Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Использование Подкова Краб, Limulus Полифема, В Vision Research

Published: July 3, 2009 doi: 10.3791/1384

Summary

В этом видео мы выполняем электроретинограмму записи оптических записи нерва и intraretinal записи с американской подковы краба,

Abstract

Американская подковы краба, Limulus Полифема является одним из старейших существ на земле, и животное продолжает играть незаменимую роль в биомедицинских исследованиях. Мало того, что их крови содержатся особые клетки, которые ученые используют для обнаружения bacteriotoxins в наших лекарств, но их глаза также содержат нейронной сети, которая обеспечила гораздо представление о физиологических процессах, работающих в нашей зрительной системы, такие, как адаптация к свету и бокового торможения. Подковы краба остается привлекательной моделью для зрения исследований, поскольку животное большое и выносливым для беспозвоночных, его нейронов сетчатки большие и легко доступным, его зрительная система компактна и хорошо изучен, и его визуальное поведение определено корректно. Кроме того, структура и функции глаза модулируются на ежедневной основе циркадных часов в мозге животных с. Короче говоря, зрительной системы мечехвостов достаточно прост для понимания еще достаточно сложными, чтобы быть интересным.

В этом видео мы представляем три парадигмы электрофизиологические исследования нейронных основе видения, которые могут быть выполнены в естественных условиях с Limulus. Они электроретинограмму записи оптических записи нерва и intraretinal записи. Электроретинограмму (ERG) записи меру с поверхности электрода подвел электрический ответ все ячейки в глаза на вспышку света. Они могут быть использованы для мониторинга общей чувствительности глаза для продления периода времени. Оптический нерв записи мера пики активности одиночных нервных волокон с внеклеточным электродом microsuction. Они могут быть использованы для изучения визуальные сообщения передаются от глаза к мозгу, а также циркадные часы-сообщения обратную от мозга к глазу. Intraretinal мера записей с внутриклеточной микроэлектрода колебаний напряжения индуцированного светом в отдельных клетках глаза. Они могут быть использованы для выяснения клеточных механизмов сетчатки обработки.

Protocol

Часть 1: экспериментальная подготовка

Экспериментальные процедур, выполняемых на мечехвостов были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета в Бостонском университете. Животные закупаются у морской биологический Labs (Woods Hole, штат Массачусетс) или в других аналогичных и размещены в газированных танк морской в ​​комнате подвергается регулируется свет-темнота цикла. Режим освещения имеет большое значение для увлекая циркадных часов краба и велосипедных глаз ежедневно между дневной и ночной государств. Непосредственно перед началом любых инвазивных процедур, животных охлаждается в ведерке со льдом на 10-15 минут, пока его движение замедляется, а затем крепится к деревянной платформе с двумя винтами из нержавеющей стали вставлен в головогруди и два в opisthosoma. Платформа взвешенный под гранитом, чтобы она тонет в воде. После терминал экспериментов животное усыпляют, погружая в лед суспензия снова и pithing мозга, которая лежит выше устья, с помощью скальпеля.

Часть 2: Решения

Решение Limulus Рингера состоит из 430 мМ NaCl, 9,56 мМ KCl, 9,52 CaCl2 мМ, 9,97 MgCl2 мМ, 21,05 мМ MgSO4, 50 мкм ТЭС, 50 мкм HEPES, и 10 мл / л Пен-Strep смеси (пенициллин, стрептомицин, 10000 ед / мл) .

Часть 3: Запись электроретинограмму

Инструменты, необходимые для этой процедуры включают отвертка, вазелин, раствор Рингера, передачи пипетки, зеленый светодиод, записи камеры, винты из нержавеющей стали, и ватным тампоном.

  1. Ручная камера используется для записи ЭРГ (рис. 1А). Камера тела предназначен для хранения солевого водохранилища в контакте с глазом. Крышка содержит хлорид серебряной проволоки для соединения проводящих решение усилитель и небольшое отверстие размером для размещения светодиода. Ultrabright светодиод с пиком излучения вокруг 520nm работает лучше всего.
  2. Для начала, нижняя палата покрыта вазелин и закреплены за глаза с помощью двух винтов.
  3. Затем камера, заполненная солевым и закрыты крышкой.
  4. После камеры привязанности краб находится в светонепроницаемый клетке в аквариуме с морской водой в течение жабры.
  5. Светодиодные кабеля вставляется в камеру крышкой.
  6. Сигнал привести обрезается на хлористый провода, и ссылки привести обрезается на один из имплантированных винтов.
  7. Оба провода подключены к голове этапе высокоимпедансное дифференциального усилителя (X-клеток 3х4, FHC Inc) для усиления сигнала и усилителем фильтр установлен пройти частоты ниже 10 Гц.
  8. Выхода усилителя подается на осциллограф для просмотра и к плате сбора данных для компьютерного анализа и хранения данных.
  9. После установки клетке закрытой двери комнаты, чтобы блокировать свет от достижения животного.
  10. Данные собираются с помощью специального программа, написанная на LabView. Программа мигает светодиод, записи вызвала ERG сигнала, а также меры пик-пик АЧХ. Выбор парадигмы вспышки зависит от экспериментальных целей. Например, краткая (100 мс) импульсов 5В применяются каждые 10 минут, чтобы избежать светодиодные световые эффекты адаптации при наблюдении за циркадные изменения в чувствительности глаза.

