Mikroinjektion Tekniker för att studera Mitos i Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Summary

Detta protokoll beskriver användning av mikroinjektion och högupplösande avbildning i

Abstract

Detta protokoll beskriver användningen av Drosophila melanogaster syncytial embryo för att studera mitos ^1. Drosophila har bra genetik med ett ordnat genomet, och det kan vara lätt att underhålla och manipuleras. Många mitotiska mutanter existerar och transgena flugor uttrycka funktionella fluorescerande (t.ex. GFP) - taggade mitotiska proteiner har och håller på att skapas. Riktade genuttryck är möjlig med GAL4/UAS system ^2.

Den Drosophila tidiga embryot utför flera mitoses mycket snabbt (cellcykeln varaktighet, ≈ 10 min). Det är väl lämpad för bildhantering mitos, eftersom det under cykler 10-13, kärnor delar snabbt och synkront utan att ingripa cytokines på ytan av embryot i en enda monolager precis under cortex. Dessa snabbt delande kärnor använder antagligen samma mitotiska maskiner som andra celler, men de är optimerade för hastighet, riktpunkten är allmänt tros inte vara stränga, vilket gör att studien av mitotiska proteiner vars frånvaro skulle orsaka gripandet cellcykeln i celler med en stark checkpoint . Embryon som uttrycker GFP märkta proteiner eller idag injiceras med fluorescerande proteiner kan lätt avbildas följa leva dynamik (Fig. 1). Dessutom kan embryon idag injiceras med funktion-blockerande antikroppar eller hämmare av specifika proteiner för att studera effekten av förlust eller störning av deras funktion ^3. Dessa reagenser kan sprida i hela embryot, nå många spindlar för att producera en lutning på koncentration av hämmare, som i sin tur resulterar i en gradient av defekter kan jämföras med en allela serie av mutanter. Helst om målprotein fluorescerande är märkt, kan lutning på inhibition direkt visualiseras ^4. Det förutsätts att den starkaste fenotypen är jämförbart med noll fenotypen, men det är svårt att formellt utesluta att antikroppar kan ha dominerande effekter i sällsynta fall, så en noggrann kontroll och försiktig tolkning måste tillämpas. Längre bort från injektionsstället är proteiners funktion endast delvis förlorat låta andra funktioner målprotein för att bli uppenbara.

Protocol

Recept:

Druvsaft plattor:

• 5.5g Bacto agar
• 14,5 g glukos eller glukos
• 7,15 g sackaros
• 45 ml druvsaft koncentrat (100% juice).
• 204,5 ml H ₂ 0
• 625 l 10N NaOH

Blanda alla ingredienser och mikrovågsugn tills kokning.
Tillsätt 2,8 blanda ml syra (syra mix: 20,9 ml propionsyra, 2,1 ml fosforsyra, 27 ml H ₂ 0)

Blanda och häll på en 35 mm petriskålar. Låt stelna i rumstemperatur i en eller två dagar. Om plattorna inte kommer att användas snart, tätning med parafilm och förvara vid 4 ° C (låt jämvikt till RT innan du använder).

Jäst pasta:

Lös upp cirka en tesked jäst (Sigma YSC2, jäst från Saccharomyces cerevisiae typ II) i vatten för att bilda en tjock smet. Placera en liten mängd av detta på varje druvsaft platta strax före användning.

G-PEM buffert:

• 80 mM Na-rör, pH 6,9
• 1 mM MgCl ₂
• 1 mM EGTA
• 1 mM GTP

Injektion buffert:

• 150 mm K-aspartat
• 10 mm K-fosfat
• 20 mM imidazol, pH 7,2

Heptan lim:

Rulla dubbel tejp och placera i en 100 ml flaska, tillsätt ca 50 ml heptan, försegla flaskor och sten i flera dagar. När du använder, lägg heptan om limmet är för tjockt.

Dehydrering kammare:

Ta en 100 mm petriskål, sätta en del av en 35 mm maträtt inne för att göra ett "bord" och lägga Drierite (vattenfritt kalciumsulfat) runt den så att höjden av Drierite inte är högre än den "bord" och lock. Den täckglas med embryon kommer att placeras på detta "bord" för uttorkning före injektion. Det är en bra idé att använda åtminstone en del tyder Drierite och ändra den när den har ändrat färg.

