Utilizando el cangrejo de herradura, Limulus polyphemus, En la Investigación de la Visión

Summary

En este vídeo podemos realizar la grabación electrorretinograma, la grabación del nervio óptico, y la grabación intrarretinianas con el cangrejo de herradura de América,

Abstract

El cangrejo de herradura de América, Limulus Polifemo es una de las criaturas más antiguas de la tierra, y el animal sigue desempeñando un papel indispensable en la investigación biomédica. No sólo su sangre contiene células especiales que utilizan los científicos para detectar bacteriotoxins en nuestras medicinas, pero sus ojos también contienen una red neuronal que han permitido comprender mucho acerca de los procesos fisiológicos que operan en nuestro sistema visual, como la adaptación a la luz y la inhibición lateral. El cangrejo de herradura sigue siendo un modelo atractivo para la investigación de la visión, porque el animal es grande y resistente para un invertebrado, sus neuronas de la retina son grandes y de fácil acceso, su sistema visual es compacto y estudiado ampliamente, y su comportamiento visual está bien definido. Por otra parte, la estructura y función de los ojos son moduladas sobre una base diaria por un reloj circadiano en el cerebro del animal s. En resumen, el sistema visual de los cangrejos de herradura es bastante simple de entender pero lo suficientemente complejo como para ser interesante.

En este vídeo se presentan tres paradigmas electrofisiológicos para investigar las bases neuronales de la visión que se pueden realizar en vivo con Limulus. Se está grabando electrorretinograma, la grabación del nervio óptico, y la grabación intra. Electrorretinograma (ERG), grabaciones de medida con una superficie del electrodo resume la respuesta eléctrica de las células en el ojo a un destello de luz. Pueden ser utilizados para controlar la sensibilidad de los ojos para prolongar los períodos de tiempo. Grabaciones del nervio óptico medir la actividad de adición de las fibras nerviosas individuales con un electrodo extracelular microsucción. Pueden ser utilizados para estudiar los mensajes visuales transmitidos desde el ojo hasta el cerebro, así como reloj circadiano mensajes realimentada desde el cerebro hasta el ojo. Medida grabaciones intrarretinianas con un microelectrodo intracelular las fluctuaciones de tensión inducida por la luz en las células individuales del ojo. Se pueden utilizar para dilucidar los mecanismos celulares de procesamiento de la retina.

Protocol

Parte 1: Preparación Experimental

Los procedimientos experimentales realizados en los cangrejos de herradura ha sido aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en la Universidad de Boston. Los animales son comprados a los laboratorios de Biología Marina (Woods Hole, MA) o de otros proveedores y ubicado en un tanque de agua salada en una habitación aireada expuestos a un mercado regulado ciclo luz-oscuridad. El régimen de la iluminación es importante para el arrastre del reloj circadiano del cangrejo y el ciclo de los ojos todos los días entre sus estados durante el día y la noche. Inmediatamente antes de iniciar cualquier procedimiento invasivo, el animal se enfría en un cubo de hielo durante 10-15 minutos hasta que su movimiento es lento y sujeto a una plataforma de madera con dos tornillos de acero inoxidable insertado en el prosoma y dos en el opistosoma. La plataforma se inclina por debajo de granito para que se hunda en el agua. Después de experimentos terminales el animal es sacrificado por inmersión en suspensión de hielo nuevo y descabello en el cerebro, que se encuentra por encima de la boca, con un bisturí.

Parte 2: Soluciones

Solución Limulus Ringer se compone de 430 mM NaCl, 9,56 mM KCl, 9,52 mM CaCl2, 9,97 mM de MgCl2, 21,05 mM MgSO4, 50 micras de los TES, HEPES 50 micras, y 10 ml / L Pen-estreptococo mezcla (penicilina-estreptomicina, las unidades de 10,000 / ml) .

Parte 3: Grabación Electrorretinograma

Herramientas necesarias para este procedimiento incluyen un destornillador, vaselina, solución de Ringer, una pipeta de transferencia, un LED verde, una cámara de registro, tornillos de acero inoxidable, y un hisopo de algodón.