Часть 4: оптический нерв записи

Инструменты, необходимые для этой процедуры включают отвертки, нитки, трепан, раствор Рингера, rongeurs, vannas ножницы, записи камеры, изогнутые щипцы, тонкие иглы зондов, тупой скальпель, хирургические ножницы, и всасывания электрода.

  1. Ручная камера используется для записи оптических ответы нерва (рис. 1В). Интерьер камера 2 см диаметром открытых хорошо, что есть тонкие полукруглые прорези открытия в нижней стенке для размещения нерва и изолировать его от окружающих тканей.
  2. Перед камерой привязанность 16-игла вставляется между шарниром мышцы в сердце и ~ 20cc крови, стекающую из животных. Кровотечения не нужно, но делает зрительный нерв рассечение легче.
  3. Расположение зрительного нерва оценивается, опираясь на панцире слегка изогнутые линии между боковой и средний глаз.
  4. Круглое отверстие затем разрезается в панцире с трепаном. Отверстие диаметром, равным диаметру камеры хорошо. Центре отверстие расположено 2-3 см впереди боковых глаза и слегка спины к линии так, что нерв проходит вдоль брюшной части хорошо.
  5. Соединительная ткань очищается, пока нерв полностью видны и свободно от окружающих и подлежащих тканей.
  6. Прядь поток петлей вокруг нервов и потянули в камеру через щель в нижней части. С помощью этого же открытия нерв мягко руководствоваться в камеру, потянув за строку. В то же время камера также вставляется в отверстие. Затем камера прикреплена к панцирьс винтами и яма заполняется раствором Рингера.
  7. После камеры привязанность животного помещается в светонепроницаемый клетке в аквариуме с морской водой в течение жабры.
  8. Хорошо визуализируются в стереоскоп (СМЗ-168, Джед Пелла Inc) и хлопковые заполняется вокруг отверстия в нижней части, чтобы предотвратить утечку из крови в солевой и из камеры.
  9. Остаточная соединительной ткани вокруг нерв удален с мелкими ножницы и пинцет, и камеры наполняются свежим решением Рингера.
  10. Ника производится в кровеносный сосуд, который инкапсулирует нерва и через это отверстие нерва тщательно desheathed по всей его длине с использованием тонких ножницы, пинцеты, иглы и зонды.
  11. Крошечная расслоение отделена от нервов с помощью зонда и вырезать в конце удаленной от глаз для записи афферентные волокна, а в конце ближе к глазу для записи эфферентные волокна. В конце видео для записи афферентные волокна разреза.
  12. Электрод microsuction (AM Systems Inc), заполненную раствором Рингера используется для записи оптических нервов. Электрод устанавливается на нервный пучок огнем полировки конце стекла диаметр 1 мм боросиликатного капилляра.
  13. Электрод опускают в камеру и с помощью ручного манипулятора (WPI Inc), и сократить расслоение втягивается в наконечник. Всасывающая обеспечивается шприц Gilmont подключен к электроду через трубки.
  14. BNC-подключение обеспечивает сигнал свинца и серебряной проволоки хлорида обернутые вокруг электрода для снижения уровня шума обеспечивает ссылки свинца. Два провода подключены к голове стадии дифференциальный усилитель для усиления сигнала и шумовой фильтр (X-клеток 3х4, FHC Inc). Выходе усилителя передается на осциллограф для просмотра и карты сбора данных для компьютерного анализа и хранения данных.
  15. Данные собираются с помощью специального программа, написанная на LabView. Программа контролирует световой раздражитель через цифровой видеопроцессор (биты + +, Cambridge Research Systems Inc) и взаимодействия с цифровым шип дискриминатора (APM, FHC Inc), которая записывает шип поездов. Свет может быть доставлен в одиночных камерах в глаза с помощью волоконно-оптический световод или весь глаз с помощью управляемых компьютером отображения видео.

Часть 5: Intraretinal записи

Инструменты, необходимые для этой процедуры включают отвертка, Г-образной платформой плексигласа с резьбовыми отверстиями под винты, микроэлектрода держатель стеклянной пипетки, винты из нержавеющей стали, пинцет, и штраф скальпеля.

