に有糸分裂研究のためのマイクロインジェクション技術キイロショウジョウバエ合胞体胚

Summary

このプロトコルは、マイクロインジェクションとで高解像度の画像の使用について説明

Abstract

このプロトコルは、有糸分裂^1を研究するためのキイロショウジョウバエ合胞体胚の使用について説明します。 ショウジョウバエは 、シーケンスされたゲノムを持つ有用な遺伝学があり、そしてそれは容易に維持して操作することができます。多くの有糸分裂変異体が存在し、（例えばGFP）蛍光機能を発現するトランスジェニックハエ - タグ分裂タンパク質がされていると生成されています。標的遺伝子の発現は、GAL4/UASシステム^2を使って可能です。

ショウジョウバエ初期胚では、（細胞周期の期間、≈10分）非常に迅速に複数の分裂像を実施。サイクル10から13の間に、核がちょうど皮質下に単分子層で胚の表面に細胞質分裂を介在することなく、迅速にかつ同期的に分割するので、これはよく、画像有糸分裂に適しています。これらの急速に分裂する核は、おそらく他の細胞と同じ有糸分裂機構を使用しますが、それらは高速化のために最適化され、チェックポイントは、一般的に不在の強いチェックポイントを有する細胞の細胞周期停止を引き起こす細胞分裂タンパク質の研究を可能にする、厳格ではないと考えられている。またはGFP標識タンパク質を発現している胚は蛍光標識したタンパク質をマイクロインジェクションは、簡単にライブダイナミクス（図1）に従うために撮像することができます。さらに、胚は、その機能³の喪失または摂動の効果を研究するために特定のタンパク質の機能阻害抗体や阻害剤をマイクロインジェクションすることができます。これらの試薬は、その変異体の対立遺伝子のシリーズに匹敵する欠陥の勾配でターン結果の阻害剤の濃度の勾配を、生成するために多くのスピンドルに達し、胚全体に拡散することができます。理想的には、標的タンパク質を蛍光標識されている場合、阻害の勾配は^、4を直接可視化することができる。それは正式に抗体を適用する必要があるまれなので、厳格なコントロールと慎重な解釈で支配的な影響を与えることがあるという可能性を排除するのは難しいですが、それは、最強の表現型がnull表現型と同程度であることを前提としています。遠くに注射部位から、タンパク質の機能は部分的にしか標的タンパク質の他の機能が明らかになることを可能にすることが失われている。

Protocol

レシピ：

グレープジュースプレート：

• 5.5グラムバクト寒天
• 14.5グラムブドウ糖またはブドウ糖
• 7.15グラムのショ糖
• 45ミリリットルのグレープジュース濃縮物（100％ジュース）。
• 204.5ミリリットルH ₂ 0
• 625μlの10N NaOHを

沸騰するまで、すべての材料と電子レンジを混ぜる。
2.8ミリリットルの酸ミックス（：20.9ミリリットルプロピオン酸、2.1 mlのリン酸、27ミリリットルH ₂ 0酸の混合）を追加します。

ミックスおよび35 mmシャーレに注ぐ。 1つまたは2つ日間室温で固化してみましょう。プレートは、すぐに使用されようとしてパラフィルムでシールし、4℃で（使用する前に、RTに平衡を許可）維持されていない場合。

酵母ペースト：

濃厚なペーストを形成するために水に酵母の茶さじ1杯（シグマYSC2、サッカロマイセスセレビシエII型から酵母）について溶解する。使用直前にそれぞれのグレープジュースのプレートでこの少量のを置きます。

G - PEMバッファー：

• 80mMのナトリウムPIPES、pHは6.9
• 1mMのMgCl ₂
• 1mMのEGTA
• 1mMのGTP

インジェクションバッファー：

• 150mMのK -アスパラギン酸
• の10mM K -リン酸
• 20 mMイミダゾール、pH 7.2の

ヘプタンの接着剤：

数日間50ミリリットル程度ヘプタン、ボトルを密封し、岩を追加し、100ミリリットル瓶でダブル粘着テープと場所を引き出します。接着剤が厚すぎる場合使用する場合は、ヘプタン追加。

脱水チャンバー：

"テーブル"を作成し、DRIERITEの高さは、"表"とカバーより大きくしないようにその周りにDRIERITEを（無水硫酸カルシウム）を追加するために内部の35mm皿の一部を入れて100mmのペトリ皿を取る。胚とカバースリップは注射の前に脱水のためにこの"テーブル"に配置されます。それは、少なくともいくつかを示すDRIERITEを使用して、色を変更されたときにそれを変更することをお勧めします。