1. Una cámara de mano se utiliza para registrar el ERG (Figura 1). El cuerpo de la cámara está diseñada para mantener un depósito de solución salina en contacto con el ojo. La tapa contiene un cable de cloruro de plata para el acoplamiento de la solución conductora de un amplificador y un agujero de pequeño tamaño para dar cabida a un LED. Un LED ultrabrillante con pico de emisión en torno a 520 nm que funciona mejor.
2. Para empezar, la parte inferior de la cámara está cubierta con vaselina y asegura sobre el ojo con dos tornillos.
3. La cámara se llena con solución salina y se tapa con la tapa.
4. Después de la unión de cámara del cangrejo se coloca en una jaula a prueba de luz en un tanque lleno de agua de mar en las branquias.
5. El cable de LED se inserta en la tapa de la cámara.
6. El cable de señal se recorta para que el cable de cloruro, y el cable de referencia y se recorta en uno de los tornillos implantados.
7. Ambos cables están conectados a la etapa de la cabeza de un amplificador diferencial de alta impedancia (X-cell 3x4, FHC Inc) para la amplificación de la señal y el filtro del amplificador se encuentra para pasar las frecuencias inferiores a 10Hz.
8. La salida del amplificador se alimenta a un osciloscopio para la visualización y una tarjeta de adquisición de datos para el análisis informáticos y de almacenamiento.
9. Después de la configuración de la puerta de la jaula se cierra para bloquear la luz de la sala de alcanzar el animal.
10. Los datos se recogen con un programa personalizado escrito en LabView. El programa parpadea el LED, los registros de la señal evocada ERG, y mide la amplitud de la respuesta de pico a pico. La elección del paradigma de flash depende de los objetivos experimentales. Por ejemplo, una breve (100 ms) de pulso de 5V aplica cada 10 minutos hasta que el LED evita los efectos de la adaptación a la luz cuando la vigilancia de los cambios circadianos en la sensibilidad de los ojos.

Parte 4: Grabación del nervio óptico

Herramientas necesarias para este procedimiento incluyen un destornillador, hilo, un trépano, solución de Ringer, gubias, tijeras Vannas, una cámara de registro, pinzas curvas, las sondas con aguja fina, una aburrida tijeras bisturí quirúrgico, y un electrodo de succión.

