Summary
이 비디오에서 우리는 미국 말굽 꽃게와 electroretinogram 녹음, 시신경 녹음 및 intraretinal 녹음을 수행
Abstract
미국 말굽 게, Limulus Polyphemus이 지구상에서 가장 오래된 생물 중 하나이며, 동물은 생명 의학 연구에 필수적인 역할을하고 있습니다. 뿐만 아니라 그들의 혈액은 과학자들이 우리의 의약품에 bacteriotoxins을 감지하기 위해 사용하는 특별한 세포를 포함하고 있지만, 그들의 눈을 또한 가벼운 적응 및 측면 억제와 같은 우리의 시각 시스템에서 운영 생리적 과정에 대한 많은 통찰력을 제공하고 있습니다 신경 네트워크를 포함 않습니다. 말굽 게이 동물이 대형 무척추 동물에 대한 하디이기 때문에, 그 망막 뉴런이 크고 쉽게 액세스할 수있는 비전 연구를위한 매력적인 모델 남아의 시각 시스템은 콤팩트하고 광범위하게 공부하고, 그 시각적 동작이 잘 정의됩니다. 또한, 내 눈을의 구조와 기능은 동물의 두뇌에 circadian 시계에 의해 매일 변조된 수 있습니다. 요컨대, 말굽 모양의 게를의 시각 시스템은 아직 흥미있을 정도로 복잡한 이해 정도로 간단하다.
이 비디오에서 우리는 Limulus와 생체내으로 수행할 수 있습니다 비전의 신경 기초를 조사 세 electrophysiological 패러다임을 제시한다. 그들은 electroretinogram 녹음, 시신경 녹음 및 녹화 intraretinal 있습니다. 표면 Electroretinogram (에르그) 레코딩 측정은 빛의 섬광에 눈의 모든 세포의 표현 전기 응답을 전극. 그들은 시간의 연장 기간 동안 안구의 전반적인 감도를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 시신경 레코딩은 세포 microsuction 전극과 하나의 신경 섬유의 급상승 활동을 측정합니다. 그들은 눈의 두뇌뿐 아니라 두뇌에서 눈에 다시 먹이 circadian - 시계 메시지 전달 시각적 메시지를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 세포내 microelectrode과 Intraretinal 레코딩 측정은 전압 변동은 눈의 개별 세포에 의해 빛을 유도. 그들은 망막 세포 처리 메커니즘을 명료하게하다하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
1 부 : 실험 준비
말굽 게는에서 수행 실험 절차는 보스턴 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 동물은 규제 빛을 어둠 사이클에 노출 방에있는 해양 생물 연구소 (우즈 홀, MA) 또는 다른 공급 업체로부터 구입하여 aerated 바닷물 탱크에 보관되어있다. 조명 처방은 꽃게의 circadian 시계를 entraining와 주간과 야간 상태 사이에 매일 눈을 사이클링에 중요합니다. 그 운동이 두 스테인레스 스틸 prosoma에 삽입된 나사와 opisthosoma 두와 느려짐 다음 나무 플랫폼 보안 때까지 즉시 침략 절차를 시작하기 전에, 동물은 10-15분위한 얼음 양동이에 차게됩니다. 그것이 물에 싱크 있도록 플랫폼은 화강암 아래에 가중치입니다. 터미널 실험 후 동물 다시 아이스 슬러리에 immersing과 메스와 입 위의 자리 두뇌, pithing하여 euthanized있다.
2 부 : 솔루션
Limulus 링어의 솔루션은 430 MM NaCl, 9.56 MM KCl, 9.52 MM CaCl2, 9.97 MM MgCl2, 21.05 MM MgSO4, 50μM TES, 50μM HEPES, 그리고 10ml / L 펜 - Strep 믹스 (페니실린 - 스트렙토 마이신, 10,000 단위 / ML)로 구성되어 있습니다 .
파트 3 : Electroretinogram 녹음
이 절차에 필요한 도구는 드라이버, 석유 젤리, 링어의 솔루션, 전송 피펫, 녹색 LED, 녹음 회의소, 스테인리스 나사 및 면봉을 포함합니다.
- 핸드메이드 챔버는 에르그 (그림 1A)를 기록하는 데 사용됩니다. 챔버 시체가 눈에 접촉 호수 저수지를 개최하도록 설계되었습니다. 뚜껑은 LED를 수용할 수 있도록 크기 증폭기와 작은 구멍에 전도성 솔루션을 결합을위한 실버 염화물 와이어를 포함하고 있습니다. 520nm 피크 방출 주위와 LED ultrabright가 최상의 상태로 작동합니다.