プロトコル：

例えば、どちらの観測や標的タンパク質の阻害剤またはその両方のための蛍光タンパク質：このプロトコルは、ショウジョウバエ多核体胚に実質的にあらゆる水溶性試薬の注入に使用することができます。

すべてが準備中：

1 .-実験の前に2〜3日、グレープジュースのプレートを作成し、設定するケージレイ：の反対側に二つの小さな穴を^（2約1cm）カット、ペットボトル（6オンス、応用科学ショウジョウバエから丸底）に乗りボトルと綿の部分（これは空気が流れを許可する）で埋めるには、瓶にハエをタップし、グレープジュースのプレートでカバーしています。 25℃に保つ° C（または室温）、ハエは約10日間胚を置く必要があります。

実験は、注射用の針を引っ張る2 .-少なくとも1日の前に、我々はKopfはニードル/ピペットプラーモデル720と薄肉ガラスフィラメント（世界精密機器tw100f）を使用します。蛍光チューブリンの注入の場合は、℃の針で温度による重合を防ぐために4時に針を保つ。

チューブリンの準備：

注：チューブリンとのすべての仕事が4時に行われるべき° Cで重合を防止する。

1. 冷凍庫のラベルが付いたチューブを取り出し、5〜15分間氷上に置きます。
2. G - PEMのバッファ（必要な強度に応じて4〜10倍）で希釈する。
3. 4で13K rpmで遠心10〜15分間。
4. 負荷1 - 針に2μlの。

抗体または化学的阻害剤：

適切な濃度（これはテストする必要があります）を使用して、チューブリンと同様に針を準備します。抗体は、注射のバッファ、G - PEMバッファーまたはPBSにすることができます。別のバッファが必要な場合は、このバッファは、このバッファには独自の上に損傷が生じないことを確認するコントロールとして注入する必要があります。

注：濃度で許可されている場合に阻害し、蛍光チューブリンを混合し、一緒に注入することができる。そうでなければ、蛍光チューブリンを注入し、阻害剤を注入する前に、5〜10分待ちます。少ない胚が正常な状態に復元するので、二重注入を行うときは、、より多くの胚で始まります。

胚の収集：

1. 素人のケージに新しいブドウジュースのプレートを置く。
2. 一時間後にこのプレートを外し、この日の最初のコレクションであり、しばしば非常に良いではありません。それは破棄することができます。
3. 一時間ごとに収集する胚を保つためにプレートを毎時を変更します。

カバースリップの準備：

1. 顕微鏡のスライドの片側に50 × 22ミリメートルカバースリップを置く。スライドへのテープの四隅には移動しないように。
2. 綿を使用すると、アプリケーターをひっくり返した（接着剤は粘性すべきではないと数秒で乾燥させてください、そうでない場合よりヘプタン追加）カバースリップ上で1つの行にヘプタン接着剤の一つの層を置く。
3. の部分を入れてカバースリップの側に向かってスライド上に粘着テープを倍増。

胚の準備：

注：胚の収集の開始後約2時間イメージ化されるはずなので、この時間枠内でそれらを完了するのに十分な時間を許可するには、次の手順を開始する。

1. 湿らせたブラシで慎重にスライドをダブル粘着テープでグレープジュースのプレートと場所から胚を拾う。
2. 絨毛膜（外膜）が開いて解除するまでピンセットの外側の部分を使用して、ダブル粘着テープを介して胚をロールバックします。
3. それはピンセットに付着し、カバースリップの長辺に胚の平行の長い側をカバースリップ上にヘプタンのりの上に置くように静かに絨毛膜の上に圧延して胚を拾う。つの行で10〜20の胚を設定します。
4. カバーを取り外して、3〜8分（これは部屋の湿度に依存し、量を注入する）のための脱水槽に入れてください。
5. 真空グリースで、金属チャンバーの上に置きます。
6. さらに脱水症状を避けるためにハロカーボンのオイル700の胚をカバーしています。胚はインジェクションのための準備が整いました。

