Summary
Parkinson hastalığı, deneysel 6-OH-dopamin tarafından tetiklenen olabilir striatum, dopaminerjik innervasyon kaybına neden olur. Biz stereotaksik lezyon gerçekleştirmek ve farelerde apomorfin bağlı dönme davranışı nasıl izleneceğini açıklar. Bu model, Parkinson hastalığı için yeni tedavilerin test etmek için faydalı ve güvenilir.
Abstract
Parkinson hastalığı (PH), cinsiyeti ne olursa olsun, dünya çapında en az 6,5 milyon insan, sosyal, etnik, ekonomik veya coğrafi sınırları etkiler. Tremor, rijidite ve bradikinesia gibi anahtar belirtileri, dopaminerjik hücrelerin yaklaşık 3 / 4 substantia nigra kaybolur geliştirmek ve striatal motor devrelerin düzgün, koordineli bir düzenleme sağlamak için başarısız. Depresyon ve halüsinasyonlar yaygındır ve demans sonunda hastaların% 20'sinde ortaya çıkar. Şu anda, PD ilerlemesini geciktirmek ya da durdurmak için herhangi bir tedavi yoktur. Aksine, bu belirtilerin azaltılmasına yönelik ilaçlar mevcut amacı daha fazla. Yeni cerrahi stratejiler derin beyin yapıları elektrik stimülasyonu ile fonksiyonel hasar devreleri üzerinde geri dönüşümlü geçiş olabilir, ancak derin beyin stimülasyonu büyük bir ilerleme olmasına rağmen, tüm hastalar için uygun değildir. Bu nedenle preklinik modellerde yeni hücre tedavisi yaklaşımları test etmek için gerekli kalır.
Dopaminerjik yolların Seçici nörotoksik bozulması, uyuşturucu ve oksidatif zararlı kimyasallar tüketen ise (1-metil-4-fenil-1 ,2,3,6-tertahydropyridine) 6-hydroxydopamine (6 OHDA) veya MPTP enjeksiyon yoluyla çoğaltılabilir kemirgenler PD özgü özellikleri de ürer. MPTP aksine, 6-OHDA lezyonlar büyük geri dönüşümsüz nöronal kaybı neden, tek veya iki taraflı olabilir. 6-OHDA lezyon modeli güvenilir, sağlam bir motor defisiti yol açar, ve en yaygın rats1 araştırma 40 yıl sonra kullanılır. Aşılı hücreleri ve ev sahibi arasındaki etkileşimleri sıçanlarda ziyade farelerde daha ayrıntılı çalışılmıştır gibi, model 2,3, son zamanlarda 4 karakterize edilmiştir farelerde aktarılmıştır.
Bu video, nasıl yavaş yavaş bir stereotaxically eklenen mikro şırınga iğnesi ile 6-OHDA 2.0 mcL sunarak lezyon anestezi farelerin sol Nigro-striatal yolu göstermektedir. Dopaminerjik girdi kaybı gün içinde oluşur ve fonksiyonel bozukluklar, dopaminerjik ajanlar 5 tarafından indüklenen derece hayvan dönmeler tarafından post-operatif haftalar ve aylar boyunca izlenebilir . Burada, apomorfin tek bir subkutan uygulamadan 10 dakika sonra meydana gelen tüm vücut kontralateral dönmeler, lezyonun sonra bir ay ölçülen göstermektedir. Çıktıları ve dezavantajları aşağıda tartışılmıştır.
Protocol
6-OHDA ve apomorfin gibi katı şeklinde saklanan tüm kimyasallar, steril enjeksiyon su ile seyreltilmiş ve kontaminasyonu önlemek için, bir laminer akış kaputu içinde filtre edildi. Buna ek olarak, nörotoksin ve nöroaktif maddeler, saklı hazırlanan, işlenen ve uluslararası kurallar 6 ve yerel Biyogüvenlik Komitesi tarafından belirlenen düzenlemelere uygun olarak bertaraf edildi.
