Summary
في هذا الفيديو نقوم تسجيل مخطط كهربية الشبكية ، العصب البصري تسجيل ، وتسجيل intraretinal مع السلطعون على شكل حدوة حصان الأميركية ،
Abstract
سلطعون الأمريكية حدوة حصان ، الليمول Polyphemus هو واحد من أقدم المخلوقات على وجه الأرض ، والحيوانات لا تزال تلعب دورا لا غنى عنه في مجال البحوث الطبية الحيوية. ليس فقط لا تحتوي على خلايا الدم الخاصة التي تستخدم للكشف العلماء bacteriotoxins في الأدوية لدينا ، ولكن عيونهم تحتوي أيضا على شبكة العصبية التي قدمت نظرة الكثير عن العمليات الفسيولوجية التي تعمل في نظامنا البصرية ، مثل التكيف مع الضوء وتثبيط الجانبية. سلطعون حدوة حصان لا تزال نموذجا جذابا للبحوث الرؤية لأن الحيوان الكبيرة وهاردي لاللافقارية ، الخلايا العصبية في الشبكية هي كبيرة ويمكن الوصول إليها بسهولة ، ونظامها البصرية المدمجة ودرس على نطاق واسع ، ويعرف جيدا سلوكها البصرية. وعلاوة على ذلك ، فإن هيكل وظيفة من وظائف العيون منظم على أساس يومي من الساعة اليومية في دماغ الحيوان ق. وباختصار ، فإن النظام البصري للسرطان حدوة بسيطة بما يكفي لتكون مفهومة حتى الآن معقدة بما يكفي لتكون مثيرة للاهتمام.
في هذا الفيديو نقدم ثلاثة نماذج الكهربية عن التحقيق في الأساس العصبي للرؤية التي يمكن القيام بها في الجسم الحي مع الليمول. انهم تسجيل مخطط كهربية الشبكية ، العصب البصري تسجيل ، وتسجيل intraretinal. مخطط كهربية الشبكية (أرج) تسجيلات قياس مع سطح القطب لخص الاستجابة الكهربائية لجميع الخلايا في العين إلى ومضة من الضوء. يمكن استخدامها لرصد حساسية الشاملة للعين لإطالة فترات من الزمن. تسجيلات العصب البصري قياس النشاط المتصاعد من الألياف العصبية واحد مع إلكترود microsuction خارج الخلية. يمكن استخدامها لدراسة نقل الرسائل البصرية من العين إلى الدماغ وكذلك الإيقاعية على مدار الساعة رسائل يتم تغذيته من الدماغ إلى العين. Intraretinal تسجيلات قياس مع microelectrode الخلايا تقلبات الجهد الناجم عن ضوء في الخلايا الفردية من العين. يمكن استخدامها لتوضيح الآليات الخلوية معالجة الشبكية.
Protocol
الجزء 1 : إعداد التجريبي
وقد تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية التي أجريت على سرطان حدوة حصان من رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية استخدم في جامعة بوسطن. ويتم شراء الحيوانات من مختبرات البيولوجية البحرية (وودز هول ، MA) أو أي مركز آخر ووضعها في خزان المياه المالحة في غرفة الهوائية تتعرض لدورة الظلام الخفيف للتنظيم. ونظام الإضاءة من المهم للساعة الجر السلطعون والإيقاعية وركوب الدراجات العين يومية بين دولها النهار والليل. مباشرة قبل البدء في أي إجراءات الغازية ، ويتم تبريد هذا الحيوان في دلو الثلج لمدة 10-15 دقيقة حتى يتم إبطاء حركته والمضمون ثم إلى منصة خشبية مع اثنين من الفولاذ المقاوم للصدأ المسامير إدراجها في prosoma واثنان في opisthosoma. ومن المرجح منصة تحت الجرانيت مع المصارف بحيث أنه في الماء. بعد عدة تجارب المحطة هو الموت الرحيم للحيوان عن طريق غمر الجليد في الطين مرة أخرى وبخع الدماغ ، والتي تقع فوق الفم ، مع مشرط.