- 시작하려면, 챔버의 아래쪽은 석유 젤리로 코팅하고 두 개의 나사와 함께 눈에 안전합니다.
- 챔버는 다음 생리 가득한과 뚜껑이 났고요.
- 챔버 첨부 후 꽃게는 아가미를 통해 해수 가득한 탱크에 빛을 꽉 케이지에 배치됩니다.
- LED 케이블이 챔버 뚜껑에 삽입됩니다.
- 신호 리드는 염화물 와이어에 이어이며, 참조 리드는 이식 나사 중 하나 꺾을 수 있습니다.
- 두 리드는 신호 증폭 및 증폭기 필터가 10Hz 이하 주파수를 통과로 설정을위한 높은 임피던스 차동 증폭기의 머리 단계 (X - 세포 3x4, FHC 병원)에 연결되어 있습니다.
- 앰프 출력은 볼 수 오실로 스코프와 컴퓨터 분석 및 저장을위한 데이터 수집 보드에 공급됩니다.
- 설치 후 케이지 문을는 동물에 도달 객실 빛을 차단하는 닫힙니다.
- 데이터는 LabView로 작성된 사용자 정의 프로그램을 수집하고 있습니다. 이 프로그램은 LED를 깜박 evoked 에르그 신호를 기록하고 피크 - 투 - 피크 응답 진폭을 측정합니다. 플래시 패러다임의 선택은 실험 목적에 따라 달라집니다. 예를 들어, 5V의 간단한 (100ms) 펄스의 LED에 10 분마다 눈 감도의 circadian 변경을 모니터링 할 때 조명 적응의 효과를 방지 적용.
4 부 : 시각 신경 녹음
이 절차에 필요한 도구는 드라이버, 나사, trephine, 링어의 솔루션, rongeurs, vannas 가위, 녹음 회의소, 곡선 포셉, 미세 바늘 프로브, 재미 메스, 외과 가위, 및 흡입 전극을 포함합니다.
- 핸드메이드 챔버는 시신경 응답 (그림 1B)를 기록하는 데 사용됩니다. 챔버의 내부는 신경을 수용하고 조직을 둘러싼에서 분리 아래쪽 벽에 얇은 반원 홈 붙이 개방을 2cm 지름 오픈 잘됩니다.
- 챔버 첨부 전에 16 게이지 바늘이 심장에 경첩 근육 사이에 삽입하고 혈액 ~ 20cc가 동물에서 새겨 졌던 것입니다. 과다는 필요하지 않지만 시신경의 해부가 쉬워집니다.
- 시신경의 위치는 등딱지의 측면과 평균 눈 사이 약간 곡선 라인을 그리기로 추정된다.
- 원형 구멍이 다음 trephine으로 등딱지에서 절단합니다. 구멍이 잘 챔버와 같은 직경입니다. 구멍의 중심이 측면 눈과 신경이 잘의 복부 부분이 함께 실행되도록 라인에 약간의 지느러미에 앞쪽에 2-3cm에 위치해 있습니다.
- 신경이 완전히 가시 성과 조직을 둘러싼 및 기본에서 무료 때까지 결합 조직이 지워집니다.
- 스레드의 가닥은 신경 주위에 반복과 하단에있는 슬롯을 통해 챔버로 가져온 것입니다. 이 같은 열기를 통해 신경이 부드럽게 문자열 당겨 챔버로 안내합니다. 동시에 챔버가 잘 구멍에 삽입됩니다. 챔버는 다음 등딱지에 부착된입니다나사와 잘는 링어의 솔루션으로 가득합니다와.
- 챔버 첨부 후에 동물은 아가미를 통해 해수 가득한 탱크에 빛을 꽉 케이지에 배치됩니다.
- 우물 입체경 (SMZ - 168, 제드 펠라 병원)과 무명이 벗어나는로와 생리 혈액의 누출을 방지하기 위해 바닥에 구멍 주위 패딩입니다 아래의 시각이다.
- 신경 주위에 잔여 결합 조직이 미세 가위와 족집게로 제거하고, 챔버는 신선한 링어의 솔루션을 리필합니다.
