Mitoz incelenmesi için Mikroenjeksiyon Teknikleri Drosophila melanogaster Sinsityal Embriyo

Summary

Bu protokol, mikroenjeksiyon ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme kullanımı açıklanır

Abstract

Bu protokol, Drosophila melanogaster sinsityal embriyo mitoz ¹ eğitim için kullanımı anlatılmaktadır. Drosophila sıralı genomu ile yararlı genetik ve kolayca korunur ve manipüle edilebilir. Birçok mitotik mutantlar var ve (örneğin, GFP) floresan fonksiyonel ifade transgenik sinekler etiketli mitotik proteinler edilmiş ve üretildikten sonra. Hedeflenen gen ekspresyonu GAL4/UAS sistemi ² ile mümkündür.

Drosophila erken embriyo (hücre döngüsü süresi, ≈ 10 dk), birden mitoz çok hızlı bir şekilde yürütmektedir . Döngüleri 10-13 sırasında, çekirdeklerin, korteks hemen altında tek tek tabakalı embriyonun yüzeyindeki sitokinez müdahale olmadan hızlı bir şekilde ve eşzamanlı olarak bölmek, çünkü iyi görüntüleme mitoz için uygundur. Bu hızla bölünerek çekirdekleri, muhtemelen, diğer hücrelerin aynı mitotik makine kullanımı, ancak hız için optimize edilmiş, kontrol noktasında genellikle yokluğu güçlü bir kontrol noktasında hücreler hücre siklusu durmasına neden olur mitotik proteinlerin çalışma izin sıkı olmamalıdır inanılmaktadır . Veya GFP etiketli proteinlerin ifade Embriyolar floresan ile işaretlenmiş proteinler microinjected canlı dinamikleri takip etmek (Şekil 1) kolayca görüntülü olabilir. Buna ek olarak, embriyoların ^3, işlev kaybı veya pertürbasyon etkisini araştırmak için spesifik proteinlerin fonksiyonu bloke edici antikorlar veya inhibitörleri ile microinjected olabilir. Bu reaktifler inhibitör konsantrasyonunun bir degrade, mutant alel serisi ile karşılaştırılabilir kusurları bir degrade dönüş sonuçlar üretmek için birçok iğ ulaşan embriyo boyunca diffüz İdeal olarak, hedef proteinin floresan etiketli ise inhibisyon degrade ⁴ direkt görüntülenebilmekte olabilir. Resmen antikorlar uygulanması gereken nadir durumlarda, bu kadar sıkı kontrol ve ihtiyatlı yorumu baskın etkileri olabileceği olasılığını dışlamak için zor olsa da, güçlü fenotip boş fenotip karşılaştırılabilir olduğu varsayılır. Enjeksiyon yerinden daha uzak, protein fonksiyonu sadece kısmen hedef proteinin diğer işlevler belirgin hale izin kaybetti.

Protocol

Tarifler:

Üzüm Suyu plakalar:

• 5.5g bacto agar
• 14.5 gr dekstroz veya glukoz
• 7.15 g sakaroz
• 45 ml üzüm suyu konsantresi (% 100 meyve suyu).
• 204.5 ml H ₂ 0
• 625 ul 10N NaOH

Tüm malzemeyi ve mikrodalga kaynayana kadar karıştırın.
2.8 ml asit karışımı (20.9 ml propiyonik asit, 2.1 ml fosforik asit, 27 ml H ₂ 0 asit karışımı)

35 mm Petri kaplarının üzerine dökün ve karıştırın. Bir ya da iki gün boyunca oda sıcaklığında katılaşmaya edelim. Plakalar yakında olacak değilseniz, 4 parafilm mühür ve tutmak ° C (RT kullanmadan önce gelmesini izin verin).

Maya yapıştırın:

Kalın bir hamur oluşturmak için bir tatlı kaşığı maya (Sigma YSC2, maya Saccharomyces cerevisiae tip II) su ile ilgili çözülür. Kullanımdan hemen önce, her bir üzüm suyu plaka üzerinde bu küçük bir miktar koyun.

G-PEM tampon:

• 80 mM Na-BORU, pH 6.9
• 1 mM MgCl ₂
• 1 mM EGTA
• 1 mM GTP

Enjeksiyon tamponu:

• 150 mM K-Aspartat
• 10 mM K-fosfat
• 20 mM imidazol, pH 7.2

Heptan tutkal:

100ml şişe çift yapışkan bant ve yeri önüne sermek, 50ml heptan hakkında birkaç gün için şişe ve taş mühür. Tutkal, çok kalın ise kullanırken, heptan ekleyin.

Dehidrasyon haznesi:

100 mm Petri kabı, bir "tablo" yapmak için 35 mm çanak içinde bir parçası koymak ve Drierite yüksekliği "tablo" ve kapak daha yüksek olmadığını, bu yüzden etrafında Drierite (susuz kalsiyum sülfat) eklemek. Embriyolar ile lamel enjeksiyondan önce dehidratasyon için bu "tablo" alınacaktır. Bu en azından bazı belirten Drierite kullanımı ve renk değiştirdi bunu değiştirmek için iyi bir fikirdir.

