Summary
Parkinsons sjukdom orsakas av förlust av dopaminerga innervation till striatum, som kan experimentellt framkallas av 6-OH-dopamin. Vi beskriver hur du utför en stereotaxic lesion och övervaka apomorfin-inducerad roterande beteende hos möss. Denna modell är användbar och tillförlitlig för att testa nya terapier för Parkinsons sjukdom.
Abstract
Parkinsons sjukdom (PS) drabbar minst 6,5 miljoner människor världen över, oavsett kön, sociala, etniska, ekonomiska eller geografiska gränser. Viktiga symtom såsom skakningar, stelhet och bradikinesia, utvecklas när ca 3 / 4 av dopaminerga celler är vilse i substantia nigra, och misslyckas med att ge en smidig, samordnad reglering av striatala motoriska kretsar. Depression och hallucinationer är vanliga, och demens så småningom förekommer i 20% av patienterna. Vid denna tid finns det ingen behandling för att fördröja eller stoppa utvecklingen av PD. Snarare de mediciner tillgängliga mål mer mot att lindra dessa symtom. Nya kirurgiska strategier kan reversibelt slå på funktionellt skadade kretsar genom elektrisk stimulering av djupa hjärnans strukturer, men även om djup hjärnstimulering är ett stort framsteg, är det inte passar alla patienter. Det återstår därför nödvändigt att testa nya metoder cellterapi i prekliniska modeller.
Selektiv neurotoxiska störningar i dopaminerga banor kan reproduceras genom injektion av 6-hydroxydopamine (6-OHDA) eller MPTP (1-metyl-4-fenyl-1 ,2,3,6-tertahydropyridine) medan nedbrytande droger och oxidativ-skadliga kemikalier kan också återge särdrag PD hos gnagare. Till skillnad från MPTP, 6-OHDA lesioner orsaka omfattande oåterkalleliga neuronala förlust, och kan vara uni-eller bilateral. Den 6-OHDA lesionen modell är pålitlig, leder till robusta motoriken, och är den mest använda efter 40 års forskning i rats1. Samspel mellan transplanterade celler och värd kan nu studeras mer noggrant i möss än hos råttor, har modellen införlivats till möss 2,3, där det nyligen har präglats 4.
I denna video visar vi hur man lesionen vänster Nigro-striatala stig sövda möss genom att långsamt leverera 2,0 mikroliter av 6-OHDA genom en stereotaxically in mikro-sprutnålen. Förlusten av dopaminerga ingång sker inom några dagar, och funktionsnedsättning kan följas över postoperativ veckor och månader av rotationer betyg djur framkallas av dopaminerga medel 5. Här visar vi hela kroppen kontralateral rotation sker 10 minuter efter en enstaka subkutan administrering av apomorfin, mätt en månad efter förändringen. Utfall och nackdelar diskuteras nedan.
Protocol
Alla kemikalier som lagras i fast form, till exempel 6-OHDA och apomorfin var utspädd i steril injektionsutrustning vatten och filtreras i ett laminärt flöde huva, för att undvika kontaminering. Dessutom var nervgifter och neuroactive ämnen lagras, bereds, hanteras och kasseras enligt föreskrifter som fastställts av internationella riktlinjer 6 och den lokala biosäkerhet kommittén.