1 - Anestezi ve cerrahi
Yetişkin erkek Swiss fareler (25-30g) vagal ton azaltmak için Atropin (0.2 mg / kg, sc) ile premedike ve sonra Ketamin (90-120 mg / Kg) ve Xylazine (10 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyonu ile anestezi . Hayvan vücut ısısı 37 ° tutulur ° C, sedasyon indüksiyonu birkaç dakika sürer sağlamak için elektronik kontrollü bir ısıtma yastığı (Insight) üzerine yerleştirilir. Anestezi düzeyi geri çekilme refleksi yokluğunda test prosedürü boyunca kontrol edilir. Anestezik dozu ve her bir suş / koloni için ajusted olmalıdır. Cerrahi hayvan ve süresine bağlı olarak, Ketamin ek doz gerekli olabilir. Bundan sonra, tuzlu su (NaCl% 0,9), kuruma kornealar korumak ve bu ilk andan göz kırpma refleks yokluğu test etmek için her iki gözü uygulanır. Tüm başının üzerinde kürk, en az bir anestezi alanları ile temas sağlamak için bir düzeltici traş. Lokal anestezi (Xylocaine) rahatsızlığı önlemek için kulak çubukları uygulanır. Geri çekilme ve göz kırpma refleksi yok, sadece bir kez anestezi seviyesini gösteren yeterince derin cerrahi (evre 3), hayvan, bu türün (Insight) için özel olarak tasarlanmış ağız parçası ve kulak çubukları kullanarak stereotaksik çerçeve üzerinde konumlandırılmış. Positionated, sonra bir göz merhemi (PA), tüm ameliyat boyunca hayvan gözleri korumak için uygulanır. Gözleri düzgün korumalı olduğundan emin sonra, prosedür sonra steril pamuklar bezlerden kullanarak, povidon iyot,% 70 Etanol üç uygulamaları tekrarlayarak cerrahi bölge cilt dezenfeksiyonu ile devam edin, kulak çubukları doğru yerleştirilmesi başın yanlara hareketleri için test tarafından sağlanmaktadır (baş çubukları sabit olmasını sağlamak için hareket gerekir). Kafatası simge ortaya kafa Uygun dorsoventral eğim daha sonra teyit edilecektir. Sagital bir kesi (1.5 cm) steril bir bisturi (# 15 bıçak) ile yapılır. Periost ilgi alanı üzerinde yeni bir bıçak ile hafifçe kazınır ve kemik, kafatası simge ortaya çıkarmak için, steril bakışları ve pamuklu temiz silinir: bregma sagital ve koronal sütür kesişme noktası olarak tanımlanır iken lambda sagital sütür kavşak ve lambdoid dikiş sağ ve sol kısımları geçerek en uygun hattı noktasıdır. Dikey hizalanmış bir referans iğne ucu ilk cerrahi mikroskop ile incelenmesi altında, bregma zeroed ve sonra lambda noktası dokunmatik olarak taşındı. Baş doğru konumda ise, lambda bregma aynı dorso-ventral düzeyde olmalı, ve her iki simge postero-kaudal ekseni boyunca 4.2 mm uzak olmalıdır. Değilse, kulakları bar ve burun parcası gevşetin olmalıdır ve baş incelikle stereotaxical önlemler için "düz kafatası" referans tanımlayan istenilen konuma ulaşmak için interaural ekseni etrafında eğik. Referans iğne ucu sonra istenilen koordinatlara konumlandırılmış ön-arka (AP 0,5 mm) ve (L -2.0 mm, sol) yan. Konumu kafatası üzerinde işaretlenmiş ve küçük (1.2 mm çapında) bir delik aralıklı eylemini kullanarak ısı alan önlemek için, steril bir matkap ucu ile açılır. Kemik parçaları, bir diş küret ile dikkatlice çıkarılır ve steril sıcak% 0.9 NaCl ile yıkanır. Sterilize 5 ul Hamilton şırınga (26s göstergesi; 0.47 mm dış çapı) 6-OHDA çözüm (ya da kontrol hayvanlar için araç) ile yüklenir ve stereotaksik aygıtı dikey hizalanmış. Iğne ucu (tip 2 veya 12 ° eğim) sonra dorso-ventral koordinat referans noktası tespitine, dokunmatik pial yüzeye kadar açılan deliğin içine eklenir. Bir kez bu koordinat oturak, iğne yavaş yavaş (: -2.0 ve DV: Aşağıdaki -3.0 mm, pial yüzey 7 L 0,5 AP) striatum koordinatlarına ulaşmak için indirilir . Hazırlanan ve laminer akış kaputu içinde filtre ve işlem boyunca alüminyum folyo ile ışıktan korunmalıdır 6-OHDA solüsyonu (0.02% askorbik asit ile 10 mikrogram 6-OHDA% 0.9 NaCl), daha sonra enjekte edilir 0.1μL/min bir akış hızı. Kontrol hayvanlar için, eşit bir araç hacmi (0.02%, askorbik asit ve steril su içinde% 0.9 NaCl) enjekte edilir. Tüm 2.0 mcL enjekte edildikten sonra, çok yavaş beyin retrakte önce, şırınga 5 dakika daha az, 5 dakika boyunca yerde tutulur. Kafatası temizlenir ve kesi, 6-0 naylon sütür (Shalon) ile kapatılır. Bir ekstra almak içinbakım, enfeksiyona karşı, neomisin gibi yerel bir antibiyotik merhem, sütüre cilde uygulanabilir. Hayvanlar su kaybını önlemek için 0.5 ml serum fizyolojik (sc.) verilen çerçeve çıkarılır ve ılık ve tam iyileşme kadar yakın gözlem altında tutulur. Daha sonra yiyecek ve su ad libitum ile muhafaza edilir. Analjezik, ameliyat sonrası ilk iki gün (5.5 ml 'lik bir ortalama günlük su tüketimi göz önüne alındığında, içme suyu şişesi ve bir önerilen doz 0.03 mg İbuprofen / g vücut ağırlığı / gün eklendi; eklemek 0,82 mg 20 ml / ml İbuprofen-Abbott süspansiyon 100 ml içme suyu). Fareler genellikle göçebe ve kolayca su gıda pelet ulaşan, prosedürden hemen kurtarabilirsiniz. Görünür rahatsızlık, herhangi bir durumda ya da herhangi bir enfeksiyon belirtisi, hayvanlar Yerel yönergelere göre ötenazi olmalıdır.
