Summary
帕金森病是造成损失，可实验6 - OH -多巴胺诱导的纹状体多巴胺能神经支配的。我们描述了如何执行的立体病变和监测阿朴吗啡诱导的小鼠旋转行为。这种模式是有用的，可靠的测试对帕金森病的新疗法。
Abstract
帕金森氏病（PD）影响全球至少有6.5亿人，不论性别，社会，种族，经济，或地理的界限。主要症状，如震颤，僵硬和bradikinesia，开发时在黑质多巴胺能神经细胞的3 / 4丢失，无法提供流畅，纹状体电机电路的协调监管。抑郁症和幻觉是常见的，和老年痴呆症在20％的患者最终发生。在这个时候，没有任何推迟或停止治疗PD的进展。相反，目前可用的目标，对减轻这些症状的药物更多。新的手术策略可能可逆开关电路通过电刺激脑深部结构的功能受损，但脑深部电刺激虽然是一个重大的进步，它不适合所有患者。因此，它仍然要测试新的细胞治疗方法在临床前模型。
选择性多巴胺能通路的神经毒性中断可以被复制，而消耗的药物和氧化损伤的化学物质注射6 - 羟多巴胺（6 - OHDA）或MPTP（1 - 甲基-4 - 苯基- 1 -1,2,3,6 - tertahydropyridine）也重现在啮齿类动物中的特定功能的PD。 MPTP的不同，6 - OHDA病变导致大规模的不可逆的神经元丢失，可单向或双侧。 6 - OHDA病变模型是可靠的，强大的运动障碍，并在rats1经过40多年的研究中使用最广泛的。由于移植的细胞和主机之间的相互作用现在可以在小鼠体内，而不是在大鼠的研究更彻底，该模型已被调换到2,3小鼠，它已被最近的特点4。
在这段视频中，我们将演示如何病灶慢慢通过stereotaxically插入微型注射器针头提供2.0μL6 - OHDA左尼格罗 - 纹状体通路麻醉小鼠。多巴胺输入的损失发生在几天之内，可以通过手术后的数周和数个月按等级动物多巴胺剂5诱导的旋转监控功能障碍。在这里，我们显示全身对侧旋转，10分钟后发生的一个单一的皮下注射阿朴吗啡管理，测量病灶后1个月。下面讨论的成果和缺点。
Protocol
固体形式储存的所有化学物质，如6 - OHDA和阿朴吗啡，在无菌注射用水稀释和过滤层流罩内，以避免污染。此外，神经毒素和neuroactive物质储存，准备，处理和处置根据国际准则和当地生物安全委员会的规例。
1 - 麻醉和手术
成人男性（25 - 30G）的瑞士小鼠premedicated与阿托品（0.2毫克/公斤，SC），以减少迷走神经张力，然后用氯胺酮（90-120毫克/公斤）和甲苯噻嗪（10毫克/公斤）腹腔注射麻醉。动物被放置在一个电子控制的加热垫（透视），以确保体温保持在37 ° C，作为镇静诱导一些分钟。整个过程中，通过测试撤退反射的情况下检查的麻醉水平。麻醉剂量应为每一株/殖民地ajusted。根据对动物和手术时间，额外剂量的氯胺酮可能是必要的。之后，生理盐水（氯化钠0.9％）是适用于两只眼睛，以防止晒出的角膜和测试眨眼反射的情况下在这第一时刻。在整个头部的毛皮剃光一个微调，以确保与未消毒的地区的最低接触。局部麻醉剂（Xylocaine）是适用于耳的酒吧，以防止不适。只有一次，撤回和眨眼反射已经消失，说明麻醉的水平是够深为手术（第3阶段），动物使用口片和耳酒吧专门为这个物种（透视）设计的框架上的立体定位。 positionated后，眼科软膏（马卡报）是适用于所有的手术，以保护整个动物的眼睛。只有在确保正确保护眼睛，程序继续重复三个70％的乙醇碘伏申请，与手术区域的皮肤消毒，用无菌棉拭子后，妥善安置耳棒确保通过测试头侧身运动（头不能移动，以确保酒吧是牢固地固定）。将核实后发现头骨的地标时，适当的头背腹倾向。一个矢状切口（1.5厘米），用无菌手术刀（＃15刀片）。骨膜在感兴趣的领域是轻轻地用一个新的刀片刮掉，骨擦干净，用无菌的目光和棉签，发现头骨的地标：前囟点的矢状面和冠状缝合线的交点定义，而波长矢状缝，通过左，右部分的人字缝的最合适的线路的交汇点。首先是一个垂直排列的参考针的尖端归零前囟门，通过手术显微镜下检查，然后移动触摸的lambda点。如果头是正确定位，λ应背腹为前囟在同一水平，并应沿rostro尾椎轴由4.2毫米遥远的两个地标。如果没有，耳朵的酒吧和消防水枪应放松和头部周围的双耳轴微妙的倾斜，以达到所需的位置，它定义了“扁平的头骨”stereotaxical措施的参考。参考针的尖端，然后在所需的坐标定位：前后（AP 0.5毫米）和横向（L -2.0毫米，左）。的位置上标注的头骨和一个小的（直径1.2毫米）的孔打开，用消毒的钻头，采用间歇性的行动，以防止传热面积。牙齿耳挖小心取出碎骨，并用无菌温暖的0.9％氯化钠冲洗。消毒5μL汉密尔顿注射器（26S压力表; 0.47毫米外径）装有6 - OHDA溶液（或控制动物的车辆），在立体定位仪和垂直对齐。针尖（类型2或12 °斜角），然后打开孔插入，直到触摸软脑膜表面，测定背腹坐标的参考点。一旦确定的坐标，针是慢慢降低，达到纹状体的坐标（美联社：0.5，L：-2.0和DV：-3.0毫米，软脑膜表面以下7 ）。 6 - OHDA溶液（10微克6 - OHDA以0.02％的抗坏血酸的0.9％氯化钠），这是准备和过滤层流罩内，并必须避光铝箔整个过程中，再注入一个0.1μL/min的流量。对于控制动物，车辆等体积（0.02％抗坏血酸和0.9％氯化钠无菌水）注入。一旦被注入，整个2.0μL，注射器保持在5分钟的地方之前，非常缓慢地从大脑缩回，在不超过5分钟。头骨是清理和关闭切口用6-0号尼龙缝合（Shalon）。采取一个额外护理防止感染，一个局部抗生素软膏，如新霉素，，可用于缝合皮肤。动物的框架，从0.5毫升生理盐水（sc.），以防止脱水，并保持温暖和密切观察下，直到完全恢复。然后，他们采用与食物和水随意。止痛药添加到手术后的头两个天（平均每天5.5毫升的水耗，饮水瓶和推荐剂量的布洛芬0.03毫克/克体重/日;添加0,82毫升20毫克/毫升布洛芬雅培暂停饮水100毫升）。鼠标通常程序及时恢复，徘徊和水食物颗粒很容易达到。在任何明显不适，或任何感染的迹象的情况下，动物，应当安乐死根据当地的指引。
