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Biology

의 유사 분열 유학을위한 Microinjection 기법 Drosophila melanogaster Syncytial 엠브료

Published: September 15, 2009 doi: 10.3791/1382
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California, Davis

Summary

이 프로토콜은에 microinjection과 고해상도 이미지의 사용에 대해 설명합니다

Abstract

이 프로토콜은 유사 분열 1 공부에 대한 Drosophila melanogaster syncytial 배아의 사용을 설명합니다. Drosophila는 합성의 게놈과 유용한 유전자를 가지고 있으며, 쉽게 유지하고 조작하실 수 있습니다. 많은 mitotic의 돌연변이가 존재하고, (예 : GFP) 찬란 기능적 표현 형질 파리 - 태그 mitotic 단백질이되었으며 생성되고 있습니다. 타겟 유전자 발현은 GAL4/UAS 시스템 2를 사용 가능합니다.

Drosophila 초기 배아는 (세포주기 기간, ≈ 10 분) 매우 빠르게 여러 mitoses를 수행합니다. 사이클 10-13 동안 핵 막 피질 아래 단일 monolayer의 배 (胚)의 표면에 cytokinesis을 개입하지 않고 빠르게 분열과 동기 때문에 잘, 영상 유사 분열에 적합합니다. 이러한 급속하게 나누어 핵은 아마도 다른 세포와 같은 mitotic 기계를 사용하지만, 그들은 속도에 최적화된되며 검사점 일반적으로 그의 부재 강한 검문소와 세포 세포주기 체포를 일으킬 것입니다 mitotic 단백질의 연구를 수 있도록 엄격한되지하는 생각입니다 . 또는 GFP 표시된 단백질을 표현 배아는 찬란 표시된 단백질과 microinjected 쉽게 라이브 역학 (그림 1)에 따라 몇 군데 있습니다. 또한, 배아들은 기능 3의 손실 또는 섭동의 효과를 연구하기 위해 특정 단백질의 기능을 차단 항체 또는 억제제와 microinjected 수 있습니다. 이 시약은 억제제의 농도의 그라데이션, 돌연변이의 allelic 시리즈에 비해 결함의 기울기에 차례 결과 인치를 생산하기 위해 많은 스핀들에 도달, 배 (胚)에 걸쳐 확산 수 있습니다 이상적으로, 대상 단백질이 찬란 표시된 경우 억제의 기울기는 4 직접 시각하실 수 있습니다. 그것이 공식적으로 항체가 적용되어야합니다 드물 때문에 엄격한 컨트롤 및주의 해석에 지배적인 영향을 수있는 가능성을 제외하기 힘들지만 그것은 가장 강한 표현형가 NULL 표현형 비교는 것을 가정합니다. 멀리 사출 사이트에서, 단백질의 기능은 부분적으로 타겟 단백질의 다른 기능은 분명이 될 수 있도록 손실됩니다.

Protocol

요리법 :

포도 주스 플레이트 :

  • 5.5g bacto 한천
  • 14.5 g 덱스 트로 오스 또는 포도당
  • 7.15 g의 자당
  • 45 ML의 포도 주스 농축물 (100 % 주스).
  • 204.5 ML H 2 0
  • 625 μl 10N NaOH

끓는까지 모든 재료와 전자 레인지를 섞는다.
2.8 ML의 산성 믹스 (20.9 ML 프로피 온산, 2.1 ML의 인산 27 ML H 2 0 산성 믹스) 추가

믹스와 35mm 페트리 요리에 부어. 한 이틀 동안 실온에서 고체화 보자. 접시가 곧 사용할 수 않을 경우, 4 parafilm과 인감 유지 ° C (사용하기 전에 RT로 평형 수 있습니다.)

효모 붙여넣기 :

두꺼운 붙여넣기를 형성 효모 중 한 티스푼 (시그마 YSC2, Saccharomyces cerevisiae 유형 II에서 효모) 물에 대한 용해. 사용하기 직전 각 포도 주스 판에이의 작은 금액을 넣으십시오.