Protokoll:

Detta protokoll kan användas för injektion av praktiskt taget alla lösliga reagens i Drosophila syncytial embryot: Till exempel, antingen ett fluorescerande protein för observation eller ett målprotein-hämmare eller båda.

Att få allt klart:

1 .- 2 till 3 dagar innan experimentet att göra druvsaft tallrikar och ställa in låg bur: Ta en plastflaska (6 oz, rund botten från Applied Scientific Drosophila), skär två små hål (ca 1 cm ²⁾ på motsatta sidor av flaska och fyll med en bomull styck (detta gör att luften att flöda) trycker flugorna i flaskan och täck med en druvsaft tallrik. Förvara vid 25 ° C (eller rumstemperatur), bör flugor lägga embryon i ca 10 dagar.

2 .- Minst en dag före försöket drar nålar för injektion, använder vi en Kopf Needle / Pipettera avdragare modell 720 och tunnväggiga trådar glas (World precisionsinstrument tw100f). För injektion av fluorescerande tubulin, hålla nålar vid 4 ° C för att förhindra temperatur-inducerad polymerisation i nålen.

Tubulin förberedelser:

Notera: Allt arbete med tubulin bör göras vid 4 ° C för att förhindra polymerisation.

1. Ta märkt tubulin ur frysen och lägga den på is i 5 till 15 minuter.
2. Späd med G-PEM buffert (4 till 10 gånger beroende på önskad intensitet).
3. Centrifugera vid 13k rpm vid 4 ° C i 10-15 minuter.
4. Ladda 1 till 2 l in nålen.

Antikropp eller kemiska hämmare:

Förbered nålar som för tubulin, med hjälp av en lämplig koncentration (detta kan behöva testas). Antikroppen kan i injektion buffert, G-PEM buffert eller PBS. Om en annan buffert behövs, kommer denna buffert måste injiceras som en kontroll för att se till att denna buffert orsakar ingen skada på egen hand.

Obs: hämmare och fluorescerande tubulin kan blandas och injiceras tillsammans om de koncentrationer tillåter det. Annars injicera fluorescerande tubulin och vänta 5 till 10 minuter innan du injicerar hämmare. När du utför en dubbel injektion, börja med fler embryon, eftersom färre embryon kommer att återhämta sig normalt.

Embryosamlingsgrupp:

1. Sätt en ny platta druvsaft på låg bur.
2. Ta bort den här plattan efter en timme, detta är den första kollektionen av dagen och ofta är inte så bra. Det kan kasseras.
3. Ändra plattan varje timme för att hålla samla embryon i en timme vardera.

Täckglas förberedelser:

1. Sätt en 50 x 22mm täckglas på ena sidan av ett objektglas. Tejpa de fyra hörnen på glaset så att den inte röra sig.
2. Använda en bomull tippas applikatorn, sätta ett lager av heptan lim i en linje på täckglas (limmet inte bör trögflytande och ska torka i några sekunder, annars lägga till fler heptan).
3. Lägg en bitdubbel tejp på bilden mot sidan av täckglas.

Embryo förberedelser:

OBS: Embryon skall avbildas ca 2 timmar efter starten av insamlingen, så börja följande steg ger tillräckligt med tid att avsluta dem inom denna tidsram.

1. Med en fuktad pensel försiktigt plocka upp embryon från druvsaft plattan och lägg på dubbel tejp på bilden.
2. Med hjälp av yttre delen av pincett, rulla embryon över dubbla tejp tills chorion (yttre membranet) går sönder.
3. Plocka upp embryot genom att försiktigt rulla den över chorion så det fastnar på pincett och placera den på heptan lim på täckglas med den långa sidan av embryot parallellt med långsidan av täckglas. Sätt upp 10 till 20 embryon i en rad.
4. Ta bort täckglaset och placera den i uttorkning kammare i 3 till 8 minuter (det beror på luftfuktigheten i rummet och det belopp som injiceras).
5. Placera på en metall kammare med vakuum fett.
6. Täck embryon med Halocarbon olja 700 för att undvika ytterligare uttorkning. Embryon är nu klar för injektion.