الجزء 2 : حلول
ويتألف الحل الليمول رينغر من 430 مم كلوريد الصوديوم ، 9.56 ملي بوكل ، 9.52 ملي CaCl2 ، 9.97 ملي MgCl2 ، 21.05 ملي MgSO4 ، 50μM TES ، HEPES 50μM و10ML / L القلم بكتيريا مزيج (البنسلين ، الستربتوميسين ، ووحدات 10000 / مل) .
الجزء 3 : تسجيل مخطط كهربية الشبكية
الأدوات اللازمة لهذا الإجراء تشمل مفك ، الفازلين ، والحل رينغر ، ماصة نقل ، وهو باللون الأخضر ، وغرفة تسجيل ، ومسامير الصلب المقاوم للصدأ ، ومسحة القطن.
- ويستخدم غرفة اليدوية لتسجيل ERG (الشكل 1A). صمم الجسم الغرفة لعقد خزان المياه المالحة في اتصال مع العين. غطاء يحتوي على كلوريد الفضة سلك توصيل الحل الموصلة الى مكبر للصوت ، وثقب صغير الحجم لاستيعاب الصمام. وultrabright الصمام مع الانبعاثات ذروتها حوالي 520nm يعمل بشكل أفضل.
- للبدء ، وهي مغلفة الجانب السفلي من الغرفة مع الفازلين والمضمون فوق العين مع اثنين من البراغي.
- ثم تملأ الغرفة مع المالحة وتوج مع غطاء.
- بعد المرفق الغرفة وضعت في قفص سلطعون ضوء محكم في صهريج مليئة بمياه البحر خلال الخياشيم.
- يتم إدراج كبل الصمام في غطاء غرفة.
- يتم قص يؤدي إشارة إلى سلك كلوريد ، ويتم قص تؤدي الإشارة إلى واحد من المسامير مزروع.
- وترتبط كل من يقود إلى مرحلة رأس الفرق مكبر للصوت عالي المعاوقة (X - الخلية 3x4 ، FHC المؤتمر الوطني العراقي) لتضخيم الإشارات ويتم تعيين مرشح لتمرير مكبر ترددات تحت 10Hz.
- ويتم تغذية الإخراج مكبر للصوت الى الذبذبات للاطلاع والحصول على لوحة البيانات للتحليل وتخزين الكمبيوتر.
- بعد الإعداد يتم إغلاق باب القفص لحجب الضوء من الوصول الى غرفة الحيوان.
- يتم جمع البيانات مع برنامج مخصص المكتوبة في LABVIEW. برنامج يومض الصمام ، وسجلات أثار ERG إشارة ، ويقيس مدى استجابة الذروة إلى الذروة. اختيار نموذج فلاش يعتمد على الهدف التجريبية. على سبيل المثال ، تطبيق وجيزة (100ms) نبض 5V كل 10 دقائق لتجنب آثار الصمام ضوء التكيف عند رصد التغيرات اليومية في حساسية العين.
الجزء 4 : العصب البصري تسجيل
الأدوات اللازمة لهذا الإجراء تشمل مفك ، والخيط ، منقب أ ، حل رينغر ، rongeurs ، مقص vannas ، وغرفة تسجيل ، ملقط المنحني ، تحقيقات إبرة رفيعة ، ومملة مشرط ، مقص جراحي ، ومسرى الشفط.
- ويستخدم غرفة اليدوية لتسجيل ردود العصب البصري (1B الشكل). المناطق الداخلية من الغرفة 2cm القطر بئر مفتوحة يحتوي على رقيقة الهلالية فتح مشقوق في الجدار السفلي لاحتواء الأعصاب وعزلها عن الأنسجة المحيطة.
- الغرفة قبل الحجز يتم إدخال إبرة عيار 16 بين المفصلي في عضلات القلب وينضب ~ 20cc الدم من الحيوان. استنزاف ولكن ليس من الضروري تشريح العصب البصري يجعل من الأسهل.