G - PEM 버퍼 :

  • 80 MM 나 - 파이프, 산도 6.9
  • 1 ㎜ MgCl 2
  • 1 ㎜ EGTA
  • 1 ㎜ GTP

사출 버퍼 :

  • 150 MM K - Aspartate
  • 10 MM K - 인산
  • 20 MM 이미다졸, 산도 7.2

헵탄 접착제 :

100ml 병 두 번 끈적끈적한 테이프 및 장소를 풀다, 50ml 헵탄에 대한 추가 며칠 동안 병, 그리고 바위 인감. 접착제가 너​​무 두꺼운 경우 사용하는 경우, 헵탄 추가할 수 있습니다.

탈수 챔버 :

, 100mm 페트리 접시를 타고 "표"를 만들기 위해 35mm 요리 내부의 한 부분을 넣고 Drierite의 높이가 "테이블"및 커버보다 높은 어떤 있도록 주위 Drierite을 (무수 황산 칼슘) 추가하지 않습니다. 배아와 coverslip은 사출하기 전에 탈수이 "테이블"에 배치됩니다. 그것은 적어도 몇 나타내는 Drierite를 사용하고 색상을 변경했을 때 그것을 변경하는 것이 좋습니다.

프로토콜 :

이 프로토콜은 Drosophila syncytial 배아에 거의 모든 용해 시약의 주입에 사용할 수 있습니다 : 예를 들어, 형광 관찰이나 대상 단백질 억제제 단백질 또는 둘 다.

모든 준비하기 :

, 플라스틱 병 (6온스, 응용 과학 Drosophila에서 라운드 바텀)를 타고 반대편에 두 개의 작은 구멍을 (2 1cm 정도) 컷 : 1 .- 실험 전에 2-3일는 포도 주스 번호판을 확인하고 설정 케이지하다 병 및 면화의 조각 (이것은 공기 흐름 수)로 기입은 병으로 파리를 누르고 포도 주스 플레이트와 커버. 25 유지 ° C (또는 상온), 파리는 약 10 일 동안 배아 누워해야합니다.

실험 주사 바늘을 뽑아 2 .- 최소한 1 일 전에, 우리는 Kopf 니들 / 피펫 끌어당기는 모델 720 및 얇은 벽의 유리 필라멘트 (세계 정밀 계측기 tw100f)를 사용합니다. 형광 tubulin의 주입을 위해, 4 바늘을 유지 ° C가 주사 바늘에 온도 유도 중합을 방지하기 위해.

Tubulin 준비 :

참고 : tubulin과 함께 모든 작업이 4 이루어져야 ° C가 중합을 방지하기 위해.

  1. 냉동고의 표시 tubulin을 꺼내 5 ~ 15 분 정도 얼음에 넣어.
  2. G - PEM 버퍼 (4 10 배 이상이 요구되는 강도에 따라)로 희석.
  3. 4 13k rpm으로 원심 분리기 ° 10-15분를위한 C.
  4. 로드 1 - 바늘에 2 μl.

항체 또는 화학 억제제 :

적절한 농도 (이것은 테스트해야 할 수도 있습니다)를 사용하여, tubulin에 대해서는 바늘을 준비합니다. 항체는 사출 버퍼 G - PEM 버퍼 또는 PBS 수 있습니다. 다른 버퍼가 필요한 경우,이 버퍼는 버퍼 자체에 아무런 손상을 초래하지 않도록 제어로 주입해야합니다.

참고 : 억제제와 형광 tubulin이 혼합 및 농도가 허용하는 경우 함께 주입 수 있습니다. 그렇지 않으면, 형광 tubulin을 삽입하고 억제제를 주사하기 전에 5-10분을 기다립니다. 적은 배아가 정상적으로 복구하기 때문에 이중 주사를 수행하면, 더 많은 배아와 함께 시작합니다.

배아 컬렉션

  1. 라이 새장에 새 포도 주스 플레이트 놔.
  2. 일시간 후에이 판을 제거, 이것이 오늘의 첫 컬렉션이며, 대부분 매우 좋지 않습니다. 그것은 삭제할 수 있습니다.
  3. 일시간 각 수집 배아를 유지하기 위해 판 매 시간마다를 변경합니다.