2 - Davranış testi
Motor bozukluk, bir hafta sonra görülebilir olsa da, bir ay sonrası lezyon aralığı rotasyon testi ile güvenilir kantifikasyon önce izin verilir. DA agonisti apomorfin (0.5 mg / Kg) bir subkutan enjeksiyon hayvan alır ve 30 cm çapında bir opak silindir yerleştirilir, 45 cm aşağıda kayıt kamera yerleştirdi. Her test öncesi önce test hayvanların herhangi bir kalıntı ve kokuları kaldırmak için önemlidir. 5 dakika bir alışma döneminden sonra, hareketleri, 5 dakika bir zaman dilimi üzerinde kaydedilir. Her iki kontra ve ipsilateral tam vücut dönüş ölçülür ve (araç enjekte) kontrol grubu ile karşılaştırıldı. Prosedürü doğru bir şekilde yapıldı agonist ağırlıklı Lezyonlu tarafında supersensitiv denerve striatum aktive bu yana 6-OHDA Lezyonlu hayvanlar, karşı taraf dönmeye başlayacak iken, kontrol hayvanların, herhangi bir rotasyon sergi olmayacak. 7 rpm (dakikada en az 7 tam vücut kontralateral dönmeler gösteren) üzerinden puanlama Hayvanlar başarıyla Lezyonlu olarak kabul edilir. Hayvan haftada bir tekrar edilebilir test sonra konut 30 dakika, güvenli bir şekilde iade edilebilir. Bizim ellerde, Lezyonlu farelerin% 5'inden az suboptimal dönme hızları görüntülenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nigro striatal yolun kapsamlı tek taraflı lezyon, striatum içine 6-OHDA tek bir stereotaksik enjeksiyon yoluyla farelerde güvenilir bir şekilde elde edilebilir. Lezyonun ölçüde videoda gösterildiği gibi, tirozin hidroksilaz (DA sentezi aşamasında hız sınırlama, yani dihidroksifenilalanine L-Tyrosine dönüşüm katalize) immünohistokimya ile post-mortem doğrulanmış olabilir.
In vivo olarak, apomorfin ile indüklenen kontralateral dönmeler amfetamin bağlı ipsilateral dönme 8 daha maksimal striatal lezyon daha iyi bir tahmin. Bu nedenle, lezyonun fonksiyonel sonuçlarını basit bir önlem apomorfin bağlı kontralateral dönmeler tarafından birkaç ay içinde izlenebilir.
Başarı oranı yaklaşık% 95'dir. Genellikle geniş dopaminerjik tükenmesi nörotoksin katları enjeksiyonları gerektirir ve ölüm oranı artar sıçan (% 50-70) için bildirilen olandan çok daha yüksektir. Farelerde deneysel koşullar kilo eşleşen hayvan seçerek standart ve sadece taze hazırlanmış 6-OHDA çözüm kullanarak. Diğer grupların farklı konsantrasyon ve / veya nörotoksin hacimleri olsa da, biz 6-OHDA (% 0.02 oksidasyonu önlemek için askorbik asit içeren) 5 mg / ml salin solüsyonu 2 ml maksimum lezyon için en verimli olduğunu bulduk. Alternatif olarak, submaksimal enjeksiyonları, insanlarda, özellikle PD 9 çocuk ve erken başlangıçlı formları oluşur dopaminerjik terminalleri ilerici dejenerasyon taklit etmek için yararlı olabilir .