Protokol:

Bu protokol, hemen hemen herhangi bir çözünen reaktif Drosophila sinsityal embriyo içine enjeksiyon için kullanılan olabilir: Örneğin, bir floresan gözlem ya da bir hedef protein inhibitörü için protein ya da her ikisi.

Her şey hazır:

, Plastik bir şişe atın (6 oz, Uygulamalı Bilimsel Drosophila yuvarlak alt), ters tarafta iki küçük delik ⁽² 1cm hakkında) kesme: 1 .- deneyden önce 2 ila 3 gün, üzüm suyu plakaları ve kafes kurmak yatıyordu şişe ve şişe (bu hava akışına izin verecek) bir pamuk parçası ile doldurun, içine sinek dokunun ve üzüm suyu plaka ile kaplayın. 25 tutun ° C (veya oda sıcaklığı) yaklaşık 10 gün boyunca, sinekler embriyolar yatıyordu.

Deney enjeksiyon için iğneler çekin 2 .- en az bir gün önce, bir Kopf İğne / Pipet çektirmesi modeli 720 ve ince cidarlı cam filamentler (Dünya Hassas Aletler tw100f) kullanın. Floresan tubulin enjeksiyon için iğne tutmak, 4 ° C sıcaklığa bağlı polimerizasyonu önlemek için iğne.

Tubulin hazırlanması:

Not: Tüm tubulin 4 yapılmalıdır ° C polimerizasyonu önlemek için.

1. Dondurucu etiketli tubulin çıkarın ve 5 ila 15 dakika buz koyun.
2. G-PEM (4 ila 10 kat talep yoğunluğuna bağlı olarak) tampon ile seyreltilir.
3. 13k rpm hızında 4 Santrifüj ° C de 10-15 dakika.
4. Yük 1 - 2 ul içine iğne.

Antikor veya kimyasal inhibitörü:

(Bu test edilmesi gerekebilir) uygun bir konsantrasyon iğneler kullanarak, tubulin olarak hazırlayın. Antikor, G-PEM enjeksiyon tampon tampon veya PBS olabilir. Başka bir tampon gerekiyorsa, bu tampon bu tampon kendi başına herhangi bir hasara neden olur emin olmak için bir kontrol olarak enjekte edilmesi gerekecektir.

Not: İnhibitör ve floresan tubulin karıştırılır ve konsantrasyonlarının izin verirseniz birlikte enjekte edilebilir. Aksi takdirde, floresan tubulin enjekte inhibitörü enjekte etmeden önce 5 ila 10 dakika bekleyin. Az embriyolar normal iyileşir bir çift enjeksiyon yaparken, daha fazla embriyolar ile başlamak.

Embriyo toplama:

1. Yatıyordu kafes yeni bir üzüm suyu plaka koyun.
2. Bir saat sonra bu plaka kaldırın, bu günün ilk toplama ve genellikle çok iyi değildir. Bu iptal edilebilir.
3. Plaka, her bir saat için embriyoları toplama tutmak için her saat değiştirin.

Lamel hazırlanması:

1. Bir mikroskop lamı bir tarafında 50 x 22mm lamel koyun. Slayt bantlayın dört bir yanına taşımak değildir.
2. Bir pamuk uçlu bir aplikatör, lamel (yapıştırıcı viskoz olmamalı ve birkaç saniye içinde kuru olmalıdır, aksi takdirde daha heptan eklemek) tek bir satırda bir katman heptan tutkal koydu.
3. Bir parça koyun.lamel tarafa doğru slayt yapışkan bant çift.

Embriyo hazırlanması:

Not: Embriyolar toplama başladıktan sonra yaklaşık 2 saat görüntülü olmalıdır, bu yüzden bu zaman dilimi içinde bitirmek için yeterli zaman izin aşağıdaki adımları başlayacak.

1. Nemlendirilmiş bir fırça ile dikkatlice slayt çift yapışkan bant üzüm suyu plaka ve yer embriyolar pick up.
2. Koryon (dış zarı) açık tatili kadar dış kısmı cımbız kullanarak, çift yapışkan bant üzerinde embriyolar rulo.
3. Cımbız yapışıyor ve embriyo paralel lamel uzun kenarı uzun kenarı ile lamel heptan tutkal üzerine yerleştirin yavaşça koryon üzerine yuvarlanan embriyo Pick up. 10 ila 20 embriyolar bir satır yukarı ayarlayın.
4. Lamel çıkarın ve 3 ila 8 dakika (oda ve enjekte edilecek miktar nem bağlıdır) dehidrasyon odasında yerleştirin.
5. Vakum gres metal bir odasının üzerine yerleştirin.
6. Kapak Halokarbon petrol 700 ile embriyolar daha ileri dehidratasyonu önlemek için. Embriyolar artık enjeksiyon için hazır.