1. Una cámara de mano se utiliza para registrar las respuestas del nervio óptico (fig. 1B). El interior de la cámara es de 2 cm de diámetro y abierto que tiene una delgada abertura semicircular con ranura en la pared de fondo para dar cabida a los nervios y aislarlo del tejido circundante.
2. Antes de colocar la cámara de una aguja de calibre 16 se inserta entre los músculos de la bisagra en el corazón y el ~ 20 cc de sangre es drenada del animal. Exanguinación no es necesario, pero hace la disección del nervio óptico más fácil.
3. La localización del nervio óptico se calcula mediante la elaboración en el caparazón de una línea ligeramente curvada entre los ojos laterales y la mediana.
4. Un agujero circular se corta en el caparazón con un trépano. El agujero es el mismo diámetro que la cámara también. El centro del agujero se encuentra 2-3 cm por delante del lateral del ojo y ligeramente dorsal a la línea para que el nervio discurre por la parte ventral del pozo.
5. El tejido conectivo se borra hasta que el nervio es totalmente visible y libre de los alrededores y el tejido subyacente.
6. Una hebra de hilo se enrolla alrededor del nervio y entró en la cámara a través de la ranura en la parte inferior. A través de esta misma apertura del nervio es guiado delicadamente en la cámara, tirando de la cuerda. Al mismo tiempo, la cámara también se inserta en el agujero. Se cerrará la cámara colocada en el caparazóncon tornillos y así se rellena con solución de Ringer.
7. Después de la unión de cámara el animal se encuentre en una jaula a prueba de luz en un tanque lleno de agua de mar en las branquias.
8. El pozo se visualiza en un estereoscopio (SMZ-168, Jed Pella Inc) y se rellena de algodón alrededor de la abertura en la parte inferior para evitar la fuga de sangre en solución salina y fuera de la cámara.
9. Tejido residual conectivo alrededor del nervio se retira con unas tijeras y unas pinzas finas, y la cámara se rellena con solución de Ringer fresca.
10. Un nick se hace en el vaso sanguíneo que encapsula el nervio y por esta abertura el nervio está cuidadosamente desheathed a lo largo de su longitud usando tijeras finas, pinzas, agujas y sondas.
11. Un pequeño haz de fibras se separan del nervio con la sonda y el corte en el extremo más alejado del ojo para la grabación de fibras aferentes y en el extremo más cercano al ojo para la grabación de fibras eferentes. En el video al final de las grabaciones de fibras aferentes se corta.
12. Un electrodo microsucción (AM Systems Inc) lleno de solución de Ringer se utiliza para la grabación del nervio óptico. La punta del electrodo se coloca en el conjunto de nervios por el fuego pulido final de una copa de 1mm de diámetro borosilicato capilares.
13. La punta del electrodo se introduce en la cámara y con un manipulador de manual (WPI Inc), y el haz de fibras cortadas se aspira en la punta. Succión es proporcionada por una jeringa Gilmont conectado al electrodo a través de la tubería.
14. La conexión BNC proporciona el cable de señal y un cable de cloruro de plata envuelta alrededor del electrodo para reducir el ruido proporciona el cable de referencia. Los dos cables están conectados a la etapa de la cabeza de un amplificador diferencial para la amplificación de la señal y filtrado de ruido (X-cell 3x4, FHC Inc). La salida del amplificador es enviada a un osciloscopio para la visualización y una tarjeta de adquisición de datos para el análisis informáticos y de almacenamiento.
15. Los datos se recogen con un programa personalizado escrito en LabView. El programa de control de estímulos de luz a través de un procesador de video digital (Bits + +, Cambridge Research Systems Inc) y se conecta con un discriminador digital de punta (APM, FHC Inc) que los registros de los trenes de espiga. La luz puede ser entregado a las células individuales en el ojo a través de un tubo de luz de fibra óptica o de todo el ojo a través de una pantalla de vídeo controladas por ordenador.

Parte 5: grabación intrarretinianas

Herramientas necesarias para este procedimiento incluyen un destornillador, una plataforma en forma de L lucite con agujeros de los tornillos de rosca, el titular de microelectrodos con una pipeta de vidrio, tornillos de acero inoxidable, pinzas, bisturí y una multa.

1. Un plato hecho a mano lucite con agujeros de los tornillos preestablecido se utiliza para registrar las respuestas intracelulares. Los agujeros están espaciados para el montaje de un micromanipulador motorizados (PPM5000, WPI Inc). La placa se sujeta al animal con dos tornillos en el lateral y en la parte superior.
2. Después de fijación de la placa que el animal es colocado en una jaula a prueba de luz en un tanque lleno de agua de mar en las branquias.
3. El micropositioner se atornilla en la placa, con su brazo móvil alineados sobre el ojo.
4. Un lote de pipetas de vidrio se tira de 1 mm de diámetro exterior de vidrio de borosilicato y las puntas son rellenados a través de la acción capilar mediante la colocación de las pipetas en un pequeño frasco de solución de KCl 3M.
5. El resto de las pipetas se llenan manualmente con la solución salina y se inserta en un porta-electrodos.
6. El titular del electrodo se conecta a la etapa de la cabeza de un amplificador intracelular (IR-283, Cygnus Technology Inc) fijado al brazo micropositioner.
7. Una pequeña sección de la retina (~ 1mm2) está expuesta al cortar la interfaz de la córnea con una cuchilla de afeitar.
8. Una gota de solución de Ringer se coloca en la retina expuesta para prevenir la sequedad y la punta de la micropipeta se avanza a través de la abertura en el tejido de la retina.
9. Cuando la punta entra en la solución, el modo de inyección de corriente del amplificador intracelular se dedica y la impedancia del electrodo se mide. Micropipetas con una impedancia fuera del rango de 20 a 70 MW se descartan. Los que están en este rango son los pasos avanzados en micras y empalado en las células por la vibración de la punta de la pipeta electrónica o mecánicamente.
10. Tres tipos de células se pueden encontrar en el ojo. Células Retinular mostrar sólo una respuesta de despolarización a la luz, las células excéntricas muestran un tren de potenciales de acción de montar una respuesta de despolarización, y las células de pigmento no mostrar respuesta alguna luz.
11. Los datos se recogen con un programa personalizado escrito en Labview. El programa de control de estímulos de luz a través de un procesador de video digital (Bits + +, Cambridge Research Systems). Los estímulos se entregan a las células empalado con un tubo de fibra óptica o la pantalla de vídeo. Las respuestas de tensión se observa en el osciloscopio y digitalizadas por el programa a la computadora.