- 별명은 신경을 캡슐이 개방을 통해 신경이 신중하게 잘 가위, 핀셋, 그리고 바늘 프로브를 사용하여 길이를 따라 desheathed있는 혈관에서 이루어집니다.
- 작은 섬유 다발은 수입 성의 섬유 레코딩을위한 눈에서 멀리 끝에와 efferent 섬유 레코딩을위한 눈에 가장 가까운 끝에있는 프로브 및 컷을 사용하여 신경에서 분리됩니다. 비디오에 도입 성의 섬유 레코딩을위한 끝이 절단됩니다.
- 링거스 솔루션 가득 microsuction 전극 (AM 시스템 병원)은 시신경 레코딩에 사용됩니다. 전극 팁은 1mm 직경 borosilicate 유리의 끝 부분이 모세관 연마 화재로 신경 번들로 장착되어 있습니다.
- 전극 팁은 수동으로 조작하는 사람 (WPI 병원)와 잘 챔버에 넣어 져서, 그리고 컷 섬유 번들은 끝에 빨려입니다. 흡입은 튜브를 통해 전극에 연결된 Gilmont의 주사기에 의해 제공됩니다.
- BNC 연결 신호 리드를 제공하고 소음을 줄이기 위해 전극을 감싸 은색 염화물 와이어는 참조 리드를 제공합니다. 두 연결은 신호 증폭 및 잡음 필터링 (X - 세포 3x4, FHC 부동산)에 대한 차동 증폭기의 머리 단계에 연결되어 있습니다. 앰프 출력은 컴퓨터 분석 및 저장에 대한보고 및 데이터 수집 카드를 오실로 스코프로 전송됩니다.
- 데이터는 LabView로 작성된 사용자 정의 프로그램을 수집하고 있습니다. 이 프로그램은 디지털 비디오 프로세서를 통해 빛을 자극을 제어 (비트 + +, 캠브리지 연구 시스템 병원)과 스파이크 열차를 기록하는 디지털 대못 discriminator (APM, FHC 병원)와 인터페이스. 라이트는 컴퓨터 제어 비디오 디스플레이를 통해 광섬유 광 파이프를 통해 또는 전체 눈에 눈을 단일 세포로 전달할 수 있습니다.
제 5 부 : Intraretinal 기록
이 절차에 필요한 도구는 드라이버, 나사 구멍이있는 L - 모양 lucite 플랫폼, 유리 피펫과 microelectrode 홀더, 스테인레스 스틸 나사, 핀셋, 그리고 벌금 메스를 포함합니다.
- 미리 나사 구멍이있는 수제 lucite 플레이트는 세포내 반응을 기록하는 데 사용됩니다. 구멍은 전동 micromanipulator (PPM5000, WPI 부동산)를 장착을위한 간격입니다. 접시는 두 측면에 나사와 위에 하나와 동물에 첨부되어 있습니다.
- 플레이트 부착 후 동물은 아가미를 통해 해수 가득한 탱크에 빛을 꽉 케이지에 배치됩니다.
- micropositioner은 눈 위에 정렬의 이동 팔과 함께 접시에 실수를합니다.
- 유리 micropipettes의 배치는 1 mm OD borosilicate 유리에서 나온되며 팁은 3M KCl 솔루션의 작은 유리병에 micropipettes을 배치하여 모세관 현상을 통해 backfilled 있습니다.
- pipettes의 나머지는 다음 소금 솔루션과 수동으로 작성하여 전극 홀더에 삽입됩니다.
- 전극 홀더는 micropositioner 암에 부착된 세포 앰프의 머리 단계 (IR - 283, 시그너스 기술 병원)에 연결되어 있습니다.
- 망막의 작은 섹션 (~ 1mm2)은 면도날과 각막 인터페이스를 멀리 절단하여 노출됩니다.
- 건조를 방지하고 micropipette 팁이 망막 조직에 개방을 통해 선진 있습니다 링어의 솔루션의 한 방울이 노출된 망막에 위치합니다.
- 팁이 솔루션을 입력하면 세포 내 앰프의 현재 분사 모드는 종사하고 전극 임피던스가 측정됩니다. 20-70 MW의 범위 외부 임피던스와 Micropipettes은 삭제됩니다. 이 범위들은 마이크론 단계에서 고급 전자 또는 기계 피펫 팁 진동에 의해 세포에 찔려 죽은 있습니다.