MPTP lezyonlar spontan iyileşme kurşun, ve buna ek olarak, cinsiyet, yaş, ve zorlanma duyarlı olabilir. Son zamanlarda yapılan bir çalışma, bu durumda, striatum içinde kalan DA içeriği yoğun ve uzun süreli düşüşler getirebilimektedir farelerde 6-OHDA lezyonlar, yanı sıra tüm substantia nigra TH pozitif hücrelerin sayısı olduğunu gösterir fareler 10 test.
Şu anda, Parkinson 6-hydroxydopamine lezyon modeli yoğun sıçanlarda 40 yıldan beri kullanılmaktadır, güvenilir farelere aktarılmamıştır. Bu video, diğer gruplar için yararlı olacağını umuyoruz, ve böylece PD 11 için yeni hücresel tedaviler preklinik araştırma için gerekli deney ve hayvanların sayısını azaltmak .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Deneyler, uluslararası Nörobilim Memeliler Bakım ve Kullanım Kılavuzu ve Davranış Araştırması uygun olarak yapıldı
Acknowledgments
Fundação de Amparo tarafından desteklenen bir Pesquisa Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) ve Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Biz yorum bize el yazması ve video geliştirmemize yardımcı anonim hakemlere teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride | König | 90-120 mg/Kg | |
| Xylazine hydrochloride | König | 10 mg/Kg | |
| Atropine Sulfate | Isofarma | Isofarma | |
| 6 – Hydroxydopamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 5 μg/μL | |
| L - Ascorbic Acid | USB Corp., Affymetrix | 0.2% | |
| Xylocaine (Lidocaine Chloridrate) | AstraZeneca | 5% 50 mg |
|
| Nebacetin (Neomycin Sulfate + Bacitracin) | Altana Pharma | 5 mg/g + 250 Ul/g | |
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg | |
| GenTeal lOphthalmic ointment Hypromellose | Novartis AG | 0.33% |
|
| Ibuprofen | Abbott Laboratories | 4 mg/ 100 ml drinking water | |
| Povidine | Johnson Diversey | ||
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg |
References
- Ungerstedt, U. 6-hydroxy-dopamine induced degeneration of central monoamine neurons. Eur. J. Pharmacol. 5, 107-110 (1968).
- Akerud, P., Canals, J. M., Snyder, E. Y., Arenas, E. Neuroprotection through delivery of glial cell line-derived neurotrophic factor by neural stem cells in a mouse model of Parkinson's Disease. J. Neurosci. 21, 8108-8118 (2001).
- Ghosh, A., Roy, A., Liu, X., Kordower, J. H., Mufson, E. J., Hartley, D. M., Ghosh, S., Mosley, R. L., Gendelman, H. E., Pahan, K. Selective inhibition of NF-kappaB activation prevents dopaminergic neuronal loss in a mouse model of Parkinson's Disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 18754-18759 (2007).
- Alvarez-Fischer, D., Henze, C., Strenzke, C., Westrich, J., Ferger, B., Höglinger, G. U., Oertel, W. H., Hartmann, A. Characterization of the striatal 6-OHDA model of Parkinson's disease in wild type and a-synuclein-deleted mice. Exp. Neurol. 210, 182-193 (2008).
- Ungerstedt, U. 6-Hydroxydopamine-induced degeneration of the nigrostriatal dopamine pathway: The turning syndrome. Pharmacology and Therapeutics Part B: General and Systematic Pharmacology. 2, 37-40 (1976).
- Guidelines for the Care and Use of Mammals in Neuroscience and Behaviour Research. , National Academies Press. Comissão de Biosegurança, CCS-UFRJ. 209 (2003).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1997).
- Hudson, J. L., Horne, C. G. van, Strömberg, I., Brock, S., Clayton, J., Masserano, J., Hoffer, B. J., Gerhardt, G. A. Correlation of apomorphine- and amphetamine-induced turning with nigrostriatal dopamine content in unilateral 6-hydroxydopamine lesioned rats. Brain Res. , 626-6167 (1993).
- Truong, L., Allbutt, H., Kassiou, M., Henderson, J. M. Developing a preclinical model of Parkinson's disease: A study of behaviour in rats with graded 6-OHDA lesions. Behav. Brain Res. 169, 1-9 (2006).
- Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson's disease. Acta Neurochir. (Wien.). 101, 89-92 (2008).
- Isacson, O. Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease. JoVE. 3, (2007).
