Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השימוש microinjection הדמיה ברזולוציה גבוהה של

Abstract

פרוטוקול זה מתאר את השימוש של העובר תסיסנית melanogaster סינסיציאלי ללימוד מיטוזה ^1. תסיסנית יש גנטיקה שימושי עם רצף הגנום, וזה יכול להישמר בקלות מניפולציות. מוטנטים mitotic רבים קיימים, וזבובים מהונדס המבטא פונקציונלי fluorescently (GFP למשל) - חלבונים mitotic מתויג כבר והם שנוצר. ביטוי גנים ממוקד אפשרי באמצעות מערכת GAL4/UAS ^2.

העובר תסיסנית מוקדם מבצעת mitoses מרובים במהירות רבה (משך מחזור התא, ≈ 10 דקות). זה גם מתאים הדמיה מיטוזה, כי במהלך מחזורי 10-13, גרעינים לחלק במהירות סינכרוני בלי להתערב cytokinesis על פני השטח של העובר בשכבה יחידה רק מתחת לקליפת המוח. גרעינים אלה במהירות לחלק מן הסתם להשתמש במכונות mitotic כמו תאים אחרים, אבל הם אופטימיזציה עבור מהירות, המחסום הוא האמין בדרך כלל לא להיות מחמירים, המאפשרים לימוד של חלבונים mitotic שחסרונו יגרום מחזור התא בתאי מעצר עם מחסום חזק . עוברים לבטא חלבונים GFP שכותרתו או microinjected עם חלבונים שכותרתו fluorescently ניתן הדמיה בקלות לעקוב אחר הדינמיקה חיים (איור 1). בנוסף, עוברים ניתן microinjected עם פונקציית חסימת נוגדנים או מעכבי חלבונים ספציפיים כדי לחקור את ההשפעה של אובדן או ההפרעות בתפקוד שלהם ^3. ריאגנטים אלה יכולים לפזר לאורך העובר, והגיע spindles רבים לייצר שיפוע של ריכוז מעכב, אשר בתוצאות פונים שיפוע של ליקויים דומים סדרה allelic של מוטציות. באופן אידיאלי, אם חלבון המטרה היא שכותרתו fluorescently, שיפוע של עיכוב ניתן דמיינו ישירות ^4. ההנחה היא כי הפנוטיפ החזקים ניתן להשוות פנוטיפ ריק, אם כי קשה רשמית לשלול את האפשרות כי הנוגדנים יש תופעות הדומיננטי במקרים נדירים, בקרות מחמירות כל כך פרשנות זהירה חייב להיות מיושם. הרחק הזריקה, תפקוד החלבון הוא רק איבד חלקית ומאפשר פונקציות אחרות של חלבון המטרה להיות ברור.

Protocol

מתכונים:

מיץ ענבים צלחות:

• 5.5g אגר bacto
• 14.5 גרם גלוקוז או דקסטרוז
• 7.15 גרם סוכרוז
• 45 מ"ל מיץ ענבים להתרכז (100% מיץ).
• 204.5 מ"ל H ₂ 0
• 625 μl 10N NaOH

מערבבים את כל החומרים, מיקרוגל עד רתיחה.
הוסף 2.8 מ"ל חומצה תערובת (תערובת חומצות: חומצה 20.9 מ"ל propionic, 2.1 חומצה זרחתית מ"ל, 27 מ"ל H ₂ 0)

מערבבים ויוצקים על 35 מ"מ צלחות פטרי. בואו לחזק בטמפרטורת החדר למשך יום או יומיים. אם צלחות לא הולכים לשמש בקרוב, חותם עם parafilm ולשמור על 4 ° C (כדי לאפשר לאזן RT לפני השימוש).

שמרים להדביק:

ממיסים על כפית אחת של שמרים (Sigma YSC2, שמרים מ Saccharomyces cerevisiae סוג II) במים ליצירת עיסה סמיכה. מניחים כמות קטנה של זה על כל צלחת מיץ ענבים רק לפני השימוש.