- ويقدر موقع العصب البصري من خلال الاعتماد على درع خط منحن قليلا بين العيون الجانبية وسيطة.
- ثم يتم قطع ثقب دائري في درع مع منقب. ثقب قطره هو نفس الغرفة أيضا. يقع في وسط حفرة 2-3 سم الأمامي للعين والظهرية الوحشية قليلا إلى خط بحيث يمتد على طول العصب الجزء البطني من البئر.
- يتم مسح النسيج الضام حتى العصب مرئيا تماما وخالية من الأنسجة المحيطة والكامنة.
- ويحلق حبلا من الصفحات حول العصب وانسحبت الى داخل القاعة من خلال فتحة في الجزء السفلي. من خلال هذا الانفتاح نفسه وتسترشد بلطف العصب في الغرفة عن طريق سحب على السلسلة. في الوقت نفسه غرفة البئر يتم إدراجها في حفرة. ومن ثم اضافته الى درع الغرفةمع مسامير ويتم تعبئة جيدا مع الحل رينغر.
- بعد المرفق الغرفة وضعت الحيوان في قفص محكم الضوء في صهريج مليئة بمياه البحر خلال الخياشيم.
- البئر هو تصور تحت المجسام (SMZ - 168 ، جد شركة بيلا) والقطن مبطن حول فتحة في الجزء السفلي لمنع تسرب الدم إلى والمياه المالحة للخروج من القاعة.
- تتم إزالة النسيج الضام المتبقية حول العصب مع مقص وملاقط دقيقة ، ويتم تعبئتها في غرفة مع الحل رينغر الطازج.
- يتم إجراء نك في الاوعية الدموية التي بتغليف العصب ومن خلال هذا الانفتاح هو desheathed بعناية على طول العصب طوله باستخدام مقص غرامة ، وملاقط ، وتحقيقات الإبرة.
- يتم فصل ربطة صغيرة من الألياف العصبية باستخدام مسبار وقطع في نهاية أبعد من العين لتسجيل والألياف وارد في نهاية الأقرب إلى العين لتسجيل صادر من الألياف. في شريط الفيديو هو قطع النهاية لتسجيلات الألياف وارد.
- ويستخدم الكهربائي microsuction (AM سيستمز) مملوءة بمحلول قارعو الأجراس لتسجيل العصب البصري. يتم تركيب طرف القطب إلى حزمة الأعصاب بنيران تلميع الزجاج نهاية 1MM البورسليكات قطرها الشعرية.
- يتم تخفيض رأس الكهربائي في الغرفة جيدا مع تتلاعب اليدوية (WPI المؤتمر الوطني العراقي) ، وامتص حزمة الألياف مقطعة إلى الحافة. يتم توفيرها بواسطة حقنة شفط Gilmont متصلا الكهربائي عبر الأنابيب.
- اتصال BNC يوفر الرصاص إشارة وسلك كلوريد الفضة ملفوفة حول القطب للحد من الضوضاء يوفر قيادة المرجعية. هناك علاقة بين هذا يؤدي اثنين إلى مرحلة رأس الفرق مكبر للصوت لتضخيم الإشارات والضوضاء تصفية (X - الخلية 3x4 ، FHC المؤتمر الوطني العراقي). يتم إرسال الإخراج إلى مكبر للصوت الذبذبات للاطلاع والحصول على بطاقة البيانات للتحليل وتخزين الكمبيوتر.
- يتم جمع البيانات مع برنامج مخصص المكتوبة في LABVIEW. برنامج التحكم المنبهات الخفيفة عن طريق معالج الفيديو الرقمي (بتات + + ، كامبريدج لأبحاث سيستمز) واجهات مع ارتفاع الممي الرقمية (APM ، FHC المؤتمر الوطني العراقي) الذي يسجل ارتفاعا القطارات. يمكن تسليمها الضوء على الخلايا واحد في العين عبر أنابيب الألياف البصرية أو الضوء إلى العين بأكمله عن طريق عرض الفيديو الكمبيوتر التي تسيطر عليها.