胚の注入：

1. 16倍の目標の下で胚を見つける。
2. 離れて胚を移動し、焦点面を移動せずに針を見つける。
3. センター針と、xまたはyの方向に移動することなく、それを上に移動。
4. ニードルが開いていない場合、ビューのフィールドのカバースリップの端を置くが、針がなるではない場所、および同じ焦点面に針を下ろします。それが針に当たると軽く開いて、それを解除するまで、非常に慎重にカバースリップを移動する。ニードルが開いている場合は、手順5に進みます。 （針を充填する前にフッ化水素酸で開くことができます）。
5. ビュー（ただし、針がなる）に胚を入れ、油に針を下げるし、針から素敵な液滴を得ることを確認してください。
6. 慎重にしかし着実に、針に胚を移動し、胚にドロップを注入し、離れて胚を移動する。 （またはあなたの射出装置の指示に従ってください）​​。
7. すべての胚が注入された後、彼らは共焦点顕微鏡で観察するための準備が整いました。

イメージング：

画像60または100倍を目的とした共焦点顕微鏡で胚を。
注意事項：

1. 胚の細胞分裂が非常に高速であるため、時間経過のシリーズでの時間間隔についても研究する正確なプロセスに応じて、最大で数秒にする必要があります。
2. 3Dシリーズまたは単一平面は、関心のプロセスに応じて取得することができます。
3. 速効性阻害剤の場合は、注入の顕微鏡から、イメージング顕微鏡への転送が高速である必要があります。

図1： ショウジョウバエ多核体胚の細胞分裂の研究。初期胚の核は、サイクル10 13を介して核の形の間に、細胞質分裂せずに皮質における単分子層を急速に分裂を受ける。。皮質での核と初期胚の概略図。胚では標識タンパク質GFPおよび/ ​​またはRFPを発現することができるし、他の標識タンパク質および/ ​​または阻害剤をマイクロインジェクションすることができます。サイクル11のGFP -チューブリンとポール-ポールの分離のRFP -ヒストン。C.プロットを表現する胚のB.のタイムラプスイメージング、野生型の胚で12と13。スピンドルの長さは非常に一貫性と再現性がアイソメトリック長さと伸びの期間の期間を、示す。スピンドル微小管のD.ダイナミクス。ローダミンのチューブリンの低濃度の注入は、微小管のダイナミクスを研究するために使用できるいくつかのチューブリンのサブユニットから形成された斑点につながります。

Discussion

このプロトコルは比較的簡単です、しかし、各ステップでは、胚が損傷していないことを確認する練習が必要です。慎重な対照実験は常に信頼性の高い結果が得られていることを保証するために行われる必要があります。この設定を開始する一つの良い方法は、有糸分裂が胚の表面（サイクル10から13）ですべてのサイクルを通じて正常に進行することを確認するためにGFP -チューブリンの発現制御の胚にバッファまたはローダミンチューブをマイクロインジェクションすることです。コントロール胚では、しばしばあまりにも脱水の結果であるスピンドルの間の任意の物理的な接続を観察しないはずなので、脱水時間を下げる。胚が損傷を受けたときは、死の灰がしばしば観察され、自由な中心体や核やスピンドルの不均一な間隔は、損傷の指標である。極 - 極の距離のプロットは非常に再現性があり、"成功"の非常に信頼性の尺度であり、コントロールの胚では図1に示されているもののようになります。

我々は、スピンドルアセンブリ、メンテナンスや関心^{1,5,6,7,8,9,10,11,12,13}のタンパク質に対して惹起モノクローナル、ペプチドまたはポリクローナル抗体を用いて伸長の多くの側面を研究するためにこのプロトコルを使用している。目的のタンパク質に影響を与える特定のタンパク質の阻害剤または他の化学物質はまた、マイクロインジェクションし、その影響は観察と定量的に測定することができます。特定の阻害剤の効果を評価するために、我々は、コントロール胚で観察に阻害した後、スピンドルの長さを比較する。我々はまた、蛍光灯は、蛍光チューブリンの低濃度（図1d）のマイクロインジェクションした後、顕微鏡^14をスペック使用してチューブリンのダイナミクスを見ることができます。

我々は一般的に一時間のために収集し、観察の前にさらに1時間のために胚を成熟させ、これは観察すると胚は、1〜2時間経過していることを意味します。ハエがよく敷設されており、多くの胚を1時間に収集されている場合は、収集時間は、より多くの同期分裂胚が得られるように短縮することができる。阻害のタイミングは、研究への関心の重要またはである場合は、阻害剤は、共焦点観察下に注入することができる。これは難しいですが、それにもかかわらず可能です。