Summary
Ziekte van Parkinson wordt veroorzaakt door het verlies van dopaminerge innervatie naar het striatum, die experimenteel kunnen worden geïnduceerd door 6-OH-dopamine. We beschrijven hoe u een stereotaxische laesie te voeren en op apomorfine-geïnduceerde rotatie gedrag bij muizen te controleren. Dit model is handig en betrouwbaar voor het testen van nieuwe therapieën voor de ziekte van Parkinson.
Abstract
De ziekte van Parkinson (PD) van invloed op ten minste 6,5 miljoen mensen wereldwijd, ongeacht geslacht, sociale, etnische, economische of geografische grenzen. De belangrijkste symptomen, zoals tremor, rigiditeit en bradikinesia, ontwikkelen wanneer ongeveer 3 / 4 van dopaminerge cellen verloren zijn gegaan in de substantia nigra, en dat niet te voorzien in de soepele en gecoördineerde regulatie van striatale motor circuits. Depressie en hallucinaties komen vaak voor, en dementie uiteindelijk komt voor in 20% van de patiënten. Op dit moment is er geen behandeling te vertragen of te stoppen met de progressie van de PD. Integendeel, de medicijnen die momenteel beschikbaar zijn doel meer op de verlichting van deze symptomen. Nieuwe chirurgische strategieën kunnen omkeerbaar schakelaar op het functioneel beschadigde circuits door middel van de elektrische stimulatie van diepe hersenstructuren, maar hoewel diepe hersenstimulatie is een belangrijke stap vooruit, is het niet geschikt is voor alle patiënten. Het blijft daarom noodzakelijk om nieuwe celtherapie benaderingen te testen in preklinische modellen.
Selectieve neurotoxisch verstoring van de dopaminerge paden kan worden weergegeven door middel van injectie van 6-hydroxydopamine (6-OHDA) of MPTP (1-methyl-4-fenyl-1 ,2,3,6-tertahydropyridine) terwijl uitputten drugs en oxidatieve-schadelijke chemicaliën kunnen Ook reproduceren specifieke kenmerken van de PD bij knaagdieren. In tegenstelling tot MPTP, 6-OHDA oogontstekingen veroorzaken enorme onomkeerbaar neuronaal verlies, en kan uni-of bilaterale. De 6-OHDA laesie model betrouwbaar is, leidt tot een robuuste motorische stoornissen, en is de meest gebruikte na 40 jaar onderzoek in rats1. Zoals interacties tussen cellen en geënt host kan nu grondiger worden bestudeerd in muizen dan bij ratten, is het model is omgezet naar muizen 2,3, waar het is onlangs gekarakteriseerd 4.
In deze video laten we zien hoe de laesie links Nigro-striatale route van verdoofde muizen door langzaam het leveren van 2,0 pi van 6-OHDA door middel van een stereotaxically geplaatst micro-naald van de spuit. Het verlies van dopaminerge inbreng gebeurt binnen enkele dagen, en de functionele beperkingen kan gemonitord worden over post-operatieve weken en maanden op de classificatie van dieren rotaties veroorzaakt door dopaminerge middelen 5. Hier tonen we full-body contralaterale rotaties zich 10 minuten na een enkelvoudige subcutane toediening van apomorfine, gemeten een maand na de laesie. Uitkomsten en nadelen worden hieronder besproken.
Protocol
Alle chemicaliën opgeslagen in vaste vorm, zoals de 6-OHDA en apomorfine, werden verdund in steriele injectie water en gefilterd in een laminaire stroming kap, om besmetting te voorkomen. Daarnaast werden neurotoxinen en neuroactive stoffen opgeslagen, bereid, behandeld en afgevoerd volgens de voorschriften die door internationale richtlijnen 6 en de lokale bioveiligheid comite.
