Summary
पार्किंसंस रोग डोपामिनर्जिक innervation striatum, जो प्रयोगात्मक 6-OH-डोपामाइन द्वारा प्रेरित किया जा सकता है नुकसान के कारण होता है. हम वर्णन कैसे एक stereotaxic घाव प्रदर्शन करने के लिए और apomorphine प्रेरित चूहों में घूर्णी व्यवहार की निगरानी. यह मॉडल पार्किंसंस रोग के लिए नए उपचारों के परीक्षण के लिए उपयोगी और विश्वसनीय है.
Protocol
ठोस रूप में संग्रहीत सभी 6-OHDA और apomorphine जैसे, रसायन, बाँझ इंजेक्शन पानी में पतला थे और एक लामिना का प्रवाह हुड के अंदर फ़िल्टर, संक्रमण से बचने. इसके अलावा, neurotoxins और neuroactive पदार्थों संग्रहीत थे, तैयार संभाला और अंतरराष्ट्रीय दिशानिर्देशों 6 और स्थानीय जैवसुरक्षा समिति द्वारा निर्धारित नियमों के अनुसार निपटाया.
1 - संज्ञाहरण और सर्जरी
वयस्क पुरुष स्विस चूहों (25-30g) atropine (0.2 मिलीग्राम / किलोग्राम, सुप्रीम कोर्ट) के साथ premedicated vagal स्वर को कम करने और फिर Ketamine (90-120 मिलीग्राम / किलोग्राम) और Xylazine (10 मिलीग्राम / किलोग्राम) की एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ anesthetized . जानवर एक इलेक्ट्रॉनिक नियंत्रित हीटिंग पैड (इनसाइट) पर रखा गया है सुनिश्चित करने के शरीर का तापमान 37 से बनाए रखा है ° सी, बेहोश करने की क्रिया की प्रेरण के रूप में कुछ मिनट लगते हैं. प्रक्रिया के दौरान संज्ञाहरण के स्तर वापसी पलटा के अभाव के परीक्षण के द्वारा जाँच की है. संवेदनाहारी खुराक प्रत्येक तनाव / कॉलोनी के लिए ajusted होना चाहिए. सर्जरी के पशु और अवधि पर निर्भर करता है, Ketamine की अतिरिक्त खुराक के लिए आवश्यक हो सकता है. उसके बाद, खारा (NaCl 0,9%) दोनों आंखों पर लागू होता है बाहर सुखाने से corneas की रक्षा और इस पहले क्षण में झपकी पलटा के अभाव का परीक्षण है. पूरे सिर पर फर एक trimmer के साथ मुंडा unsterile क्षेत्रों के साथ न्यूनतम संपर्क सुनिश्चित करने के लिए. स्थानीय चतनाशून्य करनेवाली औषधि (Xylocaine) कान सलाखों परेशानी को रोकने के लिए लागू किया जाता है. केवल एक बार वापसी और झपकी पलटा गायब हो गई है, संज्ञाहरण के स्तर का संकेत सर्जरी (3 चरण) के लिए पर्याप्त गहरी है, पशु stereotaxic मुँह टुकड़ा और कान सलाखों के विशेष रूप से इस प्रजाति (इनसाइट) के लिए डिजाइन का उपयोग कर फ्रेम पर तैनात है. एक बार positionated, एक ophthalmologic मरहम (MARCA) सभी सर्जरी के दौरान जानवरों की आंखों की रक्षा के लिए लागू किया जाता है. के बाद ही यह सुनिश्चित करें कि आँखें सही ढंग से संरक्षित कर रहे हैं, 70% इथेनॉल के बाद povidone आयोडीन की तीन अनुप्रयोगों दोहरा द्वारा प्रक्रिया शल्य चिकित्सा क्षेत्र के त्वचा की कीटाणुशोधन के साथ जारी रखने के बाद, बाँझ सूती swabs का उपयोग करने के लिए, कान सलाखों के उचित स्थान है सिर के बग़ल में आंदोलनों के लिए परीक्षण द्वारा सुनिश्चित की (सिर करने के लिए सुनिश्चित करें कि सलाखों सुरक्षित तय कर रहे हैं कदम नहीं चाहिए). सिर के