الجزء 5 : تسجيل Intraretinal
الأدوات اللازمة لهذا الإجراء تشمل مفك ، وهو على شكل حرف L منصة وسيت مع فتحات المسامير مترابطة ، حامل microelectrode مع ماصة الزجاج ، ومسامير الصلب المقاوم للصدأ ، ملاقط ، ومشرط الغرامة.
- يتم استخدام صفيحة وسيت اليدوية مع فتحات المسامير مسبقا لتسجيل استجابات الخلايا. الثقوب متباعدة عن شن micromanipulator بمحركات (PPM5000 ، WPI المؤتمر الوطني العراقي). وتعلق لوحة للحيوان مع اثنين من البراغي على جانب واحد على القمة.
- بعد مرفق لوحة وضعت للحيوان في قفص محكم الضوء في صهريج مليئة بمياه البحر خلال الخياشيم.
- هو مشدود للmicropositioner في لوحة ، مع ذراعها المنقولة الانحياز على مدى العين.
- يتم سحب دفعة من الزجاج micropipettes من 1 ملم الزجاج البورسليكات OD وردم النصائح عبر العمل الشعري من خلال وضع micropipettes في قارورة صغيرة من بوكل حل 3M.
- ثم تملأ بقية ماصات يدويا مع محلول الملح وإدراجها حامل الكهربائي.
- توصيل حامل القطب إلى مرحلة رئيس مكبر للصوت داخل الخلايا (IR - 283 ، كوكبة الدجاجة التكنولوجيا المؤتمر الوطني العراقي) الملصقة على ذراع micropositioner.
- يتعرض قسم ضئيل من شبكية العين (~ 1mm2) بعيدا عن طريق قطع القرنية واجهة بشفرة حلاقة.
- يتم وضع قطرة من محلول رينغر على شبكية العين تتعرض لمنع جفاف ومتقدمة micropipette غيض من خلال فتح في أنسجة الشبكية.
- عندما يدخل طرف في الحل ، وتشارك في وضع الحقن الحالية مكبر للصوت داخل الخلايا ويتم قياس المعاوقة الكهربائي. يتم تجاهل Micropipettes مع مقاومة خارج نطاق 20-70 ميغاواط. تلك هي المتقدمة في هذا النطاق في الخطوات ميكرون ومخوزق في الخلايا التي تهتز غيض ماصة إلكترونيا أو ميكانيكيا.
- قد يكون واجه ثلاثة أنواع من الخلايا في العين. خلايا Retinular تظهر فقط استجابة depolarizing للضوء ، والخلايا الشاذة تظهر امكانات العمل قطار ركوب على استجابة depolarizing ، والخلايا الصبغية لا تظهر أي استجابة ضوء على الإطلاق.
- يتم جمع البيانات مع برنامج مخصص المكتوبة في LABVIEW. برنامج التحكم المنبهات الخفيفة عن طريق معالج الفيديو الرقمي (بتات + + ، نظم البحوث كامبردج). يتم تسليم المحفزات لخلايا مخوزق مع الأنابيب من الألياف البصرية أو عرض الفيديو. ولوحظت ردود الجهد على الذبذبات والرقمية بواسطة برنامج على جهاز الكمبيوتر.
الجزء 6 : النتائج الممثل
ويرد ERG ممثل في الشكل 2A. الموجي يمثل الكهربائية لخصردا على ضوء الخلايا في المقام الأول retinular مستقبل للضوء ، كما أنهم يفوقون كثيرا من خلايا شاذة وتقترن بها كهربائيا. ليست هناك عناصر متعددة من الموجي أنواع مختلفة من الخلايا في شبكية العين كما هو الحال مع أرج الثدييات. ملاحظات الإيقاعية من ساعة في الدماغ الليمول ينظم الخصائص الفسيولوجية للخلايا الشبكية على أساس يومي ، مما تسبب في دورة السعة ووقت أرج أن تختلف مع مرور الوقت (1). كما هو مبين في الشكل 2B ، ERG السعة هي الأعلى خلال الليل الحيوان ذاتي وأقل خلال النهار ذاتي.