Coverslip 준비 :

  1. 현미경 슬라이드의 한쪽에 50 X 22mm coverslip 놔. 슬라이드 테이프 네 모퉁이가 움직이지 않도록.
  2. 커튼을 사용하면, 작은 주걱을 밀고 coverslip (접착제는 점성하지 않아야하고 몇 초 만에 건조해야하고, 그렇지 않으면 더 헵탄 추가) 한 줄에 헵탄 접착제 중 하나가 레이어를 넣어.
  3. 한 조각을 넣어coverslip의 측면 방향으로 슬라이드에 끈적끈적한 테이프를 두 번.

배아 준비 :

참고 : 태아가 컬렉션의 시작 후 2 시간 정도 군데해야하므로 충분한 시간이 시간 프레임 내에이를 완료 수 있도록 다음 단계를 시작합니다.

  1. moistened 브러시로 조심스럽게 슬라이드를 두 번 끈적거리는 테이프에 포도 주스 판과 장소에서 배아를 선택하십시오.
  2. chorion (외부 멤브레인)가 열려있는 휴식까지 족집게의 바깥쪽 부분을 사용하여 두 끈끈한 테이프 통해 배아를 롤.
  3. 그것은 트위터에 막대기와 coverslip의 긴 측면에 배아 병렬의 긴 면을 coverslip에 헵탄 접착제에 배치하므로 부드럽게 chorion을 통해 그것을 압연하여 배아를 선택하십시오. 행 하나에 10-20 배아를 설정합니다.
  4. coverslip을 제거하고 3-8분 (이것은 객실과 주입하는 금액의 습도에 따라 다릅니다)의 탈수 챔버에 놓으십시오.
  5. 진공 그리스와 금속 챔버에 놓습니다.
  6. 더 탈수 방지하기 할로 카본 오일 700으로 배아를 커버. 배아는 이제 주사에 대한 준비가되어 있습니다.

배아 주입 :

  1. 16X 목표 아래 배아를 찾습니다.
  2. 멀리 배아를 이동하고, 초점 비행기를 이동하지 않고 바늘을 찾으십시오.
  3. 센터 바늘과 X 또는 Y 방향으로 이동하지 않고 그것을 이동하십시오.
  4. 바늘이 열려 있지 않은 경우보기의 분야에서 coverslip의 가장자리를 넣어하지만 바늘이되지 않습니다 어디에, 그리고 같은 초점 비행기에 바늘을 낮추십시오. 그것은 바늘을 명중하고 부드럽게 열어 휴식까지 매우 조심스럽게 coverslip 이동합니다. 바늘이 열려 있으면 5 단계로 이동합니다. (니들이 작성 전에 불화 수 소산​​ 산성과 열 수 있습니다.)
  5. 보기에서 배아 (하지만 바늘이 거기에있을 것이다)을 넣어, 기름에 바늘을 절감하고 사용자가 바늘에서 좋은 액체 방울을 얻을 있는지 확인하십시오.
  6. 조심스럽게하지만 꾸준히 바늘로 배아를 이동하고 배아에 드롭을 삽입하고 멀리 배아를 이동합니다. (또는 분사 장치의 지침을 따르십시오.)
  7. 모든 배아가 주입되고 나면, 그들은 공촛점 현미경에서 관찰하기 위해 준비가되어 있습니다.

이미징 :

60 100X 목적으로 공촛점 현미경에서 이미지 배아를 :
참고 :

  1. 배아의 유사 분열은 매우 빠른이기 때문에 시간 경과 시리즈에 시간 간격은 공부하는 정확한 절차에 따라, 대부분의 몇 초 있어야합니다.
  2. 3D 시리즈 또는 하나의 비행기는 관심의 과정에 따라 취득하실 수 있습니다.
  3. 빨리 연기 억제제의 경우, 주사 현미경에서 이미징 현미경을 전송 빨리되어야한다.

그림 1
그림 1 : Drosophila syncytial 배아에서 유사 분열 연구. 초기 배아의 핵은 13 핵 양식 피질에서 monolayer 통해 사이클 10 중, cytokinesis없이 빠른 부문을 받고있다.가. 대뇌 피질의 핵과 초기 배아의 개략도. 난자는 표시된 단백질 GFP 및 / 또는 RFP를 표현할 수있는 다른 표시 단백질 및 / 또는 억제제와 함께 microinjected 수 있습니다. 사이클 11 GFP - tubulin과 극 - 극 분리의 RFP - 히스톤. C. 플롯을 표현 배아의 B. 시간 저속 이미징 , 야생 입력 배아에 12 13. 스핀들 길이는 사시 길이 매우 일관성과 재현성 아르 연신율 기간의 기간을 나타냅니다. 스핀들 microtubules의 D. 역학. rhodamine tubulin의 낮은 농도의 주입은 미세 소관 역학을 연구하는 데 사용할 수있는 몇 가지 tubulin의 subunits의 형성 speckles로 연결됩니다.