1 - Anesthesie en chirurgie
Volwassen mannelijke Zwitserse muizen (25-30g) zijn premedicatie met atropine (0,2 mg / kg, sc) om vagale tonus te verminderen en vervolgens verdoofd met een intraperitoneale injectie van ketamine (90-120 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) . Het dier is geplaatst op een elektronisch geregelde verwarming pad (Insight) om ervoor te zorgen lichaam temperatuur op 37 ° C, zoals inductie van sedatie duurt enkele minuten. De verdoving niveau is gecontroleerd gedurende de hele procedure door het testen van de afwezigheid van terugtrekking reflex. Verdoving dosering moet worden ajusted voor elke stam / kolonie. Afhankelijk van het dier en de duur van de operatie kunnen aanvullende doses van Ketamine nodig zijn. Daarna wordt zoutoplossing (NaCl 0,9%) toegepast op beide ogen om de hoornvliezen te beschermen tegen uitdroging en de afwezigheid van de blink reflex in dit eerste moment test. De vacht over het hele hoofd geschoren met een trimmer tot het minimum contact met de niet-steriele gebieden te garanderen. Plaatselijke verdoving (Xylocaine) wordt toegepast op het oor bars om ongemak te voorkomen. Slechts een keer terugtrekking en knipper reflex zijn verdwenen, met vermelding van het niveau van de anesthesie is diep genoeg voor een operatie (fase 3), is het dier geplaatst op de stereotaxisch frame met mondstuk en oor bars speciaal ontworpen voor deze soort (Insight). Eenmaal positionated, een oogheelkundig zalf (MARCA) wordt toegepast op het dier ogen te beschermen in alle chirurgie. Pas na er zeker van zijn dat de ogen goed beschermd zijn, de procedure met de desinfectie van de huid van de chirurgische regio verder door het herhalen van drie toepassingen van povidon-jood, gevolgd door 70% ethanol, met behulp van steriele katoen swabs Na, de juiste plaatsing van het oor bars is gegarandeerd door het testen voor de zijwaartse bewegingen van het hoofd (het hoofd mag niet bewegen om ervoor te zorgen dat de balken stevig vast). Een goede dorsoventral helling van de kop zal later worden geverifieerd schedel monumenten worden onthuld. Een sagittale snede (1,5 cm) is gemaakt met een steriel scalpel (# 15 blad). De periosteum over het gebied van belang is zachtjes weg geschraapt met een nieuw blad, en het bot wordt schoongeveegd met een steriele blik en wattenstaafjes, de schedel bezienswaardigheden ontdekken: bregma wordt gedefinieerd als het snijpunt van sagittale en coronale hechtingen, terwijl de lambda is het snijpunt van de pijlnaad en de beste fit lijn die door het links en rechts delen van de lambdoid hechtdraad. De tip van een verticaal uitgelijnde referentie naald wordt eerst op nul gezet op de bregma, te onderzoeken door middel van de chirurgische microscoop, en vervolgens verplaatst naar de lambda punt te raken. Als het hoofd is goed geplaatst is, moet lambda op dezelfde dorso-ventrale niveau als bregma, en beide monumenten moeten op afstand worden bereikt van 4,2 mm langs de rostro-caudale as. Zo niet, dan moeten de oren bars en neusstuk zijn los te maken en het hoofd voorzichtig schuin rond de interaurale as, om de gewenste positie, die de "platte schedel" referentie voor stereotaxical maatregelen definieert bereiken. De tip van de referentie-naald wordt vervolgens geplaatst op de gewenste coördinaten: anterior-posterior (AP +0.5 mm) en laterale (L -2,0 mm, links). De locatie is aangegeven op de schedel en een kleine (1,2 mm diameter) opening wordt geopend met een gesteriliseerde boor, met behulp van intermitterende actie om warmte van de omgeving te voorkomen. Botfragmenten worden zorgvuldig verwijderd met een tandheelkundige curette en gewassen met steriele warme 0,9% NaCl. De gesteriliseerde 5 pi Hamilton spuit (26s te meten; 0,47 mm buitendiameter) is geladen met de 6-OHDA oplossing (of het voertuig voor controle dieren) en verticaal uitgelijnd in de stereotaxische apparaat. De tip van de naald (type 2 of 12 ° schuine) wordt vervolgens ingebracht in de geopende gat, totdat Raak het pial oppervlak, naar het referentiepunt van het dorso-ventrale coördinaat bepaald. Zodra bepaald dit te coördineren, is de naald langzaam verlaagd tot de coördinaten van de striatum te bereiken (AP: +0.5, L: -2,0 en DV: -3,0 mm, onder pial oppervlakte 7). De 6-OHDA-oplossing (10 ug 6-OHDA in 0,9% NaCl met 0,02% ascorbinezuur), dat is opgesteld en gefilterd in een laminaire stroming kap, en moet worden beschermd tegen licht door aluminium folie tijdens de gehele procedure, wordt vervolgens geïnjecteerd op een debiet van 0.1μL/min. Voor de controle-dieren, is een gelijk volume van het voertuig (0,02% ascorbinezuur en 0,9% NaCl in steriel water) geïnjecteerd. Zodra de gehele 2,0 pi is geïnjecteerd, is de spuit op zijn plaats gehouden gedurende 5 minuten voordat ze heel langzaam teruggetrokken uit de hersenen, in niet minder dan in 5 minuten. De schedel is schoongemaakt en de incisie wordt gesloten met behulp van een # 6-0 nylon hechtdraad (Shalon). Om een extrazorg tegen infecties, kan een lokale antibiotische zalf, zoals neomycine, worden toegepast op de huid gehecht. Dieren worden verwijderd uit het frame, gezien 0,5 ml van een zoutoplossing (Sc.) om uitdroging te voorkomen, en warm gehouden en onder nauwlettende observatie tot volledig herstel. Ze worden dan ondergebracht met voedsel en water ad libitum. Analgeticum wordt toegevoegd aan het drinkwater fles voor de eerste twee dagen na de operatie (gegeven een gemiddelde dagelijkse waterverbruik van 5,5 ml, en een aanbevolen dosering van 0,03 mg ibuprofen / g lichaamsgewicht / dag en voeg 0,82 ml van 20 mg / mL Ibuprofen-Abbott schorsing tot 100 ml drinkwater). Muizen meestal prompt te herstellen van de procedure, wandelen en het bereiken van water voedsel pellets gemakkelijk. In elk geval van zichtbare ongemak, of een teken van een infectie, moeten de dieren worden gedood volgens de lokale richtlijnen.
