا بواسطة 6 - OH الدوبامين. نحن تصف كيفية تنفيذ الآفة التجسيمي ورصد آبومورفين بفعل السلوك التناوب في الفئران. هذا النموذج هو مفيدة وموثوقة لاختبار علاجات جديدة لمرض باركنسون.
Abstract
مرض باركنسون (PD) يؤثر على ما لا يقل عن 6.5 مليون شخص في جميع أنحاء العالم ، بغض النظر عن الجنس ، والحدود الاجتماعية والعرقية والاقتصادية ، أو جغرافية. الأعراض الرئيسية ، مثل الصلابة ، ورعاش وbradikinesia ، تتطور عندما يتم فقدان حوالي 3 / 4 من خلايا الدوبامين في المادة السوداء ، وتفشل في توفير التنظيم والتنسيق السلس للدوائر مخططي السيارات. الاكتئاب والهلوسة شائعة ، والخرف في نهاية المطاف يحدث في 20 ٪ من المرضى. في هذا الوقت ، لا يوجد علاج لتأخير أو وقف تطور PD. بل إن الهدف الأدوية المتوفرة حاليا أكثر من أجل التخفيف من هذه الأعراض. قد استراتيجيات جراحية جديدة التبديل عكسية على الدوائر العصبية المتضررة وظيفيا من خلال التحفيز الكهربائي للهياكل العميق للمخ ، ولكن على الرغم من أن للمخ يمثل تقدما كبيرا ، فإنه ليست مناسبة لجميع المرضى. ولذلك يبقى من الضروري اختبار نهج جديدة في علاج الخلايا نماذج قبل سريرية.
يمكن استنساخها اضطراب أعصاب الانتقائي للمسارات الدوبامين عن طريق الحقن من hydroxydopamine - 6 (6 - OHDA) أو MPTP (1 ميثيل فينيل - 4 - 1 - ،2،3،6 tertahydropyridine) في حين أوزون المخدرات والمواد الكيميائية المؤكسدة الضارة قد تتكاثر أيضا ميزات محددة من المشتريات في القوارض. خلافا MPTP ، 6 - OHDA الآفات العصبية تسبب في خسارة عدد هائل لا رجعة فيه ، ويمكن أحادي أو ثنائي. نموذج الآفة 6 OHDA غير موثوق بها ، ويؤدي إلى عجز المحرك القوي ، وهو الأكثر استخداما على نطاق واسع بعد 40 عاما من البحث في rats1. كما يمكن الآن التفاعلات بين الخلايا المطعمة والمضيف أن تدرس بدقة أكثر في الفئران وليس في الفئران ، فقد تم نقلها إلى نموذج 2،3 الفئران ، حيث تم مؤخرا أنها تتميز 4.
في هذا الفيديو ، ونحن لشرح كيفية آفة اليسار nigro - مخططي مسار تخدير الفئران عن طريق تقديم ببطء 2.0 ميكرولتر من OHDA - 6 من خلال إبرة حقنة صغيرة إدراج stereotaxically. فقدان الإدخال الدوبامين يحدث في غضون أيام ، ويمكن رصد أكثر من اعاقات وظيفية بعد الجراحة الأسابيع والأشهر التي تناوب تصنيف الحيوانات التي تحدثها عوامل الدوبامين 5. هنا ، ونعرض كامل الجسم تناوب المقابل تحدث بعد 10 دقائق من ادارة واحدة تحت الجلد من آبومورفين ، وتقاس بعد شهر واحد الآفة. وتناقش النتائج والسلبيات أدناه.
Protocol
وكانت جميع المواد الكيميائية المخزنة المخفف في شكل صلب ، مثل OHDA - 6 و آبومورفين ، في الماء وتصفيته حقن معقمة داخل غطاء تدفق الصفحي ، لتجنب التلوث. بالإضافة إلى ذلك ، تم تخزين المواد سامة للأعصاب وneuroactive ، أعدت ومعالجتها والتخلص منها وفق الضوابط التي تحددها المبادئ التوجيهية الدولية (6) واللجنة المحلية للسلامة الأحيائية.