1 - anestesi och kirurgi
Vuxna manliga schweiziska möss (25-30g) är premedicinerade med Atropin (0,2 mg / kg sc) för att minska vagala ton och sedan bedövas med en intraperitoneal injektion av ketamin (90-120 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg) . Djuret är placerad på en elektroniskt styrd värmedyna (Insight) för att säkerställa kroppstemperaturen hålls vid 37 ° C, induktion av sederingen tar några minuter. Den anestesi nivån kontrolleras under hela förfarandet genom att testa inte dras tillbaka reflex. Bedövningsmedel dosen ställas in för varje stam / koloni. Beroende på djuret och under hela operationen, kan ytterligare doser Ketamin vara nödvändig. Efter det är saltlösning (NaCl 0,9%) appliceras på båda ögonen för att skydda hornhinnor från att torka ut och testa avsaknaden av blinkningsreflexsen i denna första stund. Päls över hela huvudet är rakat med en trimmer för att se det minsta kontakt med osterila områden. Lokalbedövning (Xylocain) tillämpas på örat barer att förhindra obehag. Bara en gång tillbakadragande och blinkar reflex har försvunnit, vilket indikerar den nivå av anestesi är tillräckligt djup för operation (steg 3), är djuret placeras på stereotaxic ramen med munstycke och barer örat speciellt utformad för denna art (Insight). När positionated, en oftalmologiska salva (MARCA) tillämpas för att skydda djurs ögon i hela operationen. Först efter vara säker på att ögonen är korrekt skyddade, förfarandet fortsätta med desinfektion av huden på kirurgiska regionen genom att upprepa tre tillämpningar av povidonjodid följt av 70% etanol, med steril bomull kompresser När är korrekt placering av örat barer garanteras genom testning för sidorörelser av huvudet (huvudet inte måste flytta för att säkerställa att barerna är ordentligt fast). Korrekt dorsoventral lutning av huvudet kommer att kontrolleras senare när skallen landmärken är avslöjade. En sagittal snitt (1,5 cm) är gjord med en steril skalpell (# 15 blad). Periostet över det område av intresse är försiktigt skrapas bort med ett nytt blad, och benet är torkas rena med en steril blick och kompresser bomull, för att avslöja skallen landmärken: bregma definieras som skärningspunkten mellan sagittala och koronala suturer, medan lambda är skärningspunkten av sagittal sutur och den bästa räta linje som passerar genom vänster och höger delar av lambdoid sutur. Spetsen på en lodrätt referens nål är först nollställs vid bregma, som undersöks genom kirurgiska mikroskop, och flyttade sedan för att röra vid lambda punkten. Om huvudet är i rätt läge, bör Lambda ligga på samma Dorso-ventrala nivå som bregma, och båda landmärken bör avlägsna med 4,2 mm längs Rostro-caudal axeln. Om inte, bör öronen barer och näsdel att lossa och huvudet försiktigt lutas runt interaural axeln, för att uppnå önskad position, som definierar "platt skalle" referens för stereotaxical åtgärder. Spetsen på referens nålen sedan på det önskade koordinater: anterior-posterior (AP 0,5 mm) och laterala (L -2,0 mm, vänster). Platsen är markerad på skallen och en liten (1,2 mm) hål öppnas med en steriliserad borr, med hjälp av intermittent åtgärder för att förhindra värmen området. Benfragment avlägsnas omsorgsfullt med en tand kyrettens och tvättas med steril varmt 0,9% NaCl. Den steriliserade 5 l Hamilton spruta (26S gauge, 0,47 mm ytterdiameter) är laddad med den 6-OHDA lösning (eller fordon för kontroll djur) och lodrätt i stereotaxic apparaten. Spetsen på nålen (typ 2 eller 12 ° avfasning) sedan in i det öppnade hålet, tills vidrör pial ytan, till bestämda referenspunkten i Dorso-ventrala samordna. När bestämda detta samordna, är nålen sakta sänks för att nå koordinater striatum (AP: 0,5, L: -2,0 och DV: -3,0 mm, under pial yta 7). Den 6-OHDA lösning (10 mikrogram 6-OHDA i 0,9% NaCl med 0,02% askorbinsyra), som utarbetades och filtreras i ett laminärt flöde huva, och måste skyddas från ljus med aluminiumfolie under hela förfarandet, är sedan injiceras på ett flöde 0.1μL/min. För styrning djur är en lika stor volym av fordon (0,02% askorbinsyra och 0,9% NaCl i sterilt vatten) injiceras. När hela 2,0 mikroliter har injicerats, är sprutan hålls på plats under 5 minuter innan det mycket långsamt tillbaka från hjärnan, i inte mindre än 5 minuter. Skallen är rengjorda och snittet är stängd med en # 6-0 nylon sutur (Shalon). För att ta ett extravård mot infektion kan en lokal antibiotika salva, till exempel neomycin, appliceras på sys huden. Djur tas bort från ramen, med tanke på 0,5 ml koksaltlösning (sc.) för att förhindra uttorkning, och hålls varm och under noggrann uppsikt tills full återhämtning. De är sedan hålls med mat och vatten ad libitum. Smärtstillande läggs till dricksvatten flaska för de första två dagarna efter operationen (givet en genomsnittlig daglig vattenförbrukning på 5,5 ml och en rekommenderad dos av 0,03 mg ibuprofen / g kroppsvikt / dag, tillsätt 0,82 ml 20 mg / mL Ibuprofen-Abbott fjädring till 100 ml dricksvatten). Möss återhämta vanligtvis omgående från förfarandet, vandrande och nå för pellets vatten mat enkelt. I varje fall av uppenbara obehag, eller tecken på infektion, bör djuren avlivas enligt lokala riktlinjer.