2 - Behavioral-test
Hoewel de motorische stoornissen kan worden geconstateerd na een week, is een post-laesie interval van een maand toegestaan voordat betrouwbare kwantificering met de rotatie-test. Het dier krijgt een subcutane injectie van DA-agonist apomorfine (0,5 mg / kg), en is geplaatst in een ondoorzichtige cilinder van 30 cm diameter, 45 cm geplaatst onder de opname camera. Het is belangrijk om eventuele resten en geuren van de eerder geteste dieren te verwijderen vóór elke test. Na een 5 min gewenningsperiode, zijn bewegingen opgetekend op een vijf minuten tijd. Zowel de contra-en ipsilaterale full-body rotatie worden gemeten en vergeleken met de controlegroep (voertuig geïnjecteerd). Als de procedure correct is uitgevoerd, zal de controle dieren niet vertonen geen rotatie, terwijl 6-OHDA gelaedeerde dieren zullen gaan draaien aan de contralaterale zijde, omdat de agonist voornamelijk activeert de overgevoelige gedenerveerde striatum aan de gelaedeerde zijde. Dieren scoren meer dan 7 toeren (weergave van tenminste zeven full-body contralaterale rotaties per minuut) worden beschouwd als succesvol gelaedeerde. Het dier kan veilig worden teruggestuurd naar hun woning 30 minuten na de test, die wekelijks kan worden herhaald. In onze handen, minder dan 5% van de gelaedeerde muizen weergegeven suboptimale rotatie tarieven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uitgebreide eenzijdige laesie van de Nigro-striatale pad op betrouwbare wijze kan worden bereikt bij muizen door een enkele stereotaxische injectie van 6-OHDA in het striatum. De omvang van de laesie kan post-mortem worden geverifieerd door immunohistochemie voor tyrosine hydroxylase (die katalyseert de snelheidsbepalende stap van de synthese van DA, dat wil zeggen de omzetting van L-Tyrosine te dihydroxyphenylalanine), zoals geïllustreerd in de video.
In vivo, contralaterale rotaties veroorzaakt door apomorfine zijn een betere voorspeller van maximaal striatale laesie dan amfetamine geïnduceerde ipsilaterale rotatie 8. Zo kan de functionele gevolgen van het letsel worden gevolgd gedurende een aantal maanden door een eenvoudige maatregel van apomorfine-geïnduceerde contralaterale rotaties.
Het slagingspercentage is ongeveer 95%. Het is aanmerkelijk hoger dan wat gewoonlijk gerapporteerd voor ratten (50-70%) in die uitgebreide dopamine depletie vereist veelvouden injecties van het neurotoxine en verhoogt het sterftecijfer. Bij muizen, moet de proefomstandigheden worden gestandaardiseerd door het selecteren van de dieren van de matching gewicht, en alleen met behulp van vers bereide 6-OHDA oplossing. Hoewel andere groepen kunnen verschillende concentratie en / of volumes van neurotoxine gebruiken, hebben we ontdekt dat 2 ml van een 5 mg / ml zoutoplossing van 6-OHDA (met 0,02% ascorbinezuur om oxidatie te voorkomen) waren de meest efficiënte voor maximale laesie. Als alternatief zou submaximale injecties nuttig zijn om de progressieve degeneratie van dopaminerge terminals die optreedt bij mensen, vooral in jonge en early-onset vormen van PD 9 na te bootsen.