- 전지의 세 종류의 눈을 발생 수 있습니다. Retinular 세포가 빛을에만 depolarizing 반응을 보여, 편심 전지 depolarizing 응답 타고 액션 잠재력의 기차를 표시하고, 안료 세포가 전혀 빛을 응답을 표시하지 않습니다.
- 데이터는 Labview로 작성된 사용자 정의 프로그램을 수집하고 있습니다. 이 프로그램은 디지털 비디오 프로세서 (비트 + +, 캠브리지 연구 시스템)을 통해 빛의 자극을 제어합니다. 자극은 광섬유 파이프 또는 비디오 디스플레이 찔려 죽은 세포로 전달됩니다. 전압 응답은 오실로 스코프에서 관찰하고 컴퓨터 프로그램에 의해 디지털됩니다.
6 부 : 대표 결과
대표 에르그는 그림 2A에 표시됩니다. 파형의 표현 전기를 나타냅니다주로 photoreceptive retinular 세포의 빛에 반응은, 그들은 크게 편심 세포를 불공평하고 같은 전기 그들에게 결합하고 있습니다. 포유류의 에르그와 마찬가지로 다른 망막 세포 유형에서 여러 파형 구성 요소가 없습니다. Limulus의 두뇌에있는 시계의 Circadian 의견 시간이 (1)을 통해 변경할 에르그의 진폭과 시간 코스를 발생 매일 망막 세포의 생리 특성을 modulates. 그림 2B에 나타난 에르그 진폭은 주관적인 낮에는 동물의 주관적인 야간 및 낮은 중에 최고입니다.
불빛에 하나의 시신경 섬유 응답의 대표적인 추적은 그림 3에 표시됩니다. 편심 세포 모두 지속적인 수준으로 부패 다음 스파이크 방전 속도에서 과도 증가를 보여주는, 대략 같은 동작합니다. 속도 붕괴는 편심 전지 (2) 조명 적응 및 스파이크 종속적인 자기 억제의 통합 작업을 반영합니다. 이러한 속도의 빛 - 의존 감소와 같은 다른 스파이크 패턴은, Limulus 두뇌에서 볼 수 있지만 눈 (3). 아르
빛에 색소 세포, retinular 세포 및 편심 세포의 전압 응답의 대표적인 성분은 그림 4에 표시됩니다. 오직 후자의 두 망막 세포 유형은 시각입니다. 그들의 응답의 진폭 및 시간 과정은 녹음의 품질과 세포 내에 전극의 위치에 따라 달라집니다. 보통 전극 때문에 그들의 큰 크기와 수에의 안료 세포 또는 세포를 침투 retinular. 후자, 지속적인 수준으로 자연 붕괴 과도 탈분극가 기록되면. 부패는 retinular 세포에 의해 빛을 적응 (2)에 의한 것입니다. 전극은 편심 세포를 입력하면, 큰 행동 잠재력은 축삭 (40 - 70mV)와 소마 근처 depolarizing 파형 (<25mV)를 타고 작은 실천 잠재력에 기록됩니다.
그림 1. electroretinogram 기록 (A)와 시신경 기록 (B)에 사용되는 챔버의 도식 다이어그램. 바로 7mm 동일 B. A와 5mm
그림 2. 100ms에 의해 evoked Limulus 에르그의 예 추적은 어둠 속에서 5V의 펄스 (A) 및 지속적인 어둠 속에서 시간이 지남에 따라 에르그 진폭의 피크 - 투 - 피크 변동 (B)를 이끌었다. 암흑은 흰색 삼각형으로 표시된 시간에 시작되었다. 검은 삼각형으로 표시된 시간을 통해 에르그 진폭의 성장은 어둠 속에서 눈을 감도를 증가 조명 적응, 때문입니다. 에르그 진폭의 주기적 변화는 이후 그 동물의 내부 circadian 시계로 인해 발생합니다. B 시간 지점마다 5 분입니다.
그림 3. 시신경 섬유 응답의 예 추적은 단일 ommatidial 수용체에 떠올랐다 조명합니다. 추적 위의 파형은 자극 타이밍을 보여줍니다. 그의 axons 신경 섬유에 야기할 편심 세포는, 모든 실험 (총 어둠 속에서 5sec 플래시)의 조명 조건 하에서이 같은 사격과 비슷한 패턴을 보여줍니다. 스파이크와 망막 코딩은 재산 Limulus 다른 무척추 동물과는 달리, 포유류와 공통점을 가지고있다.