1 -- التخدير والجراحة
وpremedicated الكبار الفئران السويسرية الذكور (25 30G) مع الأتروبين (0.2 ملغ / كلغ ، SC) للحد من لهجة المبهمي وتخدير ثم مع حقنة داخل الصفاق من الكيتامين (90-120 ملغ / كلغ) ، وزيلازين (10 ملغ / كلغ) . يتم وضع الحيوان على وسادة التدفئة التي تسيطر عليها الكترونيا (إنسايت) لضمان الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية ، وتحريض التخدير يأخذ بعض دقائق. يتم فحص مستوى التخدير في جميع أنحاء الداخلي عن طريق اختبار غياب المنعكس الانسحاب. وينبغي أن جرعة مخدر ajusted لكل سلالة / مستعمرة. اعتمادا على الحيوان ومدة العملية الجراحية ، قد جرعات إضافية من الكيتامين يكون ضروريا. بعد ذلك ، يتم تطبيق ملحي (كلوريد الصوديوم 0،9 ٪) في كلتا العينين لحماية القرنيات من الجفاف واختبار غياب المنعكس طرفة في هذا اللحظة الأولى. غير حليق والفراء على رأسه بأكمله مع الانتهازي لضمان الحد الأدنى من الاتصال مع المناطق غير معقمة. يتم تطبيق مخدر موضعي (Xylocaine) إلى أشرطة الأذن لمنع عدم الراحة. مرة واحدة فقط الانسحاب وميض منعكس قد تلاشت ، مما يدل على مستوى التخدير عميقة بما فيه الكفاية لعملية جراحية (المرحلة 3) ، ويتم وضع الحيوان على الإطار التجسيمي باستخدام قطعة الفم والأذن القضبان مصممة خصيصا لهذه الأنواع (إنسايت). يتم تطبيق positionated مرة واحدة ، مرهم العيون (ماركا) لحماية العينين الحيوان في جميع الجراحة. إلا بعد أن تتأكد من أن محمية بشكل صحيح العينين ، وإجراء متابعة تطهير الجلد في المنطقة من خلال تكرار العمليات الجراحية ثلاثة طلبات من اليود البوفيدون تليها الايثانول 70 ٪ ، وذلك باستخدام القطن مسحات معقمة وبعد والتنسيب المناسب من أشرطة الأذن هي كفل من خلال اختبار للحركات جانبية للرأس (يجب أن لا يتحرك الرأس لضمان أن يتم إصلاح آمن القضبان). وسيتم التحقق من الميل ظهري بطني السليم للرئيس في وقت لاحق عندما يتم الكشف عن معالم الجمجمة. يتم إجراء شق السهمي (1.5 سم) مع مشرط معقم (شفرة # 15). يتم كشط بلطف السمحاق فوق منطقة ذات الاهتمام بعيدا مع شفرة جديدة ، ومحو نظيفة العظام مع النظرة العقيمة ومسحات القطن ، للكشف عن معالم الجمجمة : يعرف bregma كنقطة تقاطع الخيوط السهمي والاكليلية ، في حين امدا هي نقطة تقاطع الدرز السهمي وأفضل خط يمر عبر احتواء الأجزاء الأيسر والأيمن من الدرز اللامي. وركزت أولا غيض من إبرة المرجعية محاذاة عموديا في bregma ، قيد البحث والدراسة من خلال الميكروسكوب الجراحي ، وانتقلت بعد ذلك إلى تلمس نقطة لامدا. إذا تم وضع الرأس بشكل صحيح ، يجب أن يكون لامدا على المستوى ظهراني بطني نفس bregma ، وكلاهما من معالم ينبغي أن تكون بعيدة بمقدار 4.2 ملم على طول محور rostro - الذيلية. إذا