  1. Ручной пластина плексигласа с заданными крепежные отверстия используется для записи внутриклеточных реакций. Отверстия расположены для монтажа моторизованных микроманипулятора (PPM5000, WPI Inc). Пластина крепится к животным с помощью двух винтов на стороне и один на вершине.
  2. После пластину привязанность животного помещается в светонепроницаемый клетке в бак, наполненный морской водой за жабры.
  3. Micropositioner вкручивается в пластину, с его подвижным руку выровнены над глазом.
  4. Партию стекла микропипетки берутся из 1-мм OD боросиликатного стекла и советы засыпается через капиллярное действие путем размещения микропипетки в небольшой пузырек решения 3M KCl.
  5. Остальные пипетки затем заполняется вручную с помощью солевого раствора и вставляется в держатель электрода.
  6. Держателя электрода подключен к голове стадии внутриклеточного усилителя (ИК-283, Cygnus Technology Inc), наложенных на micropositioner руку.
  7. Крошечная часть сетчатки (~ 1mm2) подвергается путем убирания роговицы интерфейс с лезвия бритвы.
  8. Каплю раствора Рингера размещается на открытых сетчатки для предотвращения высыхания и кончик микропипетки выдвигается через отверстие в ткани сетчатки.
  9. Когда кончик входит решение, текущий режим введения внутриклеточных усилитель занимается и электродов сопротивление измеряется. Микропипетки с импедансом вне диапазона 20-70 МВт, отбрасываются. Те, в этом диапазоне являются передовыми в сфере микрон шаги и насаженные на ячейки, вибрирующим кончиком пипетки электронным или механическим способом.
  10. Три типа клеток могут возникнуть в глаза. Retinular клетки показывают только деполяризующего реакции на свет, эксцентричный клетки показывают поезд потенциалов действия верхом на деполяризующего ответа, пигментные клетки и показать, нет света реагирования на всех.
  11. Данные собираются с помощью специального программа, написанная на LabVIEW. Программа контролирует световой раздражитель через цифровой видеопроцессор (биты + +, Cambridge Research Systems). Раздражители поступают в клетки с насаженными волоконно-оптической трубы или отображения видео. Напряжение ответы наблюдаются на экране осциллографа и оцифровывается программу на компьютер.

Часть 6: Представитель Результаты

Представитель ERG показано на рисунке 2А. Сигнал представляет подведены электрическиеответ на свет в первую очередь photoreceptive retinular клетки, так как они значительно больше, чем эксцентричный клеток и электрически связаны с ними. Есть не несколько компонентов сигнала из разных типов клеток сетчатки, как и у млекопитающих ERG. Суточный обратная связь с часами в мозг Limulus модулирует физиологические свойства клеток сетчатки на ежедневной основе, в результате чего амплитуда и время хода ERG меняться с течением времени (1). Как показано на Рисунке 2Б, ERG амплитуда является самым высоким в течение субъективных ночь животного и самые низкие в субъективном день.

Представитель след одного оптического волокна нерва ответ на свет показано на рисунке 3. Эксцентричный клетки ведут себя примерно так же, показывая, преходящее повышение скорости разряда шип затем распадаются на устойчивый уровень. Скорость распада отражает комбинированное действие света адаптации и спайк-зависимой самостоятельно торможение на эксцентриковых клетки (2). Другие модели шип, таких как свет зависит от снижения ставки, видны в Limulus мозга, но не глаз (3).

Представитель следы напряжения реакция пигмента клетки, retinular клетки, и эксцентричный ячейку света показаны на рисунке 4. Только два последних типов клеток сетчатки являются визуальными. Амплитудных и временных ходе их реакция зависит от качества записи и расположения электродов внутри клетки. Как правило, электрод проникает пигментные клетки или клетки retinular из-за их большого размера и числа. В последнем случае переходные деполяризации, что распадается на устойчивый уровень записывается. Распад происходит из-за световой адаптации к retinular клетки (2). Если электрод входит эксцентричный клетки, большие потенциалы действия записываются в аксон (40-70mV) и малых потенциалов действия верхом на деполяризующего сигнала (<25mV) вблизи сомы.

Рисунок 1
Рисунок 1. Принципиальные схемы камеры, используемые для электроретинограмму записи () и зрительного нерва записи (B). Бар равна 7 мм в 5 мм и в B.

Рисунок 2
Рисунок 2. Пример следов Limulus ERG вызванные 100 мс Светодиодные импульсом 5В в темноте () и пик-пик колебаний амплитуды ЭРГ в течение долгого времени в постоянной темноте (Б). Тьма была начата в срок, указанный на белый треугольник. Рост амплитуды ЭРГ через время, указанное на черный треугольник из-за световой адаптации, что повышает чувствительность глаз в темноте. Циклическое изменение амплитуды ЭРГ после этого происходит из-за внутренних циркадных часов животного. Время точек в Б каждые 5 мин.