MPTP laesies kunnen leiden tot spontaan herstel, en bovendien is gevoelig voor geslacht, leeftijd, en de stam. Een recente studie geeft aan dat dit niet het geval is voor 6-OHDA laesies in muizen, die massale en langdurige vermindering van de resterende DA inhoud opbrengst in het striatum, maar ook in het aantal TH positieve cellen in de substantia nigra in alle muizen getest 10.
Op dit moment, de 6-hydroxydopamine laesie model van Parkinson - die op grote schaal is gebruikt voor 40 jaar in ratten - kan betrouwbaar worden getransponeerd naar muizen. We hopen dat deze video zal nuttig zijn om andere groepen, en daarmee vermindering van het aantal experimenten en dieren die nodig zijn voor preklinisch onderzoek naar nieuwe cellulaire therapieën voor PD 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de internationale richtlijnen voor de zorg en het gebruik van Zoogdieren in Neuroscience and Behavior Research
Acknowledgments
Ondersteund door Fundação de Amparo een Geavanceerd do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) en Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). We zijn dankbaar om anonieme referees die commentaar hielp ons bij het verbeteren zowel het manuscript en video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride | König | 90-120 mg/Kg | |
| Xylazine hydrochloride | König | 10 mg/Kg | |
| Atropine Sulfate | Isofarma | Isofarma | |
| 6 – Hydroxydopamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 5 μg/μL | |
| L - Ascorbic Acid | USB Corp., Affymetrix | 0.2% | |
| Xylocaine (Lidocaine Chloridrate) | AstraZeneca | 5% 50 mg |
|
| Nebacetin (Neomycin Sulfate + Bacitracin) | Altana Pharma | 5 mg/g + 250 Ul/g | |
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg | |
| GenTeal lOphthalmic ointment Hypromellose | Novartis AG | 0.33% |
|
| Ibuprofen | Abbott Laboratories | 4 mg/ 100 ml drinking water | |
| Povidine | Johnson Diversey | ||
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg |
References
- Ungerstedt, U. 6-hydroxy-dopamine induced degeneration of central monoamine neurons. Eur. J. Pharmacol. 5, 107-110 (1968).
- Akerud, P., Canals, J. M., Snyder, E. Y., Arenas, E. Neuroprotection through delivery of glial cell line-derived neurotrophic factor by neural stem cells in a mouse model of Parkinson's Disease. J. Neurosci. 21, 8108-8118 (2001).
- Ghosh, A., Roy, A., Liu, X., Kordower, J. H., Mufson, E. J., Hartley, D. M., Ghosh, S., Mosley, R. L., Gendelman, H. E., Pahan, K. Selective inhibition of NF-kappaB activation prevents dopaminergic neuronal loss in a mouse model of Parkinson's Disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 18754-18759 (2007).
- Alvarez-Fischer, D., Henze, C., Strenzke, C., Westrich, J., Ferger, B., Höglinger, G. U., Oertel, W. H., Hartmann, A. Characterization of the striatal 6-OHDA model of Parkinson's disease in wild type and a-synuclein-deleted mice. Exp. Neurol. 210, 182-193 (2008).
- Ungerstedt, U. 6-Hydroxydopamine-induced degeneration of the nigrostriatal dopamine pathway: The turning syndrome. Pharmacology and Therapeutics Part B: General and Systematic Pharmacology. 2, 37-40 (1976).
- Guidelines for the Care and Use of Mammals in Neuroscience and Behaviour Research. , National Academies Press. Comissão de Biosegurança, CCS-UFRJ. 209 (2003).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1997).
- Hudson, J. L., Horne, C. G. van, Strömberg, I., Brock, S., Clayton, J., Masserano, J., Hoffer, B. J., Gerhardt, G. A. Correlation of apomorphine- and amphetamine-induced turning with nigrostriatal dopamine content in unilateral 6-hydroxydopamine lesioned rats. Brain Res. , 626-6167 (1993).
- Truong, L., Allbutt, H., Kassiou, M., Henderson, J. M. Developing a preclinical model of Parkinson's disease: A study of behaviour in rats with graded 6-OHDA lesions. Behav. Brain Res. 169, 1-9 (2006).
- Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson's disease. Acta Neurochir. (Wien.). 101, 89-92 (2008).
- Isacson, O. Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease. JoVE. 3, (2007).
