Summary
I den här videon utför vi elektroretinogram inspelning, synnerven inspelning och intraretinal inspelning med den amerikanska hästsko krabba,
Abstract
Den amerikanska hästsko krabba, Limulus Polyfemos är en av de äldsta varelser på jorden, och djuret fortsätter att spela en oumbärlig roll inom den biomedicinska forskningen. Inte bara deras blod innehåller speciella celler som forskarna använder för att upptäcka bacteriotoxins i våra läkemedel, men deras ögon också innehålla ett neuralt nätverk som har gett mycket insikt om fysiologiska processer som verkar i vår visuella systemet, såsom ljus anpassning och lateral hämning. Hästskon krabba förblir en attraktiv modell för synen forskning eftersom djuret är stor och tålig för ett ryggradslöst, dess näthinnans nervceller är stora och lättillgängliga, är dess visuella systemet kompakt och studerats, och dess visuella beteende är väl definierade. Dessutom struktur och funktion i ögonen moduleras på en daglig basis av en dygnsrytm klocka i djurets hjärna. Kort sagt, är den visuella system av hästsko krabbor så enkelt att förstå ändå komplicerad nog för att vara intressant.
I denna video presenterar vi tre elektrofysiologiska paradigm för att undersöka de neurala grund av vision som kan utföras in vivo med Limulus. De är elektroretinogram inspelning, synnerven inspelning och intraretinal inspelning. Elektroretinogram (ERG) inspelningar mäta med en yta elektrod den sammantagna elektriska svar av alla celler i ögat till ett ljussken. De kan användas för att övervaka den totala känslighet öga för förlänger tid. Synnerven inspelningar mäta tillsatta aktiviteten i enstaka nervtrådar med ett extracellulärt microsuction elektrod. De kan användas för att studera visuella budskapen från ögat till hjärnan liksom dygnsrytm dygnet meddelanden matas tillbaka från hjärnan till ögat. Intraretinal inspelningar mäta med en intracellulär mikroelektrod de spänningsvariationer orsakade av ljus i enskilda celler i ögat. De kan användas för att belysa cellulära mekanismer av retinala bearbetning.
Protocol
Del 1: Experimentell Förberedelser
Experimentell som utförs på hästsko krabbor har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Boston University. Djur är inköpt från marinbiologiska Labs (Woods Hole, MA) eller en annan försäljare och inrymt i en luftad saltvatten tank i ett rum som utsätts för en reglerad ljus och mörker cykel. Belysningen behandling är viktig för luftporer krabba är dygnsrytm klocka och cykling ögat dagligen mellan sin dag och natt stater. Omedelbart innan några ingrepp, är djuret kyld i en ishink i 10-15 minuter tills dess rörelse är långsammare och sedan fastsatt på en trä plattform med två rostfria skruvar sitter i prosoma och två i opisthosoma. Plattformen är vägda undertill med granit så att det sjunker i vatten. Efter terminalen experiment djuret avlivas genom att sänka ned till is slam igen och nackstick hjärnan, som ligger ovanför munnen, med en skalpell.
Del 2: Lösningar
Limulus Ringers lösning består av 430 mM NaCl, 9,56 mM KCl, 9,52 mM CaCl2, 9,97 mM MgCl2, 21,05 mM MgSO4, 50μM TES, 50μM HEPES och 10 ml / L Pen-Strep mix (Penicillin-streptomycin, 10000 enheter / ml) .
Del 3: elektroretinogram inspelning
Verktyg som behövs för detta förfarande ingår en skruvmejsel, vaselin, Ringers lösning, en överföringspipett, en grön LED, en inspelning kammare, rostfria skruvar och en bomullspinne.
- En handgjord kammare används för att registrera ERG (Figur 1A). Kammaren kroppen är utformad för att hålla en saltlösning reservoar i kontakt med ögat. Locket innehåller en silverklorid kabel för koppling den ledande lösningen till en förstärkare och ett litet hål storlek för att rymma en lysdiod. En ultrabright LED med toppeffekt runt 520nm fungerar bäst.
- För att starta, är undersidan av kammaren belagd med vaselin och säkrade över ögat med två skruvar.
- Kammaren fylls sedan med saltlösning och tak med locket.
- Efter kammare fastsättning krabban är placerad i en ljus-tight bur i en tank fylld med havsvatten över gälarna.
- LED-kabeln sätts in i kammaren locket.
- Signalen leda klipps till klorid tråd, och referensen bly klippt till en av de inopererade skruvarna.
- Båda ledningarna ansluts till huvudet skede av en hög impedans differentialförstärkare (X-cell 3x4, FHC Inc) för signal förstärkning och förstärkaren filtret är satt att klara frekvenser under 10 Hz.