Parte 6: Resultados de Representante

Un representante del ERG se muestra en la Figura 2A. La forma de onda eléctrica representa la sumarespuesta a la luz de todo las células fotorreceptoras retinular, ya que son mucho más numerosos que las células excéntricas y están acopladas eléctricamente con ellos. No hay forma de onda de varios componentes de los diferentes tipos de células de la retina de mamíferos como el ERG. Retroalimentación de un reloj circadiano en el cerebro Limulus modula las propiedades fisiológicas de las células de la retina en una base diaria, haciendo que el curso de la amplitud y el tiempo del ERG a variar con el tiempo (1). Como se muestra en la Figura 2B, ERG amplitud es mayor durante la noche subjetiva de los animales más bajos y durante el día subjetivo.

Un seguimiento de representante de una sola respuesta óptica de la fibra nerviosa a la luz se muestra en la Figura 3. Células excéntrica todos se comportan más o menos lo mismo, mostrando un aumento transitorio en la tasa de descarga en punta seguido por un deterioro a un nivel sostenible. La tasa de decaimiento refleja la acción combinada de adaptación a la luz y la punta-dependiente de auto-inhibición de las células excéntrico (2). Otros patrones de pico, como dependiente de la luz disminuye en la tasa, se ve en el cerebro Limulus, pero no el ojo (3).

Rastros representante de la respuesta de tensión de una célula de las células pigmentarias, células retinular y excéntrico a la luz se muestra en la Figura 4. Sólo estos dos últimos tipos de células de la retina son visuales. El curso de la amplitud y el tiempo de su respuesta depende de la calidad de la grabación y la ubicación de los electrodos dentro de la célula. Por lo general, el electrodo penetra en las células de pigmento o células retinular debido a su gran tamaño y número. En este último caso, una despolarización transitoria que disminuye a un nivel constante se registra. La decadencia se debe a la adaptación a la luz por las células retinular (2). Si el electrodo entra en una célula de excéntrico, un gran potencial de acción se registró en el axón (40-70mV) y pequeños potenciales de acción cabalgando sobre una forma de onda de despolarización (<25mV), cerca del soma.

Figura 1. Esquemas de las cámaras utilizadas para la grabación de electrorretinograma (A) y la grabación del nervio óptico (B). Bar es igual a 7 mm de A y de 5 mm en B.

Figura 2. Rastro Ejemplo de un ERG Limulus evocada por un pulso de 100ms LED de 5V en la oscuridad (A) y la fluctuación de pico a pico en el ERG amplitud en el tiempo en la oscuridad constante (B). La oscuridad se inició en el momento indicado por el triángulo blanco. El crecimiento de la ERG amplitud a través de la hora indicada por el triángulo negro se debe a la adaptación a la luz, lo que aumenta la sensibilidad del ojo en la oscuridad. La variación cíclica en el ERG amplitud a partir de entonces se debe al reloj circadiano interno del animal. Los puntos de tiempo en el B son cada 5 minutos.