2 - 行为学测试
虽然运动功能障碍，可观察到一个星期后，可靠的量化与旋转试验前的1个月后病灶的间隔是允许的。动物收到的DA受体激动剂阿扑吗啡（0.5毫克/公斤）皮下注射，是摆在一个直径30厘米的不透明缸，放在45厘米以下的录音摄像头。重要的是要在每次测试之前删除任何残留物，并从以前测试过的动物的气味。经过5分钟的习惯，动作都录得超过5分钟的时间内。禁忌和同侧全身旋转测量和比较，与对照组（车辆注射）。如果程序正确执行，控制动物不会表现出任何旋转，而6 - OHDA损毁的动物将开始转向对侧，因为主要的激动剂激活过敏的神经支配纹状体损毁侧。得分超过700转（显示每分钟至少7全身对侧旋转）的动物被视为成功损毁。动物可以安全地返回测试后，每周可重复他们的住房30分钟。在我们的手中，不到5％的损毁小鼠显示不理想的旋转速率。
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Discussion
尼格罗 - 纹状体通路广泛的单方面病变可靠，可以实现在小鼠纹状体由一个6 - OHDA立体定向注入。病变范围可核实验尸报告由酪氨酸羟化酶免疫组织化学（催化DA的合成限速阶段，即L -酪氨酸，以二羟基苯转换），视频所示。
在体内，由阿朴吗啡诱导的对侧旋转是一个最大纹状体病变优于安非他明诱导同侧旋转8的预测。因此，可以监控功能的病变后果，在几个月内由阿朴吗啡诱发的对侧旋转的简单措施。
成功率是95％左右。这是明显比通常的老鼠（50-70％）进行了广泛的多巴胺耗竭，需要注射的神经毒素的倍数，并增加死亡率的报道。在小鼠实验中，实验条件下，应选择重量相匹配的动物的标准化，以及只使用新鲜配制的6 - OHDA解决方案。虽然其他群体可能使用不同的浓度和/或神经毒素卷，我们发现，6 - 羟基多巴胺（含0.02％的抗坏血酸，以防止氧化）5 mg / ml的生理盐水2毫升，最大的病变最有效的。另外，亚极量注射可能是有用的模仿逐步退化的多巴胺终端发生在人类身上，特别是在少年早发的PD 9。
MPTP的病变可能会导致自然恢复，另外是敏感的性别，年龄，和应变。最近的一项研究表明，这是不是6 - OHDA病变的小鼠，产量纹状体内的大规模和长期的持久的减少，在剩余的DA含量的情况下，以及在所有的黑质TH阳性细胞数量小鼠测试10。
6 - 羟病变模型帕金森 - 已被广泛用于40年在大鼠 - ，在目前的时间，可以可靠地调换到小鼠。我们希望，这段视频将帮助其他群体，从而减少为PD 11的新的细胞疗法的临床前研究所需的实验和动物的数量。
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Disclosures
实验是在按照哺乳动物的关怀和使用的国际准则，在神经科学与行为研究
Acknowledgments
Fundação保护行使宪法权利支持的Pesquisa州里约热内卢（FAPERJ）和Conselho国立发展Científico发送Tecnológico圣保罗大学。我们非常感谢匿名审稿的意见，帮助我们改进的手稿和视频。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride | König | 90-120 mg/Kg | |
| Xylazine hydrochloride | König | 10 mg/Kg | |
| Atropine Sulfate | Isofarma | Isofarma | |
| 6 – Hydroxydopamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 5 μg/μL | |
| L - Ascorbic Acid | USB Corp., Affymetrix | 0.2% | |
| Xylocaine (Lidocaine Chloridrate) | AstraZeneca | 5% 50 mg |
|
| Nebacetin (Neomycin Sulfate + Bacitracin) | Altana Pharma | 5 mg/g + 250 Ul/g | |
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg | |
| GenTeal lOphthalmic ointment Hypromellose | Novartis AG | 0.33% |
|
| Ibuprofen | Abbott Laboratories | 4 mg/ 100 ml drinking water | |
| Povidine | Johnson Diversey | ||
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg |
References
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