समुचित dorsoventral झुकाव बाद में सत्यापित किया जाना होगा जब खोपड़ी स्थलों से पता चला रहे हैं. एक बाण के समान चीरा (1.5 सेमी) एक बाँझ स्केलपेल (# 15 ब्लेड) के साथ किया जाता है. periosteum हित के क्षेत्र पर धीरे से एक नया ब्लेड के साथ दूर scraped है, और हड्डी बाँझ टकटकी और कपास swabs के साथ साफ है, खोपड़ी स्थलों को उजागर: bregma बाण के समान और राज्याभिषेक sutures के चौराहे के बिंदु के रूप में परिभाषित किया गया है, जबकि लैम्ब्डा बाण के समान सीवन के प्रतिच्छेदन और सबसे अच्छा फिट lambdoid सीवन के बाएँ और दाएँ भाग के माध्यम से गुजर लाइन की बात है. खड़ी गठबंधन संदर्भ सुई की नोक पहले bregma पर चुना है, सर्जिकल माइक्रोस्कोप के माध्यम से परीक्षा के तहत, और फिर लैम्ब्डा बिंदु के रूप में स्पर्श करने के लिए चले गए. अगर सिर ठीक से तैनात है, लैम्ब्डा dorso - वेंट्रल bregma रूप में एक ही स्तर पर हो सकता है, जाना चाहिए और दोनों स्थलों rostro - दुम अक्ष साथ 4.2 मिमी से दूर होना चाहिए. यदि नहीं, तो कान सलाखों और nosepiece और ढीला किया जाना चाहिए सिर नाजुक interaural अक्ष के चारों ओर झुका, क्रम में प्राप्त करने के लिए इच्छित स्थिति, जो stereotaxical उपायों के लिए फ्लैट खोपड़ी "संदर्भ को परिभाषित करता है. संदर्भ सुई की नोक तो वांछित निर्देशांक पर तैनात है: 0.5 मिमी) (एपी पूर्वकाल पीछे और पार्श्व (एल -2.0 मिमी, बाएं). स्थान खोपड़ी पर चिह्नित किया है और एक छोटा सा छेद (1.2 मिमी व्यास) एक निष्फल ड्रिल बिट के साथ खोला जाता है, आंतरायिक कार्रवाई का उपयोग करने के लिए क्षेत्र गर्मी को रोकने. अस्थि टुकड़े ध्यान से एक दंत curette के साथ हटा रहे हैं और बाँझ गर्म 0.9% NaCl के साथ धोया. निष्फल 5 μl हैमिल्टन सिरिंज (26s गेज; 0.47 मिमी बाहरी व्यास) 6-OHDA समाधान (या नियंत्रण जानवरों के लिए वाहन) के साथ भरी हुई है और खड़ी stereotaxic तंत्र में गठबंधन है. सुई की नोक प्रकार (2 या 12 ° बेवल) तो खोला छेद में डाला जाता है, pial सतह को छूने तक dorso - वेंट्रल समन्वय के संदर्भ बिंदु नियत. एक बार इस समन्वय पक्का, सुई धीरे striatum के निर्देशांक (:;: -2.0 और DV: -3.0 मिमी, pial सतह के नीचे 7 एल 0.5 एपी) तक पहुँचने के लिए कम है. 6 - OHDA (0.02% ascorbic एसिड के साथ 10 6 - OHDA μg 0.9% NaCl में) समाधान है, जो तैयार किया गया था और एक लामिना का प्रवाह डाकू अंदर फ़िल्टर, और प्रकाश से प्रक्रिया के दौरान एल्यूमीनियम पन्नी द्वारा संरक्षित किया जाना चाहिए है तो इंजेक्शन है 0.1μL/min की एक प्रवाह दर. नियंत्रण जानवरों के लिए, वाहन के एक बराबर मात्रा (0.02% ascorbic एसिड और 0.9% बाँझ पानी में NaCl) अंतःक्षिप्त है. एक बार पूरे 2.0 μL इंजेक्शन दिया गया है, सिरिंज 5 मिनट के लिए जगह में रखा है इससे पहले कि बहुत धीरे धीरे जा रहा है मस्तिष्क से मुकर 5 मिनट में से कम नहीं में है. खोपड़ी और साफ है और चीरा # 6-0 नायलॉन सिवनी (Shalon) का उपयोग करने के लिए बंद कर दिया है. एक