G-PEM חיץ:

• 80 mM Na-צינורות, pH 6.9
• 1 mM MgCl ₂
• 1 mM EGTA
• 1 mM GTP

הזרקת חיץ:

• 150 מ"מ K-Aspartate
• 10 mM K-פוספט
• 20 מ"מ imidazole, pH 7.2

Heptane דבק:

לגולל סרט דביק כפול מקום בבקבוק 100 מ"ל, 50 מ"ל להוסיף על heptane, החותם את הבקבוק, סלע במשך כמה ימים. בעת השימוש, להוסיף heptane אם הדבק סמיך מדי.

התייבשות קאמרית:

קח צלחת פטרי 100 מ"מ, לשים חלק אחד של צלחת 35 מ"מ בתוך לעשות "שולחן" ולהוסיף Drierite (סידן גופרתי anhydrous) סביבו, כך גובה Drierite אינו גבוה יותר מאשר "שולחן" ואת כיסוי. Coverslip עם עוברי יושם על "שולחן" זה התייבשות לפני הזריקה. זה רעיון טוב להשתמש לפחות חלק Drierite המציין ולשנות כשזה השתנה צבע.

פרוטוקול:

פרוטוקול זה יכול לשמש הזרקת מגיב כמעט כל מסיס לתוך העובר תסיסנית סינסיציאלי: לדוגמה, או חלבון פלואורסצנטי להסתכלות או מעכב חלבון מטרה או שניהם.

התחלת הכל מוכן:

1 .- 2 עד 3 ימים לפני הניסוי, לעשות צלחות מיץ ענבים ולהקים להניח בכלוב: קחו בקבוק פלסטיק (6 גר ', תחתית עגולה מ יישומית מדעי תסיסנית), לחתוך שני חורים קטנים (כ 1cm ²⁾ משני צדי המתרס של בקבוק ולמלא עם פיסת צמר גפן (זה יאפשר זרימת אוויר), הקש על זבובים לתוך הבקבוק ומכסים עם צלחת מיץ ענבים. שמור על 25 ° C (או בטמפרטורת החדר), זבובים צריך להניח עוברים כ 10 ימים.

2 .- לפחות יום אחד לפני הניסוי למשוך מחטים להזרקה, אנו משתמשים מחט Kopf / פיפטה מודל חולץ 720 דק סיבי זכוכית חומה (World Precision מכשירים tw100f). עבור זריקה של טובולין ניאון, לשמור מחטים ב 4 ° C כדי למנוע הטמפרטורה הנגרמת פילמור את המחט.

טובולין הכנה:

הערה: כל לעבוד עם טובולין צריך להיעשות על 4 ° C כדי למנוע פילמור.

1. קח טובולין שכותרתו מהמקפיא והניח אותו על קרח למשך 5 עד 15 דקות.
2. מדולל עם G-PEM חיץ (4 עד 10 לקפל תלוי בעוצמת חובה).
3. צנטריפוגה בסל"ד 13k ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10-15 דקות.
4. טען 1-2 μl לתוך מחט.

נוגדן או מעכב כימי:

הכן מחטים כמו טובולין, באמצעות ריכוז המתאים (זה ייתכן שיהיה צורך לבדוק). הנוגדן יכול להיות חיץ הזרקה, G-PEM חיץ או PBS. אם עוד חיץ נדרשת, המאגר הזה יצטרך להיות מוזרק כביקורת על מנת לוודא חיץ זה לא גורם נזק משלה.

הערה: מעכבי טובולין ו ניאון יכול להיות מעורב והזריקו יחד אם ריכוזי מאפשרים זאת. אחרת, להזריק את טובולין פלורסנט לחכות 5 עד 10 דקות לפני הזרקת מעכבי. בעת ביצוע הזרקה כפולה, להתחיל עם עוברי יותר, שכן עוברים פחות יתאושש כרגיל.

