研究有丝分裂的显微注射技术果蝇合胞体胚胎

Summary

本协议描述了利用显微注射和高分辨率成像

Abstract

本协议描述了果蝇合胞胚胎的研究有丝^分裂 1的使用 。果蝇有用的基因序列的基因组，它可以很容易地维护和操纵。许多有丝分裂突变体的存在，并且已经和正在产生荧光表达功能（如GFP）的转基因果蝇 - 标记的有丝分裂的蛋白质。有针对性的基因表达是可以使用^GAL4/UAS系统2。

果蝇的早期胚胎进行多个有丝分裂非常迅速（细胞周期的持续时间，≈10分钟）。它非常适合成像有丝分裂，因为在周期10-13，原子核分裂迅速，不干预在胚胎表面胞质在下方的皮质单单层同步。这些迅速分裂的细胞核可能使用其他细胞的有丝分裂机械，但他们对速度进行了优化;检查点一般认为不严格，允许的情况下会导致细胞周期阻滞细胞具有较强的检查站有丝分裂蛋白的研究。胚胎表达绿色荧光蛋白标记的蛋白或注射荧光标记的蛋白质，可以很容易地成像遵循生活动态（图1）。此外，显微注射胚胎可以阻断功能的特定蛋白的抗体或抑制剂， ^研究其功能3的损失或扰动的影响。这些试剂可以弥漫整个胚胎，达成许多纱锭产生抑制剂的浓度梯度，而这反过来导致在一个渐变的突变的等位基因系列相媲美的缺陷。理想的情况下，如果目标蛋白的荧光标记，抑制梯度可以直接可视化^4。据推测，最强的表型是空​​的表型相媲美，虽然这是很难正式排除这样的可能性，该抗体可能有在极少数情况下，如此严格的控制和谨慎的解释占主导地位的影响，必须应用。进一步远离注射部位，蛋白质的功能是只有部分丧失使靶蛋白的其他功能才能显现。

Protocol

食谱：

葡萄汁板：

• 5.5克细菌用琼脂
• 14.5克葡萄糖或葡萄糖
• 7.15 g蔗糖
• 45毫升葡萄浓缩汁（100％纯果汁）。
• 204.5毫升H ₂ 0
• 625μL10N氢氧化钠

沸腾混合，直到所有的成分和微波。
添加2.8毫升混合酸（酸混合：丙酸20.9毫升，2.1毫升磷酸，27毫升H ₂ 0）

混合，倒到35毫米的培养皿。让我们在室温下固化一至两天。如果板不打算很快要使用，用封口膜密封，并保持在4℃（允许在使用前平衡至RT）。

酵母膏：

约一茶匙的酵母（西格玛YSC2酵母，酿酒酵母II型）在水中溶解，形成了厚浆。将少量本上每个葡萄汁板在使用前。

G - PEM缓冲区：

• 80毫米的钠管道，pH值6.9
• 1毫米氯化镁₂
• 1 mM的EGTA
• 1 mM的GTP

注射缓冲液：

• 150毫米K -天门冬氨酸
• 10毫米的K -磷酸
• 20毫米咪唑，pH值7.2

正庚烷胶：

展开双胶带和地点，在100毫升瓶，加入约50ml庚烷，密封的瓶子，几天的岩石。使用时，加庚烷如果胶太厚。

脱水室：

以一个100毫米的培养皿中，把一个35毫米的盘内的一部分，做一个“表”和周围添加Drierite（无水硫酸钙），使Drierite高度没有超过“表”和盖高。注射前，这个“表”与胚胎盖玻片将放在脱水。这是一个好主意，使用至少表明Drierite改变它时，它已经变了颜色。

协议：

这个协议可以用于几乎所有注射到果蝇合胞胚胎可溶性试剂：例如，无论是观察荧光蛋白或靶蛋白抑制剂，或两者。

获得一切准备就绪：

1：实验前2至3天，使葡萄汁板的成立奠定笼：一个塑料瓶（6盎司，从应用科学的果蝇圆底），削减两侧的两个小孔（ ^约 1cm 2）瓶和填充用棉片（这将允许空气流动），点击进入瓶中的苍蝇和覆盖葡萄汁盘。保持在25 ° C（或室温），苍蝇应订为10天左右的胚胎。

实验前2 .-至少一天拉的注射针头，我们使用一个Kopf针/移液器拉拔模型720和薄壁玻璃细丝（世界精密仪器tw100f）。注射用荧光微管蛋白，保持针在4 ° C，以防止温度诱导聚合针。

微管蛋白的准备：

注意：所有与微管蛋白的工作应该在4 ° C，以防止聚合。

1. 采取标记的微管蛋白的冰柜，并把它冰5到15分钟。
2. 稀释缓冲的G - PEM（4至10倍所需的强度而定）。
3. 在4 ° C时10-15分钟13K RPM离心。
4. 负载1 - 2μL进针。

抗体或化学抑制剂：

准备为微管蛋白针，使用适当的浓度（这可能需要进行测试）。该抗体可在注射液，G - PEM缓冲区或PBS。如果需要另一个缓冲区，这个缓冲区将需要注射作为对照，以确保该缓冲区不会导致自身的损坏。