ويظهر تتبع ممثل واحد من الألياف البصرية العصبية استجابة للضوء في الشكل 3. خلايا شاذة تتصرف كافة تقريبا نفس ، مما يدل على زيادة عابرة في ارتفاع معدل التصريف تليها تسوس إلى مستوى مستدام. اضمحلال معدل يعكس العمل المشترك للتكيف ضوء تصاعد والتي تعتمد على الذات ، على تثبيط الخلايا الشاذة (2). وينظر إلى أنماط أخرى السنبلة ، مثل الضوء التي تعتمد على انخفاض في المعدل ، في الدماغ الليمول ولكن ليس في العين (3)
وتظهر آثار ممثل الجهد استجابة لخلية خلية الصباغ ، retinular الخلية ، وغريب الأطوار إلى النور في الشكل 4. فقط هذين النوعين الأخيرين هي خلايا شبكية بصرية. دورة السعة ووقت استجابتها يعتمد على نوعية التسجيل وموقع القطب داخل الخلية. عادة ، القطب تخترق الخلايا الصبغية أو خلايا retinular بسبب كبر حجمها وعددها. إذا تم تسجيل هذا الأخير ، وهو الاستقطاب الذي يضمحل عابرة إلى مستوى مستدام. اضمحلال يرجع إلى التكيف مع الضوء من قبل خلايا retinular (2). إذا كان القطب يدخل خلية غريب الأطوار ، وتسجل امكانات كبيرة في العمل محوار (40 70mV) وإمكانات العمل على ركوب صغيرة الموجي depolarizing (<25mV) بالقرب من سوما.
الشكل 1. المخططات تخطيطي الغرف المستخدمة لتسجيل مخطط كهربية الشبكية (A) والعصب البصري تسجيل (B). شريط يساوي 7mm في A و 5mm في B.
الشكل 2. LED تتبع مثال لأرج الليمول أثار من قبل 100ms نبض 5V في الظلام (A) ، وتذبذب الذروة إلى الذروة في الاتساع مع مرور الوقت ERG في ظلام مستمر (B). بدأ الظلام في الوقت الذي يحدده مثلث أبيض. النمو في السعة أرج من خلال الوقت الذي يحدده المثلث الأسود يرجع إلى التكيف مع الضوء ، مما يزيد من حساسية العين في الظلام. الاختلاف في دوري السعة أرج وبعد ذلك بساعة بسبب الحيوان الإيقاعية الداخلية. نقطة في وقت وباء كل 5min.
الشكل 3. الضوء تومض تتبع مثال على استجابة العصب الألياف البصرية على مستقبلات a ommatidial واحد. الموجي أعلاه يظهر تتبع توقيت التحفيز. الخلايا الشاذة ، التي تؤدي إلى محاور الألياف العصبية ، وكلها تدل على نمط مماثل لاطلاق النار وهذا في ظل ظروف إضاءة التجربة (5sec فلاش في ظلام دامس). ترميز الشبكية مع التموج هو الليمول الملكية ومشتركة مع الثدييات ، على عكس غيرها من اللافقاريات.