העובר באוסף:

1. שים מיץ ענבים חדש על צלחת הכלוב מונח.
2. הסר את צלחת אחרי שעה אחת, זהו האוסף הראשון של היום, ולעתים קרובות הוא לא כל כך טוב. זה יכול להיות מושלך.
3. שנה את הצלחת בכל שעה כדי לשמור על עוברי איסוף במשך שעה אחת.

Coverslip הכנה:

1. שים 50 x 22mm coverslip בצד אחד של המיקרוסקופ שקופית. Tape בארבע פינות לשקופית, כך שהוא לא זז.
2. שימוש כותנה היטה המוליך, לשים שכבה אחת של דבק heptane בשורה אחת על coverslip (דבק לא צריך להיות צמיגה ויש יבש כמה שניות, אחרת להוסיף heptane יותר).
3. שים חתיכתכפול סרט דביק בשקופית לעבר הצד של coverslip.

העובר הכנה:

הערה: עוברים צריך להיות צילמו כ 2 שעות לאחר תחילתו של האוסף, כך להתחיל את הצעדים הבאים לאפשר מספיק זמן כדי לסיים אותם בתוך מסגרת זמן זו.

1. עם מכחול לח בזהירות להרים את העוברים מהצלחת מיץ הענבים ומניחים על נייר דבק כפול בשקופית.
2. שימוש בחלק החיצוני של פינצטה, לגלגל את העוברים על הקלטת דביק כפול עד סיסית (הקרום החיצונית) שובר פתוח.
3. תרימי את העובר על ידי בעדינות מגלגלים אותו על סיסית כך שהוא נדבק פינצטה ולמקם אותו על הדבק heptane על coverslip עם הצד הארוך מקביל העובר לצד ארוכה של coverslip. הגדרת 10-20 עוברים בשורה אחת.
4. הסר את coverslip ולמקם אותו בחדר התייבשות במשך 3 עד 8 דקות (זה תלוי לחות החדר ואת הסכום להיות מוזרק).
5. מניחים על חדר מתכת עם גריז ואקום.
6. מכסים את העוברים עם 700 שמן halocarbon כדי למנוע התייבשות נוספת. עוברים כעת מוכן להזרקה.

העובר הזרקה:

1. מצא את העוברים תחת מטרה 16x.
2. העברת עוברים הלאה, למצוא את המחט מבלי להזיז את מישור המוקד.
3. מרכז את המחט ולהעביר אותה מבלי להזיז אותה בכיוון x או y.
4. אם המחט אינה פתוחה, לשים את הקצה של coverslip בתחום של נוף, אבל לא איפה המחט תהיה, ולהפחית את המחט למישור מוקד זהה. בזהירות רבה להעביר את coverslip עד שהוא מגיע המחט בעדינות שובר אותו פתוח. אם המחט פתוחה, עבור לשלב 5. (מחטים ניתן לפתוח עם חומצה הידרופלואורית לפני מילוי).
5. שים את העוברים בתצוגה (אבל לא איפה המחט יהיה), להוריד את המחט לתוך השמן וודא שאתה להשיג טיפות נוזל נחמד המחט.
6. בזהירות אבל בהתמדה להזיז את העובר לתוך המחט ולהזריק ירידה לתוך העובר ולעבור את העובר משם. (או בצע את ההוראות של מכשיר הזרקה שלך).
7. אחרי כל העוברים היו מזריקים, הם מוכנים לצורך השגחה על מיקרוסקופ confocal.

דימות:

תמונה העוברים על מיקרוסקופ confocal במטרה 60 או 100x:
הערות:

1. מרווח הזמן על סדרת זמן לשגות צריך להיות שניות ספורות ביותר, מאז מיטוזה בעובר הוא מהיר מאוד, בהתאם לתהליך המדויק כדי להיחקר.
2. סדרת 3D או מטוס אחד ניתן לרכוש בהתאם בתהליך של עניין.
3. עבור מהיר משחק מעכבי, העברת מ מיקרוסקופ הזרקה אל מיקרוסקופ הדמיה חייב להיות מהיר.