그림 4 전압 응답의 예 흔적이 Limulus 측면 눈에있는 세 가지 세포 유형의 빛이하려면 다음과 같이하십시오. 색소 세포 (A), retinular 세포 (B), 그리고 편심 셀 (C). 첫 번째 셀이 아닌 시각이다. 후자의 두 사람은 가벼운 플래시에 depolarize. 그들이 빛을 transduce하고 편심 셀을 간격 분기점을 통해 신호를 전송하기 때문에 탈분극는 길을 따라 일부 손실, retinular 전지 최대 규모입니다. 편심 세포에서 축삭에 의해 발사 작업 잠재력은 소마에 스파이크 backpropagation에 의한 탈분극 타고 볼 수 있습니다. 액션 잠재력의 진폭은 depolarizing 잠재력을 더 잘 볼 수 있도록 그림과 감쇠되었습니다. 세포의 휴식 잠재력은 - 50mV이다.
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Discussion
우리는 에르그 녹음, 시신경 녹음 및 생체내의 말굽 게에 intraretinal 레코딩을 수행하는 방법을 보여주고있다. 녹음 기술 각각 비전의 신경 기초로 다른 통찰력을 제공하고, 그들은 모든 게의 눈은 크고 어려운 등딱지 사는 동물 감사 망막의 기능을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 시신경의 활동도 자유롭게 전극의 적절한 건설 (4) 바다에서 동물 행동에서 기록하실 수 있습니다. 이러한 기술은 또한 설정의 사소한 변경과 excised 눈에 수행할 수 있습니다. 자연 조건 이러한 실험의 관련은 꽃게의 안구 변화의 생리적 특성이 동물 (5)에서 제거 때, 제한 될,하지만 수업이 값은 이러한 방법의 광범위한 사용 주어진 교육 실험실에 대한 좋은 것입니다 신경 과학.
에르그 녹음, 시신경 녹음 및 intraretinal 녹음 명확히하기 위해 별도 여기를 제시했다. 실제로 여러 녹음 방식은 종종 동시에 신경 활동의 변화와 하나 또는 둘 모두 측면 눈에 시각적 감도를 모니터링하는 하나의 실험 이내에 결합됩니다. 우리가 에르그 녹음에 사용할 작은 챔버은 다른 디자인을 통해 이러한 점에서 (1, 6)에 특히 유리합니다. 또한, 그것은 시간이 지남에 따라 밖으로 건조하고 있습니다 기존 윅 전극과 관련된 안정성 문제를 제거, 공기 밀폐되어 생리 식염수의 저수지를 개최하고 있습니다. 신경 레코딩을위한 설명한 동일한 절차 전극 대신에 신호 증폭기의 전기 자극기에 리드를 연결하여 신경 자극을 위해 사용될 수 있기 때문에 Limulus 가능한 비전 실험의 제품군이보다 훨씬 크다.
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Acknowledgments
저자는이 비디오 기사를 생산 그녀 도움 박사 Birgit 베르너을 인정하고 싶습니다. 이 연구는 NSF 경력 수상에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| LED | Light source | Newark Inc | 33C1292 | |
| Suction electrode | Electrode | A-M Systems | 573000 | |
| XCell 3*4-Channel Extracellular Amplifier | Amplifier | FHC, Inc. | 40-40-8B | |
| Intracellular Recording | Amplifier | Cygnus | IR-283A | |
| APM | Neural Spike Discriminator | FHC, Inc. | APM | |
| Bits++ | Video Board | Cambridge Research Systems | Bits++ | |
| Piezopatch Manipulator | Micropositioner | World Precision Instruments, Inc. | PPM5000 | |
| Square Pulse Stimulator | Nerve Stimulator | Grass Technologies | Model S48 | |
| P-97 | Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Borosilicate Glass Capillary | Electrode glass | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Horsesh– crab (Limulus polyphemus) | Animal | Marine Biological Laboratories | ||
| Micropipette Puller | Glass Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Zoom Stereoscope | Microscope | Jed Pella Inc. | SMZ-168 |
References
- Barlow, R. B. Jr Circadian rhythms in the Limulus visual system. J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).
- Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. Cell based model of the Limulus lateral eye. J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).
- Snodderly, D. M. Jr Processing of visual inputs by the brain of Limulus. J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).
- Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. Deciphering a neural code for vision. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).
- Barlow, R. B., Kaplan, E. Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye. Science. 174, 1027-1029 (1971).
- Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye. J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).