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Discussion

이 프로토콜은 그러나 각 단계는 배아가 손상되지 않도록 연습을 필요로 상대적으로 간단합니다. 주의 제어 실험은 항상 신뢰할 수있는 결과가 취득되는 것을 보장하기 위해 수행해야합니다. 이것을 시작하는 한 가지 좋은 방법은 유사 분열은 배아 표면 (사이클 13를 통해 10)의 모든 사이클을 통해 정상적으로 진행되었는지 확인하기 위해 GFP - tubulin을 표현하는 제어 배아에 버퍼 또는 rhodamine tubulin을 microinjecting 것입니다. 제어 배아에서 자주 너무 탈수의 결과 스핀들 사이의 물리적 연결을 준수하지 말아야하므로 탈수 시간을 줄일 수 있습니다. 배아가 손상되면, 방사능 낙진이 자주 관찰, 무료 centrosomes 또는 핵이나 스핀들의 고르지 간격 손상을 나타내는 있습니다. 극 - 극 거리의 플롯은 매우 재현성하고 "성공"매우 신뢰할 수있는 측정되고 제어 배아에 그들은 그림 1에 나타난 사람과 같이 표시됩니다.

우리는 스핀들 조립, 유지 보수 및 관심 1,5,6,7,8,9,10,11,12,13의 단백질에 대한 단클론 제기, 펩타이드 또는 polyclonal 항체를 사용하여 신장의 여러 측면을 연구하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 특정 단백질 억제제 또는 관심의 단백질에 영향을 미치는 다른 화학 물질도 microinjected 수 있으며, 그 효과는 관찰과 양적 측정. 특정 억제제의 효과를 평가하기 위해, 우리는 억제 후 제어 배아에서 관찰되는에 스핀들 길이를 비교합니다. 또한 형광등은 형광 tubulin의 낮은 농도 (그림의 1D)의 microinjection 후 현미경 14 스페클 사용하여 tubulin 역학에서 볼 수 있습니다.

우리는 일반적으로 하나의 시간 동안 수집하고 관찰하기 전에 한 번 더 시간 동안 태아는 성숙하게, 이것은 관찰하면 태아는 1 ~ 2 시간 전거는 것을 의미합니다. 파리 잘 누워 많은 배아가 한 시간 안에 수집하는 경우, 다음 수집 시간이 더 많은 동기 - 나누어 배아를 얻을 수 있도록 단축 수 있습니다. 억제의 타이밍이 연구에 관심이 중요하거나 경우 억제제는 공촛점 관찰하에 주입 수 있습니다. 이것은 어렵습니다,하지만 그럼에도 불구하고 수 있습니다.

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Acknowledgments

이 프로토콜은 현재 저희 실험실에서 사용되고 DRS 데이비드 샤프, Mijung 권, Patrizia Sommi, Dhanya Cheerambathur를 포함한 많은 사람들이 지난 몇 년 동안 정제되었습니다. 우리는이 시스템에서 우리의 작업이 시작 받고 초기 Drosophila의 배아의 조작과 microinjection (ref. 13)에 대한 훌륭한 조언으로 우리를 제공 박사 빌 설리반 (UCSC)를 주셔서 감사합니다. 우리는 스칼리 연구소의 모든 구성원 감사합니다. Drosophila에서 유사 분열에 우리의 작품은 NIH 부여 GM55507에 의해 지원됩니다.

References

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발달 생물학 제 31 유사 분열 Drosophila melanogaster syncytial 배아 microinjection 단백질 억제
의 유사 분열 유학을위한 Microinjection 기법<em> Drosophila melanogaster</em> Syncytial 엠브료
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Brust-Mascher, I., Scholey, J. M.… More

Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo. J. Vis. Exp. (31), e1382, doi:10.3791/1382 (2009).

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