Embriyo enjeksiyon:

1. 16x objektif altında embriyoların bulun.
2. Embriyolar taşıyın ve odak düzlemli hareket ettirmeden iğne bulmak.
3. Merkezi iğne ve x veya y yönünde hareket ettirmeden yukarı hareket ettirin.
4. Iğne açık değilse, görüş alanı içinde lamel kenarına koyun, ancak iğne olacak yerde ve aynı odak düzlemli iğne düşük. Iğne vurur ve yavaşça açın bozulana kadar lamel çok dikkatli hareket ettirin. Iğne açık ise, 5. adıma geçin. (İğneler doldurmadan önce hidroflorik asit ile açılabilir).
5. Embriyoların (ancak iğne olacak) yağı koyun, içine iğne alt ve iğne güzel sıvı damla elde emin olun.
6. Iğne içine dikkatlice fakat istikrarlı bir embriyo hareket ve embriyo içine bir damla enjekte embriyo ve uzağa taşıyın. (Ya da enjeksiyon aparat yönergeleri izleyin).
7. Tüm embriyoların enjekte edildikten sonra, bir konfokal mikroskop gözlem için hazır.

Görüntüleme:

60 veya 100X amacı ile konfokal mikroskop Görüntü embriyoların:
Notlar:

1. Embriyo mitoz çok hızlı olduğundan tam sürece bağlı olarak incelenmesi gereken bir zaman atlamalı dizi zaman aralığı, en fazla bir kaç saniye olmalıdır.
2. 3D serisi veya tek bir düzlemde ilgi sürecine bağlı olarak elde edilebilir.
3. Hızlı hareket inhibitörleri, enjeksiyon mikroskop görüntüleme mikroskop transfer hızlı olmak zorundadır.

Şekil 1: Drosophila sinsityal embriyo mitoz çalışılması. Erken embriyo Çekirdekler 10 13 çekirdekleri formu kortekste bir tek tabaka ile devir sırasında, sitokinez olmadan hızlı bölünmeler tabi. Kortekste çekirdekleri ile erken embriyo şematik. B. Zaman atlamalı görüntüleme GFP-tubulin ve kutup kutup ayırma RFP-histon C. Arsa 11 döngüleri ifade embriyo embriyo etiketli proteinlerin GFP ve / veya RFP ifade edebilir ve diğer etiketli proteinlerin ve / veya inhibitörleri ile microinjected olabilir. , 12 ve 13 vahşi bir tip embriyo. Mil uzunluğunda izometrik uzunluğu ve çok tutarlı ve tekrarlanabilir uzama dönemleri dönemleri sergiler. Mili mikrotübül D. Dinamiği. Rodamin tubulin düşük konsantrasyonda enjeksiyon mikrotübül dinamiklerini incelemek için kullanılan bir kaç tubulin alt birimden oluşan benekler yol açar.

Discussion

Bu protokol, ancak her adım embriyoların zarar görmediğinden emin olmak için pratik gerektirir, nispeten basittir. Dikkatli kontrol deneyleri her zaman güvenilir sonuçlar elde ediliyor olmasını sağlamak için yapılması gerekir. Iyi bir şekilde başlamak için GFP-tubulin ifade mitoz embriyo yüzey (döngüleri 13 üzerinden 10) tüm döngüleri ile normal olarak devam eder emin olmak için kontrol embriyolar içine tampon veya rodamin tubulin microinjecting. Kontrolü embriyolar, genellikle çok fazla dehidrasyon sonucu iğ arasında herhangi bir fiziksel bağlantı gözlemlemek olmamalıdır, bu nedenle dehidrasyon zaman daha düşüktür. Embriyolar zarar gördüğünde, nükleer serpinti sık gözlenen, ücretsiz centrosomes veya çekirdekleri veya iğ düzensiz boşluk hasar göstergesidir. Kutup kutup mesafe Arsalar çok tekrarlanabilir ve "başarı" çok güvenilir bir ölçü, kontrol embriyolarda Şekil 1'de gösterildiği gibi görünmelidir.

Biz mili montaj, bakım ve ilgi ^{1,5,6,7,8,9,10,11,12,13} protein karşı yükseltilmiş monoklonal, peptid veya poliklonal antikorlar kullanılarak uzama pek çok açıdan incelemek için bu protokol kullandık. Özel protein inhibitörleri veya ilgi protein etkileyen diğer kimyasalların da microinjected ve etkileri gözlemlenen ve kantitatif olarak ölçülür. Belirli bir inhibitörü etkisini değerlendirmek için, biz inhibisyonu sonra kontrol embriyolarda görülen mil uzunluğunda karşılaştırın. Ayrıca Floresan floresan tubulin düşük konsantrasyonda (Şekil 1d) mikroenjeksiyon sonrası Mikroskopi ¹⁴ speckle kullanarak tubulin dinamikleri bakabilirsiniz.

Biz genellikle bir saat önce bir saat gözlem toplamak ve embriyolar olgun izin, bu gözlenen zaman embriyolar 1 ila 2 saat eski olduğu anlamına gelir. Sinekler de döşeme ve birçok embriyolar, bir saat içinde toplanan iseniz, o zaman toplama zamanı daha fazla eşzamanlı bölünmesi embriyolar elde kısaltılmış olabilir. Inhibisyon zamanlaması kritik veya çalışmaya ilgi ise, inhibitörü konfokal gözlem altına enjekte edilebilir. Bu zor, ama yine de mümkündür.