الشكل 4 آثار مثال للاستجابة إلى الجهد ضوء الحاضر ثلاثة أنواع الخلايا في العين الوحشي الليمول : الخلايا الصبغية (A) ، خلية retinular (B) ، والخلايا الشاذة (C). الخلية الأولى هي غير مرئية. الاخيران يزيل الاستقطاب على ومضة ضوء. فقد الاستقطاب هو أكبر لخلايا retinular لأنهم تنبيغ الضوء وإرسال إشارة من خلال تقاطعات الفجوة إلى الخلية غريب الأطوار ، مع فقدان بعض على طول الطريق. في الخلية غريب الأطوار ، وينظر إلى إمكانات العمل التي أطلقها محوار ركوب على الاستقطاب بسبب ارتفاع backpropagation في سوما. وقد اتساع امكانات العمل الموهن في الشكل لرؤية أفضل للإمكانات depolarizing. إمكانات الراحة للخلايا ، 50mV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد بينت لنا كيفية تنفيذ تسجيلات أرج والتسجيلات العصب البصري ، وتسجيلات intraretinal على شكل حدوة حصان السرطانات في الجسم الحي. تقنيات تسجيل كل تقدم رؤى مختلفة في الأساس العصبي للرؤية ، ويمكن أن تستخدم كل ما لدراسة وظيفة في شبكية العين بفضل الحيوانات الحية لعيون السلطعون كبيرة ودرع الثابت. يمكن حتى نشاط العصب البصري أن تسجل من التصرف بحرية في المحيط الحيوانات مع البناء السليم من الأقطاب الكهربائية (4). ويمكن أيضا أن يتم تنفيذ هذه التقنيات على عيني رفعه مع تعديل طفيف في الإعداد. سيكون محدودا على أهمية مثل هذه التجارب إلى الوضع الطبيعي ، والخصائص الفيزيولوجية للتغيير عين السلطعون عند إزالتها من الحيوانات (5) ، لكن القيمة التعليمية ستكون كبيرة للمختبر التدريس نظرا لانتشار استخدام هذه الأساليب في علم الأعصاب.
وقدمت ERG التسجيل ، العصب البصري تسجيل ، وتسجيل intraretinal هنا بشكل منفصل عن توخيا للوضوح. في الواقع ، غالبا ما يتم الجمع بين أساليب متعددة في تسجيل تجربة واحدة في وقت واحد لرصد التغيرات في النشاط العصبي والحساسية البصرية في واحدة أو كلتا العينين الجانبية. الغرفة الصغيرة التي نستخدمها لتسجيل ERG هو مفيد خاصة في هذا الصدد أكثر من التصميمات الأخرى (1 ، 6). وعلاوة على ذلك ، فإنه يحمل خزان المحلول الملحي الذي مختومة من الهواء ، والقضاء على المشاكل المرتبطة أقطاب الاستقرار الفتيل التقليدية التي يمكن أن تجف مع مرور الوقت. مجموعة من التجارب رؤية ممكنة مع الليمول هو أكبر من هذا لأنه يمكن استخدام نفس الإجراءات الموضحة لتسجيل لتحفيز العصب العصب من خلال ربط الكهربائي يؤدي إلى محفز كهربائي بدلا من مكبر للصوت إشارة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
فإن الكتاب أن نعترف الدكتور بيرجيت فيرنر لمساعدتها على انتاج هذه المادة مع الفيديو. وقد تم تمويل هذا البحث من قبل على جائزة التوظيف جبهة الخلاص الوطني.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| LED | Light source | Newark Inc | 33C1292 | |
| Suction electrode | Electrode | A-M Systems | 573000 | |
| XCell 3*4-Channel Extracellular Amplifier | Amplifier | FHC, Inc. | 40-40-8B | |
| Intracellular Recording | Amplifier | Cygnus | IR-283A | |
| APM | Neural Spike Discriminator | FHC, Inc. | APM | |
| Bits++ | Video Board | Cambridge Research Systems | Bits++ | |
| Piezopatch Manipulator | Micropositioner | World Precision Instruments, Inc. | PPM5000 | |
| Square Pulse Stimulator | Nerve Stimulator | Grass Technologies | Model S48 | |
| P-97 | Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Borosilicate Glass Capillary | Electrode glass | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Horsesh– crab (Limulus polyphemus) | Animal | Marine Biological Laboratories | ||
| Micropipette Puller | Glass Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Zoom Stereoscope | Microscope | Jed Pella Inc. | SMZ-168 |
References
- Barlow, R. B. Jr Circadian rhythms in the Limulus visual system. J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).
- Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. Cell based model of the Limulus lateral eye. J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).
- Snodderly, D. M. Jr Processing of visual inputs by the brain of Limulus. J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).
- Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. Deciphering a neural code for vision. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).
- Barlow, R. B., Kaplan, E. Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye. Science. 174, 1027-1029 (1971).
- Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye. J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).