لم يكن كذلك ، ينبغي أن الآذان والحانات الأنفية يمكن تخفيف وإمالة الرأس بدقة حول محور interaural ، من أجل تحقيق الموضع المطلوب ، والذي يحدد "مسطح الجمجمة" مرجعية للتدابير stereotaxical. ثم يتم وضع طرف الإبرة المرجعية في الإحداثيات المطلوب : الأمامي الخلفي (ا ف ب +0.5 ملم) والأفقي (L -2.0 ملم ، واليسار). ويتميز الموقع على الجمجمة وفتح الصغيرة (1.2 مم) مع فتحة مثقاب معقمة ، وذلك باستخدام العمل المتقطع لمنع الحرارة في المنطقة. تتم إزالة شظايا العظم بعناية مع مكشطة الأسنان وغسلها مع كلوريد الصوديوم 0.9 ٪ الدافئة المعقمة. غير محملة الحل 6 OHDA (أو مركبة للحيوانات السيطرة) ومحاذاة عموديا في الجهاز التجسيمي ؛ ال 5 ميكرولتر تعقيم المحاقن هاميلتون (0.47 مم الخارجي 26s مقياس). ثم يتم إدخال رأس الإبرة (النوع 2 أو 12 درجة شطبة) في الحفرة المفتوحة ، حتى تلمس سطح حنوني ، والحاسم على نقطة مرجعية للتنسيق ظهراني البطني. الحاسم مرة واحدة هذا التنسيق ، يتم تخفيض ببطء الإبرة للوصول إلى إحداثيات المخطط (ا ف ب : +0.5 ؛ L : -2.0 وDV : -3.0 مم ، تحت سطح حنوني 7). ثم يتم حقن محلول 6 OHDA (10 ميكروغرام في 6 OHDA كلوريد الصوديوم 0.9 ٪ مع حمض الاسكوربيك 0.02 ٪) ، الذي تم إعداده وتصفيتها داخل غطاء تدفق الصفحي ، ويجب أن تكون محمية من الضوء من رقائق الألومنيوم في جميع أنحاء الداخلي ، في معدل تدفق 0.1μL/min. للحيوانات السيطرة ، يتم حقن حجم مساو من السيارة (0.02 ٪ حمض الأسكوربيك بنسبة 0.9 ٪ وكلوريد الصوديوم في الماء المعقم). بمجرد حقن ميكرولتر 2.0 بأكمله ، يتم الاحتفاظ بها في مكان الحقنة لمدة 5 دقائق قبل ان يتراجع ببطء جدا من الدماغ ، في ما لا يقل عن 5 في دقائق. يتم تنظيف الجمجمة ويتم إغلاق الجرح باستخدام خياطة # 6-0 النايلون (Shalon). لاتخاذ اضافيةالرعاية ضد العدوى ، قد يكون تطبيق مرهم مضاد حيوي المحلية ، مثل النيوميسين ، لخياطة الجلد. تتم إزالة الحيوانات من الإطار ، ونظرا 0.5 مل من المياه المالحة (sc.) لمنع الجفاف ، وأبقى الدافئة وتحت مراقبة وثيقة حتى الشفاء التام. ثم انهم يسكنون مع الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية. يضاف مسكن للشرب زجاجة مياه لاول يومين بعد الجراحة (نظرا بمتوسط استهلاك المياه يوميا من 5.5 لتر ، والجرعة الموصى بها من ايبوبروفين 0.03 ملغ / غرام من وزن الجسم / يوم ، ويضاف 0،82 مليلتر من 20 ملغ / مل ايبوبروفين - ابوت التعليق الى 100 مل مياه الشرب). الفئران وعادة ما يشفى بسرعة من هذا الإجراء ، والوصول للتجول كريات الغذاء والماء بسهولة. في أي حالة من الانزعاج واضح ، أو أي علامة على الإصابة ، يجب أن يتم التخلص الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المحلية.