- Förstärkarutgången leds till ett oscilloskop för visning och att en datainsamling styrelse för dataanalyser och lagring.
- Efter installationen buren dörren är stängd för att blockera rummet ljus från att nå djuret.
- Data samlas in med ett anpassat program skrivet i LabView. Programmet blinkar LED, registrerar framkallade ERG signalen, och mäter topp-till-topp svar amplitud. Valet av flash paradigm beror på experimentella målet. Till exempel används en kortfattad (100ms) puls 5V var 10 minuter till LED undviker effekterna av ljus anpassning när övervakningen dygnsrytm förändringar i ögats känslighet.
Del 4: synnerv inspelning
Verktyg som behövs för detta förfarande ingår en skruvmejsel, tråd, ett trephine, Ringer-lösning, rongeurs, Vännäs sax, en inspelning kammare, böjd pincett, fina sonder nål, en tråkig skalpell, kirurgisk sax och ett sug elektrod.
- En handgjord kammare används för att registrera synnerven svar (Figur 1B). Interiören i kammaren är 2 cm diameter öppen brunn som har en tunn halvcirkelformad slitsade öppning i botten väggen för att tillgodose nerv och isolera den från omgivande vävnad.
- Innan kammare fastsättning en 16-gauge nål sätts in mellan gångjärnet musklerna i hjärtat och ~ 20CC av blod dräneras från djuret. Exsanguination är inte nödvändigt men gör synnerven dissektion lättare.
- Placeringen av synnerven beräknas genom att rita på ryggskölden en lätt böjd linje mellan de laterala och medianen ögon.
- Ett cirkulärt hål skärs sedan i skölden med en trephine. Hålet är samma diameter som kammaren också. I mitten av hålet ligger 2-3 cm anterior till laterala ögat och lite rygg till linjen så att nerven löper längs ventrala delen av brunnen.
- Bindväv rensas förrän nerven är helt synlig och fri från omgivande och underliggande vävnad.
- En del av tråd är loopas runt nerven och drog in i kammaren genom skåran i botten. Genom samma öppning nerven försiktigt styrs in i kammaren genom att dra i strängen. Samtidigt kammaren väl sätts in i hålet. Kammaren är sedan fäst på ryggsköldenmed skruvar och den väl är fylld med Ringers lösning.
- Efter kammare fastsättning djuret har placerats i en ljus-tight bur i en tank fylld med havsvatten över gälarna.
- Det är väl visualiseras i en stereoskopet (SMZ-168, Jed Pella Inc) och bomull är vadderad runt öppningen i botten för att förhindra läckage av blod till och saltlösning ut ur kammaren.
- Kvarvarande bindväv runt nerven tas bort med fina sax och pincett, och kammaren fylls med färska Ringers lösning.
- En nick görs i blodkärl som kapslar in nerv och genom denna öppning nerven är noga desheathed längs dess längd med fin sax, pincett, och sonder nål.
- En liten fiber bunt är skild från nerven med hjälp av sonden och skär i slutet längst bort från öga för afferenta fibrer inspelning och i slutet närmast öga för efferent fiber inspelning. I videon till slutet för afferenta fiber inspelningar skärs.
- En microsuction elektrod (AM Systems Inc) fylld med Ringers lösning används för att synnerven inspelning. Elektroden tips är monterad på nervknippen genom eld polering i slutet av en 1 mm diameter borosilikatglas kapillär.
- Elektroden tips är sänks ner i kammaren bra med en manuell manipulator (WPI Inc) och cut fiber bunt sugs in i spetsen. Sug tillhandahålls av en Gilmont spruta kopplad till elektroden via slangen.
- En BNC-anslutningen ger signalen bly och silver klorid tråd lindad runt elektroden för att minska buller ger referensen bly. De två leder är anslutna till huvudet skede av en differentiell förstärkare för signalförstärkning och brusfiltrering (X-cell 3x4, FHC Inc). Förstärkarutgången skickas till ett oscilloskop för visning och en datainsamling kort för datorer analys och lagring.
- Data samlas in med ett anpassat program skrivet i LabView. Programmet styr ljuset stimuli via en digital video processor (bitar + +, Cambridge Research Systems Inc) och gränssnitt med en digital spik diskriminator (APM, FHC Inc) som spelar Spike tåg. Ljus kan levereras till enstaka celler i ögat via en fiberoptisk ljus rör eller till hela ögat via en dator-styrd bildskärm.
Del 5: Intraretinal inspelning
Verktyg som behövs för detta förfarande ingår en skruvmejsel, en L-formad Lucite plattform med gängade skruvhål, en mikroelektrod hållare med ett glas pipett, rostfria skruvar, pincett, och en fin skalpell.