अतिरिक्त लेने के लिएसंक्रमण के खिलाफ देखभाल, neomycin के रूप में एक स्थानीय एंटीबायोटिक मलहम, sutured त्वचा के लिए लागू किया जा सकता है. पशु फ्रेम, खारा (sc.) के 0.5 मिलीलीटर दिया निर्जलीकरण को रोकने से हटा रहे हैं, और गर्म और पूरी वसूली तक करीब अवलोकन के अंतर्गत रखा. वे तो भोजन और पानी विज्ञापन libitum के साथ रखे जाते हैं. एनाल्जेसिक सर्जरी के बाद पहले दो दिन (औसतन 5.5 मिलीलीटर की दैनिक पानी की खपत को दिया, के लिए पीने के पानी की बोतल और 0.03 मिलीग्राम / शरीर / वजन दिन के Ibuprofen जी की एक सिफारिश की खुराक के लिए जोड़ा जाता है, 20 मिलीग्राम की 0,82 एमएल जोड़ने / एमएल Ibuprofen Abbott निलंबन 100 एमएल पीने के पानी के लिए). चूहे आमतौर पर प्रक्रिया से तुरंत ठीक, भटक और आसानी से पानी, भोजन छर्रों के लिए तक पहुँचने. स्पष्ट बेचैनी, या संक्रमण के किसी भी हस्ताक्षर के किसी भी मामले में, जानवरों स्थानीय दिशा निर्देशों के अनुसार euthanized किया जाना चाहिए.
2 - व्यवहार परीक्षण
हालांकि मोटर हानि एक सप्ताह के बाद देखा जा सकता है है, एक महीने के एक अंतराल के बाद घाव रोटेशन परीक्षण के साथ विश्वसनीय मात्रा का ठहराव से पहले की अनुमति दी है. जानवर डीए agonist apomorphine (0.5 मिलीग्राम / किलोग्राम) के एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन प्राप्त और 30 सेमी व्यास के एक अपारदर्शी सिलेंडर में रखा है, रिकॉर्डिंग कैमरा नीचे 45 सेमी रखा. यह महत्वपूर्ण है के प्रत्येक परीक्षा से पहले पहले परीक्षण पशुओं से किसी भी अवशेष और odors को हटा. 5 मिनट habituation अवधि के बाद, आंदोलनों एक 5 मिनट की समय सीमा में दर्ज कर रहे हैं. दोनों विपरीत और ipsilateral रोटेशन पूरे शरीर मापा और नियंत्रण समूह (वाहन इंजेक्शन) के साथ तुलना कर रहे हैं. यदि प्रक्रिया सही ढंग से प्रदर्शन किया था, नियंत्रण जानवरों किसी भी रोटेशन प्रदर्शन नहीं, जबकि 6-OHDA lesioned जानवरों contralateral ओर मोड़ से शुरू होगा, क्योंकि agonist मुख्यतः lesioned तरफ अति सूक्ष्मग्राही denervated striatum सक्रिय होगा. 7 rpm (कम से कम 7 मिनट के प्रति पूर्ण शरीर contralateral rotations प्रदर्शित) से अधिक रन पशु माना जाता है के रूप में सफलतापूर्वक lesioned. जानवर सुरक्षित रूप से परीक्षण के बाद उनके आवास 30 मिनट, जो साप्ताहिक दोहराया जा सकता है लौटा जा सकता है. हमारे हाथों में, lesioned चूहों के कम से कम 5% suboptimal रोटेशन दरों का प्रदर्शन किया.
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Discussion
Nigro-striatal मार्ग का व्यापक एकतरफा घाव चूहों में मज़बूती से कर सकते हैं striatum में एक 6-OHDA stereotaxic इंजेक्शन द्वारा हासिल की. घाव की हद तक immunohistochemistry द्वारा पोस्टमार्टम सत्यापित Tyrosine hydroxylase के लिए कर सकते हैं (जो डीए के संश्लेषण की अवस्था सीमित दर, यानी dihydroxyphenylalanine एल Tyrosine के रूपांतरण catalyses), के रूप में वीडियो में सचित्र.
Vivo में, contralateral apomorphine द्वारा प्रेरित rotations एम्फ़ैटेमिन प्रेरित ipsilateral 8 रोटेशन की तुलना में एक अधिक से अधिक striatal घाव का एक बेहतर भविष्यवक्ता हैं. इस प्रकार, घाव के कार्यात्मक परिणाम apomorphine प्रेरित contralateral rotations के एक सरल उपाय के द्वारा कई महीनों से नजर रखी जा सकता है.
सफलता की दर के बारे में 95% है. यह काफी की तुलना में क्या आमतौर पर (50-70%) चूहों में जो व्यापक डोपामिनर्जिक रिक्तीकरण neurotoxin के गुणकों इंजेक्शन की आवश्यकता है और मृत्यु दर बढ़ जाती है के लिए सूचना दी है अधिक है. चूहों में, प्रयोगात्मक शर्तों के वजन मिलान के पशुओं का चयन द्वारा मानकीकृत हो, और चाहिए, केवल हौसले से तैयार समाधान 6-OHDA का उपयोग कर. हालांकि अन्य समूहों अलग एकाग्रता और / या neurotoxin के संस्करणों का उपयोग कर सकते हैं, हमने पाया है कि एक 5 मिलीग्राम / एमएल 6 - OHDA (0.02% ascorbic एसिड ऑक्सीकरण रोकने के लिए युक्त) के नमकीन घोल के 2 मिलीलीटर सबसे अधिक से अधिक घाव के लिए कुशल थे. वैकल्पिक रूप से, submaximal इंजेक्शन डोपामिनर्जिक टर्मिनलों है कि मानव में, 9 पीडी के किशोर और जल्दी शुरू होने के रूपों में विशेष रूप से होता है के प्रगतिशील अध: पतन की नकल करने के लिए उपयोगी हो सकता है.
MPTP घावों सहज वसूली के लिए नेतृत्व सकता है, और अतिरिक्त लिंग, आयु, और तनाव के प्रति संवेदनशील है. हाल ही में एक अध्ययन से पता चलता है कि यह चूहों में 6 OHDA घावों, जो striatum भीतर अवशिष्ट डीए सामग्री में बड़े पैमाने पर और लंबे समय तक चलने कटौती उपज के लिए मामला है, के रूप में सभी में substantia nigra में TH सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या में अच्छी तरह से नहीं है चूहों के 10 परीक्षण किया गया.
वर्तमान समय में, 6 hydroxydopamine पार्किंसंस के घाव मॉडल - जो बड़े पैमाने पर किया गया है चूहों में 40 वर्षों के लिए इस्तेमाल किया, मज़बूती से चूहों को transposed किया जा सकता है. हमें उम्मीद है कि इस वीडियो के अन्य समूहों के लिए उपयोगी हो जाएगा, और इस तरह 11 पीडी के लिए नई सेलुलर चिकित्सा पर preclinical अनुसंधान के लिए की जरूरत प्रयोगों और जानवरों की संख्या को कम.
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Disclosures
प्रयोगों के अनुसार तंत्रिका विज्ञान में और स्तनधारी की देखभाल और उपयोग के लिए अंतरराष्ट्रीय निर्देशों और व्यवहार अनुसंधान के साथ प्रदर्शन किया गया
Acknowledgments
Fundação डे Amparo द्वारा समर्थित Pesquisa राज्य रियो डी जनेरियो (FAPERJ) और Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico ई Tecnologico (CNPq). हम अनाम रेफरी टिप्पणियों जिसका हमारी मदद पांडुलिपि और वीडियो दोनों में सुधार के लिए आभारी हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride | König | 90-120 mg/Kg | |
| Xylazine hydrochloride | König | 10 mg/Kg | |
| Atropine Sulfate | Isofarma | Isofarma | |
| 6 – Hydroxydopamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 5 μg/μL | |
| L - Ascorbic Acid | USB Corp., Affymetrix | 0.2% | |
| Xylocaine (Lidocaine Chloridrate) | AstraZeneca | 5% 50 mg |
|
| Nebacetin (Neomycin Sulfate + Bacitracin) | Altana Pharma | 5 mg/g + 250 Ul/g | |
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg | |
| GenTeal lOphthalmic ointment Hypromellose | Novartis AG | 0.33% |
|
| Ibuprofen | Abbott Laboratories | 4 mg/ 100 ml drinking water | |
| Povidine | Johnson Diversey | ||
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg |
References
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