2 -- اختبار السلوكية
ويمكن ملاحظة على الرغم من الإعاقات الحركية بعد أسبوع ، ما سمح لفترة ما بعد الآفة من قبل شهر واحد تقدير موثوق بها مع اختبار التناوب. الحيوان يتلقى الحقن تحت الجلد من آبومورفين ناهض DA (0.5 ملغ / كلغ) ، ويتم وضعها في اسطوانة مبهمة بقطر 30 سم ، 45 سم وضعها تحت كاميرا التسجيل. ومن المهم لإزالة أي رواسب والروائح من الحيوانات المختبرة سابقا قبل كل اختبار. بعد فترة التعود 5 دقائق ، يتم تسجيل الحركات على مدى زمني 5 دقائق. وتقاس كلا مضاد والمماثل لكامل الجسم والتناوب مقارنة مع مجموعة التحكم (حقن السيارة). إذا أجريت بشكل صحيح الداخلي ، وسوف الحيوانات السيطرة لا يحمل أي التناوب ، في حين أن 6 OHDA الحيوانات lesioned ستبدأ تحول إلى الجانب المقابل ، ومنذ ناهض ينشط بالدرجة الاولى المخطط مفرط الحساسية مزالة العصب على الجانب lesioned. وتعتبر الحيوانات يحرز أكثر من 7 في الدقيقة (عرض لا يقل عن 7 لكامل الجسم المقابل تناوب في الدقيقة) كما lesioned بنجاح. ويمكن للحيوان وعاد بسلام إلى 30 دقيقة من السكن بعد الاختبار ، والتي يمكن ان تتكرر أسبوعيا. في أيدينا ، وعرضها أقل من 5 ٪ من الفئران lesioned معدلات الدوران دون المستوى الأمثل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لا يمكن أن يتحقق من جانب واحد آفة واسعة من المسار nigro - مخططي موثوق في الفئران عن طريق الحقن واحد من التجسيمي OHDA - 6 في المخطط. يمكن التحقق من مدى الآفة بعد الوفاة من قبل المناعية للهيدروكسيلاز التيروزين (الذي يحفز معدل الحد من مرحلة تجميع DA ، أي تحويل التيروسين - L لdihydroxyphenylalanine) ، كما هو موضح في الفيديو.
في الجسم الحي ، وتناوب المقابل الناجم عن آبومورفين هي أفضل مؤشر لمخططي القصوى من آفة المنشطات التي يسببها التناوب المماثل 8. وبالتالي ، يمكن رصد النتائج الفنية للآفة على مدى عدة أشهر قبل اجراء مباشر لآبومورفين بفعل التناوب المقابل.
معدل النجاح هو حوالي 95 ٪. وهو أعلى بكثير من ما يقال عادة عن الفئران (50-70 ٪) والتي تتطلب استنفاد الدوبامين واسعة من مضاعفات الحقن عصبي ويزيد من معدل الوفيات. في الفئران ، ويجب أن تكون موحدة الظروف التجريبية عن طريق اختيار الحيوانات من مطابقة الوزن ، وتستخدم فقط الطازجة 6 OHDA الحل. على الرغم من أن مجموعات أخرى قد تستخدم تراكيز مختلفة و / أو وحدات التخزين من عصبي ، وجدنا أن 2 مل من محلول ملغ / 5 مل من المياه المالحة OHDA - 6 (التي تحتوي على حمض الأسكوربيك بنسبة 0.02 ٪ لمنع الأكسدة) كانت الأكثر فعالية لآفة القصوى. بدلا من ذلك ، قد يكون من المفيد حقن خضعوا لتقليد الضمور التدريجي لمحطات الدوبامين التي تحدث في البشر ، ولا سيما في أشكال والأحداث في وقت مبكر من بداية PD - 9.
قد تؤدي إلى آفات MPTP الشفاء التلقائي ، وبالإضافة إلى ذلك حساسية لنوع الجنس والسن والسلالة. دراسة حديثة تشير إلى أن هذا ليس هو الحال لمدة 6 - OHDA الآفات في الفئران ، والتي تخفيضات واسعة النطاق وطويلة الأمد في محتوى DA المتبقية ضمن المخطط ، وكذلك في عدد من الخلايا إيجابية TH في المادة السوداء في جميع اختبار الفئران 10.