Рисунок 3
Рисунок 3. Пример следов оптических ответ нервного волокна на свет вспыхнул на одном омматидия рецепторов. Сигнал выше кривая показывает стимул времени. Эксцентричный клетки, аксоны которых приводит к нервным волокнам, все показывают аналогичную картину в огонь, как это под освещение условиях эксперимента (5сек вспышкой в ​​полной темноте). Сетчатки кодирования с шипами является собственностью Limulus имеет общего с млекопитающими, в отличие от других беспозвоночных.

Рисунок 4
Рисунок 4 Пример следы напряжения ответ на свет из трех типов клеток, присутствующих в Limulus боковых глаз. Пигмент клетки (), retinular клетки (B), и эксцентричный ячейки (C). Первая ячейка не является визуальным. Последние два деполяризовать на световую вспышку. Деполяризации является крупнейшим для retinular клетки, потому что они преобразовывать свет и посылать сигнал через щелевые контакты с эксцентричным клетки, с некоторой потерей на этом пути. В эксцентричной клетки, потенциалы действия выпущенные аксоны видны верхом на деполяризации из-за шип обратного распространения на сомы. Амплитуды потенциалов действия была ослаблена цифра для более удобного просмотра деполяризующего потенциал. Потенциал покоя клетки-50 мВ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы показали, как выполнять ERG записи, записи оптических нервов, и intraretinal записей на мечехвостов в естественных условиях. Запись методы каждого предоставляют различные понимания нейронных основе видения, и все они могут быть использованы для изучения функции сетчатки в живых благодаря животных большие глаза краба и жесткий панцирь. Оптическая активность нерва может быть даже записал с себя свободно животных в океане при правильном строительстве электродов (4). Эти методы также могут быть выполнены на вырезали глаза с небольшой модификацией установки. Актуальность таких экспериментов по естественным условием будет ограничено, так как физиологические свойства глаза изменения краба при снятии с животными (5), но учебные значение было бы здорово для обучения лаборатории дано широкое применение этих методов в нейронауки.

ERG записи оптических записи нерва и intraretinal записи были представлены отдельно здесь для ясности. На практике несколько методов записи часто объединяются в рамках одного эксперимента, чтобы одновременно следить за изменениями в нервной деятельности и зрительной чувствительности в одной или обеих боковых глаз. Небольшой камере мы используем для записи ЭРГ особенно выгодно в этом отношении по сравнению с другими конструкций (1, 6). Более того, она имеет резервуар солевой раствор, который изолирован от воздуха, что исключает проблемы со стабильностью, связанных с обычными электродами фитиль, который может иссякнуть в течение долгого времени. Набор возможных экспериментов видение с Limulus даже больше, чем это, потому что те же процедуры, описанные для нервов записи может быть использован для стимуляции нерва при подключении электрода приводит к электрическим стимулятором вместо сигнала усилителя.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Вернера Биргит за помощь в производстве этого видео статьи. Это исследование было профинансировано премию КАРЬЕРА NSF.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
LED Light source Newark Inc 33C1292
Suction electrode Electrode A-M Systems 573000
XCell 3*4-Channel Extracellular Amplifier Amplifier FHC, Inc. 40-40-8B
Intracellular Recording Amplifier Cygnus IR-283A
APM Neural Spike Discriminator FHC, Inc. APM
Bits++ Video Board Cambridge Research Systems Bits++
Piezopatch Manipulator Micropositioner World Precision Instruments, Inc. PPM5000
Square Pulse Stimulator Nerve Stimulator Grass Technologies Model S48
P-97 Micropipette Puller Sutter Instrument Co. Model P-97
Borosilicate Glass Capillary Electrode glass World Precision Instruments, Inc. 1B150-4
Horsesh– crab (Limulus polyphemus) Animal Marine Biological Laboratories
Micropipette Puller Glass Puller Sutter Instrument Co. P-97
Zoom Stereoscope Microscope Jed Pella Inc. SMZ-168

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barlow, R. B. Jr Circadian rhythms in the Limulus visual system. J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).
  2. Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. Cell based model of the Limulus lateral eye. J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).
  3. Snodderly, D. M. Jr Processing of visual inputs by the brain of Limulus. J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).
  4. Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. Deciphering a neural code for vision. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).
  5. Barlow, R. B., Kaplan, E. Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye. Science. 174, 1027-1029 (1971).
  6. Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye. J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).

Tags

Neuroscience выпуск 29 электроретинограмму внутриклеточной регистрации внеклеточные записи сетчатки
Использование Подкова Краб,<em> Limulus Полифема</em>, В Vision Research
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, J. S., Passaglia, C. L. UsingMore

Liu, J. S., Passaglia, C. L. Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research. J. Vis. Exp. (29), e1384, doi:10.3791/1384 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter