Summary
Parkinson malattia è causata dalla perdita di innervazione dopaminergica al corpo striato, che può essere indotta sperimentalmente dalla 6-OH-dopamina. Ci descrivono come eseguire una lesione stereotassica e per monitorare apomorfina comportamenti indotti nei topi di rotazione. Questo modello è utile ed affidabile per testare nuove terapie per il morbo di Parkinson.
Abstract
Malattia di Parkinson (PD) colpisce almeno 6,5 milioni di persone in tutto il mondo, indipendentemente dal genere, i confini sociali, etniche, economiche, o geografici. Sintomi chiave, quali tremore, rigidità e bradikinesia, si sviluppano quando circa 3 / 4 di cellule dopaminergiche si perdono nella substantia nigra, e non riescono a prevedere il liscio, la regolazione coordinata di circuiti motori striatale. La depressione e allucinazioni sono comuni, e la demenza si verifica alla fine nel 20% dei pazienti. In questo momento, non esiste alcun trattamento per ritardare o arrestare la progressione della malattia di Parkinson. Piuttosto, i farmaci attualmente disponibili obiettivo più verso la riduzione di questi sintomi. Nuove strategie chirurgiche possono reversibilmente accendere i circuiti funzionalmente danneggiato attraverso la stimolazione elettrica delle strutture cerebrali profonde, ma anche se la stimolazione cerebrale profonda è un grande passo avanti, non è adatto per tutti i pazienti. Resta quindi necessario testare nuovi approcci di terapia cellulare in modelli preclinici.
Distruzione selettiva delle vie dopaminergiche neurotossici possono essere riprodotti mediante iniezione di 6-idrossidopamina (6-OHDA) o MPTP (1-metil-4-fenil-1 ,2,3,6-tertahydropyridine) mentre riducono farmaci e composti chimici dannosi per ossidativo può anche riprodurre le caratteristiche specifiche del PD nei roditori. A differenza di MPTP, 6-OHDA lesioni causare una massiccia perdita irreversibile dei neuroni, e può essere unilaterale o bilaterale. Il 6-OHDA modello di lesione è affidabile, porta a deficit motori robusti, ed è il più utilizzato dopo 40 anni di ricerca nel rats1. Le interazioni tra le cellule innestate e di host possono essere studiato più a fondo nei topi, piuttosto che nei ratti, il modello è stato recepito a topi 2,3, dove è stato recentemente caratterizzato 4.
In questo video ci dimostra come lesione sinistra nigro-striatale percorso di topi anestetizzati lentamente offrendo 2,0 ml di 6-OHDA attraverso un stereotaxically inserito micro-siringa. La perdita di ingresso dopaminergici avviene in pochi giorni, e il deficit funzionale può essere monitorate nel corso post-operatorio settimane e mesi da rotazioni animale voto indotta da agenti dopaminergici 5. Qui vi mostriamo rotazioni controlaterale tutto il corpo che si verificano 10 minuti dopo una singola somministrazione sottocutanea di apomorfina, misurata un mese dopo la lesione. Risultati e svantaggi sono discussi di seguito.
Protocol
Tutti i prodotti chimici conservati in forma solida, come la 6-OHDA e apomorfina, sono stati diluiti in acqua sterile e filtrata all'interno di una cappa a flusso laminare, per evitare contaminazioni. Inoltre, neurotossine e sostanze neuroattivi erano conservati, preparati, trattati e smaltiti secondo le norme stabilite dalle linee guida internazionali 6 e il locale Comitato Biosicurezza.