Figura 3. Rastro Ejemplo de una respuesta nerviosa de fibra óptica a la luz brilló sobre un receptor ommatidial sola. Forma de onda por encima de la traza muestra el tiempo de estímulo. Células excéntrico, cuyos axones dar lugar a las fibras nerviosas, todos muestran un patrón similar de disparar, ya que en las condiciones de iluminación del experimento (5 segundos de flash en la oscuridad total). Codificación de la retina con clavos es un Limulus propiedad tiene en común con los mamíferos, a diferencia de otros invertebrados.

Figura 4 rastros Ejemplo de la respuesta de tensión a la luz de los tres tipos de células presentes en el lateral del ojo Limulus:. Células pigmentarias (A), células retinular (B), y la célula excéntrica (C). La primera célula no es visual. Los dos últimos despolarizar a un destello de luz. La despolarización es mayor en las células retinular porque la transducción de la luz y envían la señal a través de uniones de la célula excéntrica, con alguna pérdida en el camino. En la celda excéntrico, los potenciales de acción lanzado por el axón se ven a caballo por la despolarización debido a backpropagation espiga en el soma. La amplitud de los potenciales de acción se ha atenuado en la figura para una mejor visualización del potencial de despolarización. El potencial de reposo de las células es-50mV.

Discussion

Hemos ilustrado cómo realizar grabaciones de ERG, las grabaciones del nervio óptico, y las grabaciones intra en los cangrejos de herradura en vivo. Las técnicas de grabación cada uno proporcionar ideas diferentes a las bases neuronales de la visión, y todos ellos pueden ser utilizados para estudiar la función de la retina en animales vivos gracias a sus grandes ojos del cangrejo y de caparazón duro. La actividad del nervio óptico, incluso se pueden grabar libremente comportarse animales en el océano con la construcción correcta de los electrodos (4). Estas técnicas también se pueden realizar en los ojos extirpados con pequeñas modificaciones de la configuración. La relevancia de estos experimentos a la condición natural sería limitado, ya que las propiedades fisiológicas de cambiar los ojos del cangrejo cuando se retiran del animal (5), pero el valor de instrucción sería ideal para un laboratorio de enseñanza que se da el uso generalizado de estos métodos en neurociencia.

ERG grabación, la grabación del nervio óptico, y la grabación intrarretinianas se presentaron por separado aquí por razones de claridad. En la práctica, múltiples métodos de grabación a menudo se combinan en un solo experimento para controlar simultáneamente los cambios en la actividad neuronal y la sensibilidad visual en uno o ambos ojos laterales. La pequeña cámara que utilizamos para la grabación de ERG es particularmente ventajoso en este sentido sobre otros diseños (1, 6). Por otra parte, se mantiene una reserva de solución salina que se sella en el aire, eliminando los problemas asociados con la estabilidad de electrodos convencionales mecha que puede secar con el tiempo. El conjunto de experimentos posibles con la visión de Limulus es aún mayor que esto, porque los mismos procedimientos para el registro de los nervios puede ser utilizado para la estimulación del nervio mediante la conexión del electrodo lleva a un estimulador eléctrico en lugar de un amplificador de señal.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
LED	Light source	Newark Inc	33C1292
Suction electrode	Electrode	A-M Systems	573000
XCell 3*4-Channel Extracellular Amplifier	Amplifier	FHC, Inc.	40-40-8B
Intracellular Recording	Amplifier	Cygnus	IR-283A
APM	Neural Spike Discriminator	FHC, Inc.	APM
Bits++	Video Board	Cambridge Research Systems	Bits++
Piezopatch Manipulator	Micropositioner	World Precision Instruments, Inc.	PPM5000
Square Pulse Stimulator	Nerve Stimulator	Grass Technologies	Model S48
P-97	Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	Model P-97
Borosilicate Glass Capillary	Electrode glass	World Precision Instruments, Inc.	1B150-4
Horsesh– crab (Limulus polyphemus)	Animal	Marine Biological Laboratories
Micropipette Puller	Glass Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Zoom Stereoscope	Microscope	Jed Pella Inc.	SMZ-168