Embryo injektion:

1. Hitta embryon under en 16x mål.
2. Flytta embryon bort och hitta nålen utan att flytta fokus planet.
3. Center nålen och flyttar upp det utan att flytta den i x-eller y-led.
4. Om nålen inte är öppen, lägg i kanten av täckglaset i synfältet, men inte där nålen ska vara, och sänka nålen i samma fokalplanet. Mycket försiktigt flytta täckglas tills den träffar nålen och försiktigt bryter det öppet. Om nålen är öppen, gå till steg 5. (Kanyler kan öppnas med fluorvätesyra före fyllning).
5. Sätt embryon tanke (men inte där nålen ska vara), lägre nålen i olja och se till att du får fina vätska droppar från nålen.
6. Försiktigt men stadigt flytta embryot in nålen och injicera en droppe i embryot och flytta embryot bort. (Eller följ instruktionerna på din injektion apparater).
7. Efter att alla embryon har injicerats, de är redo för observation på en konfokalmikroskop.

Imaging:

Bild embryona på ett konfokalmikroskop med en 60 eller 100X mål:
Anmärkningar:

1. Tidsintervallet för en tid förflutit serie skall vara högst ett par sekunder, sedan mitos i embryot är mycket snabb, beroende på den exakta processen som ska studeras.
2. En 3D-serie eller en enda plan kan förvärvas beroende på process av intresse.
3. För snabbverkande hämmare, har överföringen från injektionen mikroskop för avbildning mikroskop för att vara snabb.

Figur 1: Studie av mitos i Drosophila syncytial embryot. Kärnor i det tidiga embryot genomgår snabba divisioner utan cytokines under cyklerna 10 till 13 kärnor bildar en monolager på hjärnbarken. A. Schematisk bild av tidiga embryot med kärnor i cortex. Embryo kan uttrycka GFP och / eller RFP märkta proteiner och kan idag injiceras med andra märkta proteiner och / eller inhibitorer. B. Time lapse avbildning av embryo som uttrycker GFP-tubulin och RFP-histon. C. Rita av pol-pol separation för cyklar 11 , 12 och 13 i vild typ embryo. Sprintlängd uppvisar perioder av isometrisk längd och perioder av töjning, som är mycket enhetliga och reproducerbara. D. dynamik spindel mikrotubuli. Injektion av låg koncentration av Rhodamine tubulin leder till fläckar bildas av ett fåtal tubulin subenheter, som kan användas för att studera mikrotubuli dynamik.

Discussion

Detta protokoll är relativt enkelt, men kräver att varje steg i praktiken att se till att embryona inte är skadade. Noggrann kontroll experiment måste alltid göras för att säkerställa att tillförlitliga resultat kan uppnås. Ett bra sätt att börja detta är microinjecting buffert eller Rhodamine tubulin till kontroll embryon som uttrycker GFP-tubulin att se till att celldelningen i normalfallet går igenom alla cyklar på embryot ytan (cykler 10 till 13). Kontroll embryon bör du inte observera några fysiska anslutningar mellan spindlar som ofta är resultatet av för mycket uttorkning, så sänker uttorkning tiden. När embryon är skadade, är radioaktivt nedfall ofta observeras, fria centrosomes eller ojämna mellanrum av kärnor eller spindlar är tecken på skador. Tomter för pol-pol avståndet är mycket reproducerbara och är ett mycket tillförlitligt mått på "framgång", i kontroll embryon de ska se ut som visas i figur 1.

Vi har använt detta protokoll för att studera många aspekter av spindel tillverkning samt underhåll och töjning med hjälp av monoklonala, peptid eller polyklonala antikroppar som riktats mot proteinet av intresse ^{1,5,6,7,8,9,10,11,12,13.} Specifikt protein-hämmare eller andra kemikalier som påverkar proteinet av intresse även idag injiceras och deras effekter observerade och kvantitativt. För att bedöma effekten av en viss hämmare, jämför vi Sprintlängd efter hämning som observerats i kontrollen embryon. Vi kan också titta på tubulin dynamik med hjälp av fluorescerande Speckle Mikroskopi ¹⁴ efter mikroinjektion av en låg koncentration av fluorescerande tubulin (Fig. 1d).

Vi vanligtvis samlar i en timme och låt embryon mogen för ytterligare en timme före observation, innebär det att embryon är mellan 1 och 2 timmar gammal när observeras. Om flugor om bra och många embryon har samlats i en timme, då insamlingen tiden kan förkortas så att fler synkront-dela embryon erhålls. Om tidpunkten för hämning är kritiska eller av intresse för studien, kan hämmare injiceras under konfokala observation. Detta är svårare, men det är möjligt ändå.