1 - Anestesia e chirurgia
Topi maschi adulti svizzeri (25-30g) sono premedicazione con atropina (0,2 mg / kg, sc) per ridurre il tono vagale e poi anestetizzati con una iniezione intraperitoneale di ketamina (90-120 mg / Kg) e xilazina (10 mg / Kg) . L'animale viene posto su una piastra elettrica a controllo elettronico (Insight) per garantire la temperatura corporea è mantenuta a 37 ° C, come l'induzione della sedazione dura qualche minuto. Il livello di anestesia viene controllato durante tutta la procedura di verifica l'assenza di riflesso ritiro. Dosaggio di anestetico deve essere regolata per ogni ceppo / colonia. A seconda che l'animale e la durata della chirurgia, ulteriori dosi di ketamina può essere necessario. Dopo di che, soluzione salina (NaCl 0,9%) è applicato su entrambi gli occhi per proteggere la cornea si secchi e verificare l'assenza del riflesso lampeggiano in questo primo momento. La pelliccia sopra la testa intera è rasata con un trimmer per garantire il minimo contatto con le zone non sterile. Anestetico locale (Xylocaine) viene applicato al bar orecchio per evitare disagi. Solo una volta ritiro e riflessi sono scomparsi lampeggiare, indicando il livello di anestesia è abbastanza profondo per l'intervento chirurgico (fase 3), l'animale è posizionato sul telaio stereotassico con bocchino e bar orecchio appositamente per questa specie (Insight). Una volta 'dislocate, un unguento oculistico (MARCA) viene applicato per proteggere gli occhi degli animali in tutta la chirurgia. Solo dopo essere sicuri che gli occhi sono correttamente protette, la procedura di continuare con la disinfezione della cute della regione chirurgico ripetendo tre applicazioni di iodio povidone seguito da 70% etanolo, utilizzando tamponi sterili cotoni Dopo, il corretto posizionamento delle barre orecchio è garantito mediante una analisi di movimenti laterali della testa (la testa non deve muoversi per garantire che le barre sono fissate in modo sicuro). La corretta inclinazione della testa dorsoventrale sarà verificata più tardi, quando sono rivelati punti di riferimento del cranio. Una incisione sagittale (1,5 cm) è fatto con un bisturi sterile (# 15 lama). Il periostio sopra l'area di interesse è leggermente raschiato via con una nuova lama, e l'osso è pulito con lo sguardo sterile e tamponi di cotone, per scoprire punti di riferimento del cranio: bregma è definito come il punto di intersezione delle suture sagittale e coronale, mentre lambda è il punto di intersezione della sutura sagittale e la linea più adatta passando attraverso la parte sinistra e destra della sutura lambdoidea. La punta di un ago di riferimento allineati verticalmente è prima azzerato al bregma, in esame attraverso il microscopio chirurgico, e poi spostato per toccare il punto lambda. Se la testa è posizionata correttamente, lambda deve essere allo stesso livello dorso-ventrale come bregma, ed entrambi i punti di riferimento devono essere distanti di 4,2 mm lungo il rostro-caudale asse. In caso contrario, le barre orecchie e nasello devono essere allentare e la testa delicatamente inclinata intorno all'asse interaurali, al fine di ottenere la posizione desiderata, che definisce il "piatto del cranio" di riferimento per le misure stereotaxical. La punta dell'ago di riferimento è quindi posizionato alle coordinate desiderato: antero-posteriore (AP 0,5 millimetri) e laterale (L -2,0 mm, a sinistra). La posizione è segnato sul cranio e una piccola (1,2 mm di diametro) del foro è aperto con una punta da trapano sterilizzato, con azione intermittente per evitare che il calore della zona. Frammenti di ossa sono accuratamente rimosso con un curette dentale e lavato con sterili caldo NaCl 0,9%. Il sterilizzati 5 microlitri siringa Hamilton (26 anni calibro; 0,47 mm di diametro esterno) viene caricato con la 6-OHDA soluzione (o di un veicolo per gli animali di controllo) e allineati verticalmente nell'apparato stereotassica. La punta dell'ago (tipo 2 o 12 smusso °), viene quindi inserito nel foro aperto, fino a toccare la superficie piale, per determinare il punto di riferimento del dorso-ventrale coordinate. Una volta determinata questa coordinata, l'ago viene lentamente abbassato per raggiungere le coordinate dello striato (AP: 0,5; L: -2,0 e DV: mm -3,0, sotto la superficie piale 7). Il 6-OHDA soluzione (10 mg 6-OHDA nello 0,9% di NaCl con acido ascorbico 0,02%), che è stato preparato e filtrata all'interno di una cappa a flusso laminare, e deve essere protetto dalla luce da un foglio di alluminio durante tutta la procedura, viene iniettato a una portata di 0.1μL/min. Per gli animali di controllo, un uguale volume di veicoli (0,02 acido ascorbico% e 0,9% di NaCl in acqua sterile) viene iniettato. Una volta che l'intero microlitri 2.0 è stato iniettato, la siringa viene mantenuto in sede per 5 minuti prima di essere molto lentamente ritirato dal cervello, in non meno di 5 minuti. Il cranio è pulita e l'incisione viene chiusa con una sutura in nylon # 6-0 (Shalon). Per fare un ulteriorecura contro le infezioni, una pomata antibiotica locale, come la neomicina, può essere applicato alla pelle suturata. Gli animali vengono rimossi dal telaio, dato 0,5 ml di soluzione fisiologica (sc.) per prevenire la disidratazione, e tenuti al caldo e sotto stretta osservazione fino al recupero completo. Essi vengono poi alloggiati con cibo e acqua ad libitum. Analgesico si aggiunge alla bottiglia di acqua potabile per i primi due giorni dopo l'intervento (dato un consumo medio di acqua giornaliero di 5,5 ml, e una dose raccomandata di 0,03 Ibuprofene mg / g di peso corporeo / giorno; aggiungere 0,82 ml di 20 mg / mL Ibuprofene-Abbott sospensione per 100 ml di acqua potabile). I topi di solito guariscono subito dalla procedura, errante e il raggiungimento di pellet cibo l'acqua con facilità. In ogni caso di disagio evidente, o di qualsiasi segno di infezione, gli animali dovrebbero essere eutanasia secondo le linee guida locali.