في الوقت الحاضر ، فإن النموذج الآفة 6 hydroxydopamine من الشلل الرعاش -- التي استخدمت على نطاق واسع لمدة 40 عاما في الفئران -- يمكن أن يكون ، نقلها موثوق بها إلى الفئران. ونحن نأمل ان يكون هذا الفيديو سوف يكون من المفيد للمجموعات الأخرى ، وبالتالي الحد من عدد من التجارب والحيوانات اللازمة للبحوث ما قبل السريرية على علاجات جديدة لالخلوية PD 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وأجريت التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية لرعاية واستخدام الثدييات في علم الأعصاب والسلوك بحوث
Acknowledgments
بدعم من قرينتها دي أمبارو a Pesquisa تفعل استادو دو ريو دي جانيرو (FAPERJ) وناسيونال دي Conselho Desenvolvimento Científico تكنولوجيكو ه (CNPq). ونحن ممتنون للحكام الذين المجهول التعليقات ساعدتنا تحسين كل من مخطوطة والفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride | König | 90-120 mg/Kg | |
| Xylazine hydrochloride | König | 10 mg/Kg | |
| Atropine Sulfate | Isofarma | Isofarma | |
| 6 – Hydroxydopamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 5 μg/μL | |
| L - Ascorbic Acid | USB Corp., Affymetrix | 0.2% | |
| Xylocaine (Lidocaine Chloridrate) | AstraZeneca | 5% 50 mg |
|
| Nebacetin (Neomycin Sulfate + Bacitracin) | Altana Pharma | 5 mg/g + 250 Ul/g | |
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg | |
| GenTeal lOphthalmic ointment Hypromellose | Novartis AG | 0.33% |
|
| Ibuprofen | Abbott Laboratories | 4 mg/ 100 ml drinking water | |
| Povidine | Johnson Diversey | ||
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg |
References
- Ungerstedt, U. 6-hydroxy-dopamine induced degeneration of central monoamine neurons. Eur. J. Pharmacol. 5, 107-110 (1968).
- Akerud, P., Canals, J. M., Snyder, E. Y., Arenas, E. Neuroprotection through delivery of glial cell line-derived neurotrophic factor by neural stem cells in a mouse model of Parkinson's Disease. J. Neurosci. 21, 8108-8118 (2001).
- Ghosh, A., Roy, A., Liu, X., Kordower, J. H., Mufson, E. J., Hartley, D. M., Ghosh, S., Mosley, R. L., Gendelman, H. E., Pahan, K. Selective inhibition of NF-kappaB activation prevents dopaminergic neuronal loss in a mouse model of Parkinson's Disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 18754-18759 (2007).
- Alvarez-Fischer, D., Henze, C., Strenzke, C., Westrich, J., Ferger, B., Höglinger, G. U., Oertel, W. H., Hartmann, A. Characterization of the striatal 6-OHDA model of Parkinson's disease in wild type and a-synuclein-deleted mice. Exp. Neurol. 210, 182-193 (2008).
- Ungerstedt, U. 6-Hydroxydopamine-induced degeneration of the nigrostriatal dopamine pathway: The turning syndrome. Pharmacology and Therapeutics Part B: General and Systematic Pharmacology. 2, 37-40 (1976).
- Guidelines for the Care and Use of Mammals in Neuroscience and Behaviour Research. , National Academies Press. Comissão de Biosegurança, CCS-UFRJ. 209 (2003).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1997).
- Hudson, J. L., Horne, C. G. van, Strömberg, I., Brock, S., Clayton, J., Masserano, J., Hoffer, B. J., Gerhardt, G. A. Correlation of apomorphine- and amphetamine-induced turning with nigrostriatal dopamine content in unilateral 6-hydroxydopamine lesioned rats. Brain Res. , 626-6167 (1993).
- Truong, L., Allbutt, H., Kassiou, M., Henderson, J. M. Developing a preclinical model of Parkinson's disease: A study of behaviour in rats with graded 6-OHDA lesions. Behav. Brain Res. 169, 1-9 (2006).
- Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson's disease. Acta Neurochir. (Wien.). 101, 89-92 (2008).
- Isacson, O. Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease. JoVE. 3, (2007).