איור 1: לימוד מיטוזה בעובר תסיסנית סינסיציאלי. גרעינים בעובר מוקדם לעבור חטיבות מהיר ללא cytokinesis, במהלך 10 מחזורים באמצעות טופס 13 גרעינים monolayer על קליפת.. סכמטי של העובר המוקדם עם גרעינים על קליפת המוח. העובר יכול לבטא את ה-GFP ו / או RFP חלבונים שכותרתו וניתן microinjected עם חלבונים שכותרתו אחרים ו / או מעכבי. פקיעה ב זמן הדמיה של העובר מביע GFP-טובולין ו-RFP היסטון. מגרש ג ההפרדה מוט מוט במשך 11 מחזורים , 12 ו -13 בעובר סוג בר. אורך ציר מפגין תקופות של אורך איזומטרי ותקופות של התארכות, אשר עולות בקנה אחד מאוד לשחזור. Dynamics ד microtubules ציר. הזרקה של ריכוז נמוך של טובולין rhodamine מוביל speckles יצרו של טובולין כמה יחידות משנה, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ללמוד הדינמיקה microtubule.

Discussion

פרוטוקול זה היא פשוטה יחסית, עם זאת, כל צעד דורשת תרגול כדי לוודא את העוברים שאינם פגומים. ניסויים בקרה קפדנית תמיד צריך להיעשות כדי להבטיח תוצאות אמינות עוברים שהושגו. דרך טובה להתחיל זאת היא על ידי microinjecting טובולין חיץ או rhodamine לעוברי לשלוט בהבעת GFP-טובולין לוודא כי מיטוזה התמורה בדרך כלל דרך מחזורי כל העובר על פני השטח (מחזורים 10 עד 13). בשנת עוברים בקרת אתה לא צריך לצפות כל חיבורים פיזיים בין spindles אשר לעתים תוצאה של התייבשות יותר מדי, כך נמוך יותר זמן התייבשות. כאשר עוברים פגומים, הנשורת הגרעינית הוא נצפה לעיתים קרובות, centrosomes חינם או ריווח אחיד של גרעיני או spindles המעידים על נזק. מגרשים של המרחק מוט מוט ולייצר מאוד והם אמצעי אמין מאוד של "הצלחה", בעוברים לשלוט הם צריכים להיראות כמו שמוצג באיור 1.

השתמשנו בפרוטוקול זה ללמוד היבטים רבים של הרכבה תחזוקה, ציר ואת התארכות שימוש חד שבטיים, נוגדנים פפטיד או polyclonal העלה נגד החלבון של עניין ^{1,5,6,7,8,9,10,11,12,13.} מעכבי חלבון מסוים או כימיקלים אחרים המשפיעים על חלבון של עניין ניתן גם microinjected והשפעתם נצפו ונמדדו כמותית. כדי להעריך את ההשפעה של מעכבי מסוים, אנו משווים את אורך ציר לאחר עיכוב לזה שנצפה עוברים שליטה. אנחנו יכולים גם להסתכל על הדינמיקה טובולין באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב ¹⁴ לאחר microinjection של ריכוז נמוך של טובולין ניאון (איור 1d).

בדרך כלל אנחנו אוספים במשך שעה אחת ולתת עוברים בוגרת במשך שעה אחת לפני יותר תצפית, פירוש הדבר כי הם עוברים בין 1 ל 2 שעות הישן, כאשר ציין. אם הזבובים מניחים היטב עוברים רבים נאספים בשעה אחת, אז בפעם אוסף עשוי להתקצר כך עוברים סינכרוני, חלוקת יותר מתקבלים. אם העיתוי של עיכוב הוא קריטי או עניין במחקר, מעכב ניתן להזריק תחת השגחה confocal. זה קשה, אבל זה אפשרי בכל זאת.