- En handgjord Lucite tallrik med förinställda skruvhålen används för att registrera intracellulära svar. Hålen är placerade för montering av en motordriven mikromanipulator (PPM5000, WPI Inc). Plåten fästs på djuret med två skruvar på sidan och en på toppen.
- Efter tallrik fastsättning djuret har placerats i en ljus-tight bur i en tank fylld med havsvatten över gälarna.
- Den micropositioner skruvas fast i plattan, med sin rörliga arm linje över ögat.
- Ett parti av glas mikropipetter dras från 1-mm OD borosilikatglas och tips är återfylls via kapillärkraften genom att placera mikropipetter i en liten flaska med 3M KCl-lösning.
- Resten av pipetter fylls manuellt med saltlösning och infogas i en elektrod hållaren.
- Den elektrodhållare är ansluten till huvudet skede av en intracellulär förstärkare (IR-283, Cygnus Technology Inc) som sitter på micropositioner armen.
- En liten del av näthinnan (~ 1mm2) exponeras genom att skära bort hornhinnan gränssnitt med ett rakblad.
- En droppe Ringers lösning är placerad på den exponerade näthinnan att förhindra uttorkning och mikropipett tips är avancerat genom öppningen i näthinnans vävnad.
- När spetsen går in lösningen, är den nuvarande injektion läge för den intracellulära förstärkaren engagerade och elektroden impedans mäts. Mikropipetter med impedans utanför intervallet 20-70 MW kasseras. De som i den här serien är avancerade i mikron steg och spetsad in i cellerna genom att vibrera pipettspetsen elektroniskt eller mekaniskt.
- Tre typer av celler kan påträffas i ögat. Retinular celler visar bara en depolariserande svar på ljus, excentriska celler visar ett tåg av aktionspotentialer ridande på en depolariserande svar och pigmentceller visar inga lätta svar alls.
- Data samlas in med ett anpassat program skrivna i LabVIEW. Programmet styr ljuset stimuli via en digital video processor (bitar + +, Cambridge Research Systems). De stimuli levereras till spetsad celler med en fiberoptisk rör eller bildskärm. Spänning svar observeras på oscilloskopet och digitaliserats av programmet till datorn.
Del 6: representativa resultat
En representant ERG visas i figur 2A. Kurvan representerar den sammantagna elektriskasvar på bakgrund av främst den photoreceptive retinular cellerna, är som de mycket fler än de excentriska cellerna och elektriskt kopplad till dem. Det finns inte flera vågform komponenter från olika retinal celltyper som med däggdjur ERG. Dygnsrytm feedback från en klocka i Limulus hjärnan modulerar de fysiologiska egenskaperna hos näthinnans celler på en daglig basis, vilket gör att amplituden och tidsförloppet av ERG för att variera över tiden (1). Som framgår av figur 2B är ERG amplituden störst under djurets subjektiva natten och lägst under den subjektiva dagen.
En representant spår av en enda spegel nervtråd svar på ljus visas i figur 3. Excentrisk cellerna beter sig alla ungefär samma, visar en övergående ökning av spik tömningshastighet följt av ett förfall till en hållbar nivå. Frekvensen förfall speglar den kombinerade inverkan av ljus anpassning och spik-beroende själv-hämning på excentriska celler (2). Andra spika mönster, som ljusberoende minskar i takt ses i Limulus hjärnan, men inte i ögat (3).
Representant spår av spänningen svar på ett pigment cell, retinular cell, och excentrisk cell för ljus visas i Figur 4. Endast de två sistnämnda näthinnans celltyper är visuell. Amplitud och tid under sitt svar beror på kvaliteten på inspelningen och var elektroden i cellen. Vanligtvis tränger elektroden pigment celler eller retinular celler på grund av deras storlek och antal. Om det senare, en övergående depolarisation som sönderfaller till en hållbar nivå är inspelade. Förfallet beror på att ljuset anpassning av retinular celler (2). Om elektroden går in i en excentrisk cell är stora aktionspotentialer registreras i axonet (40-70mV) och små möjligheter åtgärder ridande på en depolariserande vågform (<25mV) nära soma.
Figur 1. Schematisk diagram över kammare används för elektroretinogram inspelning (A) och synnerven inspelning (B). Bar lika 7mm i A och 5 mm i B.
Figur 2. Exempel på spår av en Limulus ERG som symboliseras av en 100ms LED-puls 5V i mörker (A) och topp-till-topp fluktuationer i ERG amplitud över tiden i konstant mörker (B). Darkness inleddes vid den tidpunkten som anges av den vita triangeln. Tillväxten i ERG amplitud genom den tid som anges av den svarta triangeln beror på ljus anpassning, vilket ökar öga känsligheten i mörkret. Den cykliska variationen i ERG amplituden är därefter på grund av djurens inre dygnsrytm klocka. Tidpunkter i B är varje 5min.