2 - prova di comportamento
Sebbene la disabilità motoria può essere osservato dopo una settimana, un post-lesione intervallo di un mese è permesso prima di quantificazione affidabile con il test di rotazione. L'animale riceve una iniezione sottocutanea di apomorfina agonista DA (0,5 mg / Kg), ed è posto in un cilindro opaco di 30 cm di diametro, posto 45 centimetri sotto la telecamera di registrazione. E 'importante rimuovere eventuali residui e odori provenienti da animali precedentemente testati prima di ogni prova. Dopo un periodo di assuefazione 5 minuti, i movimenti sono registrati nel corso di un periodo di tempo 5 min. Entrambe le controindicazioni e ipsilaterale tutto il corpo di rotazione sono misurati e confrontati con il gruppo di controllo (veicolo iniettato). Se la procedura è stata eseguita correttamente, gli animali di controllo non mostra alcuna rotazione, mentre 6-OHDA animali lesionati inizierà a girare verso il lato controlaterale, dal momento che l'agonista attiva prevalentemente striato supersensibile denervato sul lato leso. Animali punteggio superiore a 7 giri (la visualizzazione di almeno 7 rotazioni controlaterale tutto il corpo al minuto) sono considerati come successo lesionate. L'animale può essere tranquillamente tornati alle loro case 30 min dopo il test, che può essere ripetuto ogni settimana. Nelle nostre mani, meno del 5% dei topi lesionati mostrato tassi di rotazione ottimale.
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Discussion
Ampia lesione unilaterale del nigro-striatale percorso può essere ottenuto in modo affidabile in topi da una singola iniezione stereotassica di 6-OHDA nello striato. L'entità della lesione può essere verificata post-mortem di immunoistochimica per tirosina idrossilasi (che catalizza la tappa limitante della sintesi di DA, cioè la conversione di L-tirosina per diidrossifenilalanina), come illustrato nel video.
In vivo, rotazioni controlaterale indotto da apomorfina sono un migliore indicatore di massima lesione striatale di anfetamina indotta rotazione ipsilaterale 8. Così, le conseguenze funzionali della lesione può essere monitorato per diversi mesi con un provvedimento diretto di apomorfina indotta rotazioni controlaterale.
Il tasso di successo è di circa il 95%. E 'significativamente superiore a quello che normalmente è riportato per i ratti (50-70%) in cui ampio deplezione dopaminergica richiede iniezioni multipli della neurotossina e aumenta il tasso di mortalità. Nei topi, condizioni sperimentali dovrebbero essere standardizzati, selezionando gli animali di corrispondenza di peso, e solo con preparati al momento 6-OHDA soluzione. Anche se altri gruppi possono usare la concentrazione e / o volumi di neurotossina, abbiamo trovato che 2 ml di 5 mg / ml soluzione salina di 6-OHDA (contenenti acido ascorbico 0,02% per prevenire l'ossidazione) sono stati i più efficienti per lesione massima. In alternativa, le iniezioni submassimale potrebbe essere utile per simulare la progressiva degenerazione dei terminali dopaminergici che si verifica negli esseri umani, soprattutto in forme giovanili ed insorgenza precoce della malattia di Parkinson 9.
Lesioni MPTP può portare a guarigione spontanea, ed è inoltre sensibile al genere, all'età, e la tensione. Un recente studio indica che questo non è il caso per 6-OHDA lesioni nei topi, che comporterebbe riduzioni della durata di massa e di lunga nel contenuto residuo DA all'interno del corpo striato, come pure del numero di cellule positive TH nella substantia nigra in tutti i topi testati 10.
Al momento, la 6-idrossidopamina modello lesione di Parkinson - che è stato ampiamente usato per 40 anni nei ratti -, può essere attendibilmente trasposta ai topi. Ci auguriamo che questo video potrebbe essere utile ad altri gruppi, e quindi ridurre il numero di esperimenti e di animali necessari per la ricerca preclinica di nuove terapie cellulari per il PD 11.
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Disclosures
Gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida internazionali per la cura e l'uso dei mammiferi in Neuroscienze e Comportamento di ricerca
Acknowledgments
Supportato da Fundação de Amparo uno Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico (CNPq). Siamo grati a referee anonimi i cui commenti ci hanno aiutato a migliorare sia il manoscritto e video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride | König | 90-120 mg/Kg | |
| Xylazine hydrochloride | König | 10 mg/Kg | |
| Atropine Sulfate | Isofarma | Isofarma | |
| 6 – Hydroxydopamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 5 μg/μL | |
| L - Ascorbic Acid | USB Corp., Affymetrix | 0.2% | |
| Xylocaine (Lidocaine Chloridrate) | AstraZeneca | 5% 50 mg |
|
| Nebacetin (Neomycin Sulfate + Bacitracin) | Altana Pharma | 5 mg/g + 250 Ul/g | |
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg | |
| GenTeal lOphthalmic ointment Hypromellose | Novartis AG | 0.33% |
|
| Ibuprofen | Abbott Laboratories | 4 mg/ 100 ml drinking water | |
| Povidine | Johnson Diversey | ||
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg |
References
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