2 - Behavioral testa
Även om motorn nedskrivningar kan observeras efter en vecka, är en post-lesion intervall på en månad tillåtas innan tillförlitlig kvantifiering med rotation testet. Djuret får en subkutan injektion av DA-agonist apomorfin (0,5 mg / kg), och placeras i en ogenomskinlig cylinder med 30 cm diameter, placeras 45 cm under inspelningen kameran. Det är viktigt att ta bort eventuella rester och lukter från tidigare testade djur före varje test. Efter en 5 min tillvänjning period, är rörelser som registrerats under en 5 min tidsram. Både kontraindikationer och ipsilaterala full body rotation mäts och jämförs med kontrollgruppen (fordon injiceras). Om förfarandet var korrekt utförd, kommer att kontrollera djuren uppvisar ingen rotation, medan 6-OHDA lesioned djur kommer att börja vända sig till den kontralaterala sidan, eftersom agonist främst aktiverar överkänsliga denervated striatum på lesioned sidan. Djur poäng över 7 varv (visa minst 7 hela kroppen kontralaterala varv per minut) betraktas som framgångsrikt lesioned. Djuret kan säkert tillbaka till sitt boende 30 min efter testet, vilket kan upprepas varje vecka. I våra händer, visade mindre än 5% av lesioned möss suboptimalt rotation priser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Omfattande ensidig skada av Nigro-striatala väg kan uppnås tillförlitligt i möss med en enda stereotaxic injektion av 6-OHDA i striatum. Omfattningen av lesionen kan verifieras post mortem av immunhistokemi för Tyrosin hydroxylas (som katalyserar det hastighetsbegränsande steget i syntesen av DA, dvs omvandlingen av L-tyrosin dihydroxifenylalanin), vilket illustreras i videon.
In vivo kontralateral rotationer orsakas av apomorfin är en bättre prediktor för maximal striatala lesionen än amfetamin-inducerade ipsilaterala rotation 8. Således kan funktionella konsekvenserna av lesionen skall övervakas under flera månader med ett enkelt mått av apomorfin-inducerad kontralateral rotationer.
Framgången är ca 95%. Det är betydligt högre än vad som brukar redovisas för råttor (50-70%) där omfattande dopaminerga utarmning kräver multiplar injektioner av nervgift och ökar dödligheten. Hos möss bör experimentella förhållanden vara standardiserade genom att välja djur med matchande vikt, och bara använda nygjord 6-OHDA lösning. Även andra grupper kan använda olika koncentration och / eller volymer av nervgift, har vi funnit att 2 ml av en 5 mg / ml saltlösning av 6-OHDA (innehållande 0,02% askorbinsyra för att förhindra oxidation) var den mest effektiva för maximal skada. Alternativt kan submaximalt injektioner vara användbar för att efterlikna den progressiva degeneration av dopaminerga terminaler som förekommer hos människor, speciellt hos unga och tidig debut former av PD 9.
MPTP skador kan leda till spontan återhämtning, och dessutom är känslig för kön, ålder och stam. En nyligen genomförd studie visar att detta inte är fallet för 6-OHDA lesioner hos möss, som ger massiv och långvarig minskning av den resterande DA innehåll i striatum, liksom i antalet TH positiva celler i substantia nigra i alla möss testades 10.