注：微管蛋白抑制剂和荧光灯可以混合一起注入的浓度，如果允许它。否则，注入荧光微管蛋白抑制剂注射前，等待5到10分钟。当执行一个双色注塑，开始与更多的胚胎，因为较少的胚胎将恢复正常。

胚胎收集：

1. 躺在笼中放一个新的葡萄汁板。
2. 一小时后删除这个板块，这是当天的第一个集合，往往不是很好。它可以被丢弃。
3. 更改板每隔一小时，保持收集胚胎，每次一小时。

盖玻片的准备：

1. 一个50 x22毫米盖玻片放在载玻片的一侧。磁带的四个角落的幻灯片，所以它不动。
2. 使用棉花放倒撒施，盖玻片（胶水不应该粘稠，应在几秒钟干燥，否则添加更多的庚烷）在同一行上放一个庚烷胶层。
3. 把一块双胶带走向盖玻片一侧的幻灯片。

胚胎的准备：

注：应约2小时后开始收集成像的胚胎，所以开始下面的步骤，允许足够的时间来完成这一时限内。

1. 随着蘸刷小心地拿起从幻灯片上双胶带葡萄汁板和地方的胚胎。
2. 使用镊子的外层部分，翻转双胶带胚胎绒毛膜（外膜），直到破裂。
3. 拿起轻轻地滚来滚去绒毛，所以它坚持镊子放在盖玻片盖玻片的长边平行于胚胎的长边的正庚烷胶胚胎。设置一排10至20日在胚胎。
4. 取出盖玻片，放置在3至8分钟（这取决于房间的湿度和被注入的金额）脱水室。
5. 放置在一个金属真空润滑脂室。
6. 与卤烃油700的胚胎，以避免进一步脱水。胚胎现正准备注射。

胚胎注射：

1. 寻找下一个16X目标的胚胎。
2. 将胚胎，而无需移动焦平面针。
3. 中心针，并没有在X或Y方向移动移动。
4. 如果针是不公开的，把视野盖玻片边缘，但不针会，并降低到同一焦平面针。非常小心地移动盖玻片，直到它击中针，轻轻将其打开。如果针是开放的，则转到步骤5。 （可与氢氟酸开放之前，先灌针）。
5. 鉴于胚胎（而不是针会），降低了进油针，并确保您获得很好的液体滴针。
6. 仔细不断前进进针的胚胎和胚胎注入一滴移动较远的胚胎。 （或者按照您的注射器具的指示）。
7. 所有的胚胎已经注入后，他们准备在共聚焦显微镜观察。

影像：

与60或100倍的客观的共聚焦显微镜图像的胚胎：
注：

1. 最多几秒钟的时间间隔应在时间的推移系列，因为在胚胎的有丝分裂是非常快的，根据所要研究的确切过程。
2. 可以获取一个3D系列或一个单一的平面的，取决于利益的过程中。
3. 快速作用抑制剂，注射显微镜成像显微镜要快。

图1：在果蝇合胞胚胎的有丝分裂的研究。在早期胚胎细胞核进行无胞质快速分裂，在周期10至13核的形式在皮层单层。 一个 。早期胚胎在皮层细胞核示意图。胚胎可以表达GFP和/或RFP标记的蛋白，可与其他标记的蛋白和/或抑制剂显微注射。B.时间周期11表达的GFP -微管蛋白和RFP组蛋白。C.绘制极极分离胚胎失效成像在野生型胚胎的12和13。主轴长度展品等长的长度和伸长的时期，这是非常一致的和可重复性时期 。D.纺锤体微管的动态。注射罗丹明微管蛋白的低浓度，导致少数微管蛋白亚基，可用于研究微管动力学形成斑点。

Discussion

此协议相对简单，但是，每一步都需要练习，以确保胚胎不被损坏。总是需要做的工作，以确保获得可靠的结果，正在认真对照实验。通过显微注射到缓冲区或若丹明微管蛋白表达GFP -微管蛋白的控制，以确保有丝分裂的收益，通过所有周期通常在胚胎表面（周期10至13）的胚胎开始，这是一个好办法。在控制胚胎，你不应该观察主轴之间的任何物理连接，这往往是导致过多脱水，所以较低的脱水时间。当胚胎被破坏，核辐射是经常观察，自由的中心体或细胞核或锭不均匀间距损害的指标。极极距地块重现性好，是一个非常可靠的“成功”的措施，在控制胚胎，他们看起来应该像图1所示的。

我们已经用这个协议研究主轴装配，维修和断裂伸长率，使用单克隆，肽或多克隆抗体，针对蛋白质^的利益1,5,6,7,8,9,10,11,12,13提出的许多方面。特定的蛋白抑制剂或影响蛋白质利益的其他化学品也可以被显微注射和观察其影响，并定量测定。为了评估一个特定的抑制剂的效果，我们比较后抑制，以控制胚胎中观察到的主轴长度。我们也可以通过使用荧光显微镜¹⁴散斑注射后低浓度的荧光微管蛋白（图1d），看看在微管蛋白的动态。

我们一般收取一小时，并让一个小时前，观察胚胎成熟，这意味着胚胎观察时是1至2小时岁。如果苍蝇铺设以及许多胚胎是在一小时内收集，然后收集时间可能缩短，以便获得更多的同步分裂的胚胎。如果抑制的时间是至关重要的或感兴趣的研究，抑制剂可注入下共聚焦观察。这是很难的，但它仍然是可能的的。