Figur 3. Exempel på spår av en synnerven fiber reaktion på ljus blixtrade på en enda ommatidial receptorn. Vågform över spår visar stimulans timing. Excentrisk celler, vars axoner ger upphov till nervfibrer, alla visar ett liknande mönster av bränning som detta under belysning villkor för försöket (5sec blixt i totalt mörker). Retinala kodning med spikar är en egenskap Limulus har gemensamt med däggdjur, till skillnad från andra ryggradslösa djur.
Figur 4 Exempel på spår av den spänning som svar på bakgrund av de tre celltyperna som finns i Limulus laterala ögat:. Pigment celler (A), retinular cell (B), och excentrisk cell (C). Den första cellen är icke-visuella. De två sistnämnda depolarize på en lätt blixt. Den depolarisation är störst för retinular celler eftersom de transduce ljuset och skickar signalen genom gap-junctions till excentriska cell, med viss förlust på vägen. I den excentriska cellen är aktionspotentialer avfyras genom axonet ses rida på depolarisation grund av Spike backpropagation i soma. Amplituden av aktionspotential har försvagat i figuren för bättre visning av depolariserande potential. Den vilopotential av cellerna är-50mV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har illustrerat hur du utför ERG inspelningar synnerven inspelningar nerv, och intraretinal inspelningar på hästsko krabbor in vivo. Inspelningen tekniker varje ge olika insikter i de neurala grund av vision, och de kan alla användas för att studera retinalfunktion med levande djur tack vare den krabba stora ögon och hårda ryggskölden. Synnerven aktivitet kan även spelas in från att fritt bete djur i havet med rätt konstruktion av elektroder (4). Dessa tekniker kan också utföras på utskurna ögon med smärre justeringar av installationen. Relevansen av dessa experiment till det naturliga tillståndet skulle vara begränsad, eftersom de fysiologiska egenskaperna hos krabba öga förändras när avlägsnas från djuret (5), men instruktions värdet skulle vara bra för en undervisning labb given den utbredda användningen av dessa metoder i neurovetenskap.
ERG inspelning, synnerven inspelning och intraretinal inspelning presenterades separat här för tydlighetens skull. I praktiken finns flera inspelning metoder kombineras ofta i ett enda experiment för att samtidigt övervaka förändringar i neural aktivitet och visuella känslighet i ett eller båda sidorna ögonen. Den lilla kammaren vi använder för ERG inspelning är särskilt fördelaktigt i detta avseende jämfört med andra konstruktioner (1, 6). Dessutom håller den en reservoar av saltlösning som är förseglad från luften, vilket eliminerar stabilitetsproblem förknippade med konventionell veke elektroder som kan torka ut med tiden. Sviten av möjliga sikt experiment med Limulus är ännu större än detta, eftersom samma förfaranden som beskrivs för nerv registrering kan användas för nervstimulering genom att ansluta elektroden leder till en elektrisk stimulator istället för en signalförstärkare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för Dr Birgit Werner för hennes hjälp med att producera denna video artikeln. Denna forskning har finansierats av en NSF KARRIÄR Award.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| LED | Light source | Newark Inc | 33C1292 | |
| Suction electrode | Electrode | A-M Systems | 573000 | |
| XCell 3*4-Channel Extracellular Amplifier | Amplifier | FHC, Inc. | 40-40-8B | |
| Intracellular Recording | Amplifier | Cygnus | IR-283A | |
| APM | Neural Spike Discriminator | FHC, Inc. | APM | |
| Bits++ | Video Board | Cambridge Research Systems | Bits++ | |
| Piezopatch Manipulator | Micropositioner | World Precision Instruments, Inc. | PPM5000 | |
| Square Pulse Stimulator | Nerve Stimulator | Grass Technologies | Model S48 | |
| P-97 | Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Borosilicate Glass Capillary | Electrode glass | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Horsesh– crab (Limulus polyphemus) | Animal | Marine Biological Laboratories | ||
| Micropipette Puller | Glass Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Zoom Stereoscope | Microscope | Jed Pella Inc. | SMZ-168 |
References
- Barlow, R. B. Jr Circadian rhythms in the Limulus visual system. J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).
- Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. Cell based model of the Limulus lateral eye. J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).
- Snodderly, D. M. Jr Processing of visual inputs by the brain of Limulus. J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).
- Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. Deciphering a neural code for vision. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).
- Barlow, R. B., Kaplan, E. Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye. Science. 174, 1027-1029 (1971).
- Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye. J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).