För närvarande, den 6-hydroxydopamine lesion modell av Parkinsons - som i stor utsträckning har använts i 40 år på råttor - kan vara tillförlitligt överföras till möss. Vi hoppas att den här filmen kommer vara till hjälp för andra grupper, och därmed minska antalet försök och djur som behövs för preklinisk forskning om nya cellulära terapier för PD 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Experiment har utförts i enlighet med internationella riktlinjer för skötsel och användning av däggdjur i neurovetenskap och Behavior Research
Acknowledgments
Med stöd av Fundação de Amparo en Pesquisa gör Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) och Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Vi är tacksamma för anonyma domare vars kommentarer hjälpt oss att förbättra både manus och video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride | König | 90-120 mg/Kg | |
| Xylazine hydrochloride | König | 10 mg/Kg | |
| Atropine Sulfate | Isofarma | Isofarma | |
| 6 – Hydroxydopamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 5 μg/μL | |
| L - Ascorbic Acid | USB Corp., Affymetrix | 0.2% | |
| Xylocaine (Lidocaine Chloridrate) | AstraZeneca | 5% 50 mg |
|
| Nebacetin (Neomycin Sulfate + Bacitracin) | Altana Pharma | 5 mg/g + 250 Ul/g | |
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg | |
| GenTeal lOphthalmic ointment Hypromellose | Novartis AG | 0.33% |
|
| Ibuprofen | Abbott Laboratories | 4 mg/ 100 ml drinking water | |
| Povidine | Johnson Diversey | ||
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg |
References
- Ungerstedt, U. 6-hydroxy-dopamine induced degeneration of central monoamine neurons. Eur. J. Pharmacol. 5, 107-110 (1968).
- Akerud, P., Canals, J. M., Snyder, E. Y., Arenas, E. Neuroprotection through delivery of glial cell line-derived neurotrophic factor by neural stem cells in a mouse model of Parkinson's Disease. J. Neurosci. 21, 8108-8118 (2001).
- Ghosh, A., Roy, A., Liu, X., Kordower, J. H., Mufson, E. J., Hartley, D. M., Ghosh, S., Mosley, R. L., Gendelman, H. E., Pahan, K. Selective inhibition of NF-kappaB activation prevents dopaminergic neuronal loss in a mouse model of Parkinson's Disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 18754-18759 (2007).
- Alvarez-Fischer, D., Henze, C., Strenzke, C., Westrich, J., Ferger, B., Höglinger, G. U., Oertel, W. H., Hartmann, A. Characterization of the striatal 6-OHDA model of Parkinson's disease in wild type and a-synuclein-deleted mice. Exp. Neurol. 210, 182-193 (2008).
- Ungerstedt, U. 6-Hydroxydopamine-induced degeneration of the nigrostriatal dopamine pathway: The turning syndrome. Pharmacology and Therapeutics Part B: General and Systematic Pharmacology. 2, 37-40 (1976).
- Guidelines for the Care and Use of Mammals in Neuroscience and Behaviour Research. , National Academies Press. Comissão de Biosegurança, CCS-UFRJ. 209 (2003).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1997).
- Hudson, J. L., Horne, C. G. van, Strömberg, I., Brock, S., Clayton, J., Masserano, J., Hoffer, B. J., Gerhardt, G. A. Correlation of apomorphine- and amphetamine-induced turning with nigrostriatal dopamine content in unilateral 6-hydroxydopamine lesioned rats. Brain Res. , 626-6167 (1993).
- Truong, L., Allbutt, H., Kassiou, M., Henderson, J. M. Developing a preclinical model of Parkinson's disease: A study of behaviour in rats with graded 6-OHDA lesions. Behav. Brain Res. 169, 1-9 (2006).
- Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson's disease. Acta Neurochir. (Wien.). 101, 89-92 (2008).
- Isacson, O. Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease. JoVE. 3, (2007).
