Summary
Neste vídeo podemos executar a gravação eletrorretinograma, a gravação do nervo óptico e gravação intra-americano com o caranguejo-ferradura,
Abstract
O caranguejo-ferradura americano, Limulus Polifemo é uma das mais antigas criaturas na terra, eo animal continua a desempenhar um papel indispensável na pesquisa biomédica. Não só o seu sangue contém células especiais que os cientistas usam para detectar bacteriotoxins em nossos medicamentos, mas seus olhos também contêm uma rede neural que tem proporcionado uma visão muito sobre os processos fisiológicos que operam em nosso sistema visual, como a adaptação de luz e inibição lateral. O caranguejo-ferradura continua a ser um modelo atraente para a investigação da visão porque o animal é grande e resistente para um invertebrado, seus neurônios da retina são grandes e de fácil acesso, seu sistema visual é compacto e extensivamente estudado, e seu comportamento visual é bem definida. Além disso, a estrutura eo funcionamento dos olhos são modulados em uma base diária por um relógio circadiano no cérebro do animal s. Em suma, o sistema visual de caranguejos-ferradura é bastante simples de ser entendido ainda complexo o suficiente para ser interessante.
Neste vídeo apresentamos três paradigmas eletrofisiológicos para investigar as bases neurais da visão que podem ser realizados in vivo com Limulus. Eles estão gravando eletrorretinograma, a gravação do nervo óptico e gravação intra. Eletrorretinograma (ERG) gravações medida com uma superfície do eletrodo a resposta resumiu elétrica de todas as células do olho para um flash de luz. Eles podem ser usados para monitorar a sensibilidade global do olho para prolongar os períodos de tempo. Gravações nervo óptico medir a atividade spiking de fibras nervosas individuais com um eletrodo microsuction extracelular. Elas podem ser usadas para estudar as mensagens visuais transmitidas do olho para o cérebro, bem como relógio circadiano-alimentado de volta mensagens do cérebro para os olhos. Medida intra gravações com um microeletrodo intracelular as flutuações de tensão induzida pela luz em células individuais do olho. Elas podem ser usadas para elucidar os mecanismos celulares de processamento da retina.
Protocol
Parte 1: Preparação Experimental
Procedimentos experimentais realizados em caranguejos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use Universidade de Boston. Os animais são comprados dos laboratórios de Biologia Marinha (Woods Hole, MA) ou outro fornecedor e alojados em um aquário de água salgada aerada em uma sala exposta a um ciclo claro-escuro regulamentado. O esquema de iluminação é importante para entraining relógio circadiano do caranguejo e andar de bicicleta o olho diariamente entre seus estados diurnos e noturnos. Imediatamente antes de iniciar qualquer procedimento invasivo, o animal é resfriado em um balde de gelo por 10-15 minutos, até que seu movimento é lento e, em seguida, preso a uma plataforma de madeira com dois parafusos de aço inoxidável inserida no prosoma e dois na opisthosoma. A plataforma é ponderada por baixo com granito de modo a afundar na água. Após experimentos terminal o animal é sacrificado por imersão em pasta de gelo novamente e mielotomia o cérebro, que fica acima da boca, com um bisturi.
Parte 2: Soluções
Solução Limulus Ringer é composta de 430 mM NaCl, 9,56 mM KCl, 9,52 mM CaCl2, 9,97 mM MgCl2, 21,05 mM MgSO4, 50 ìm TES, HEPES 50 ìm e 10ml / L Pen-Strep mix (penicilina-estreptomicina, 10.000 unidades / ml) .
Parte 3: Gravação Eletrorretinograma
Ferramentas necessárias para este procedimento incluem uma chave de fenda, vaselina, solução de Ringer, uma pipeta, um LED verde, uma câmara de gravação, parafusos de aço inoxidável, e um cotonete.
- Uma câmara à mão é usado para gravar o ERG (Figura 1A). O corpo da câmara é projetado para manter um reservatório de solução salina em contato com o olho. A tampa contém um fio de cloreto de prata para o acoplamento da solução condutora a um amplificador e um furo de pequeno porte para acomodar um LED. Um ultrabright LED com emissão de pico por volta de 520nm funciona melhor.
- Para começar, a parte inferior da câmara é revestida com vaselina e garantiu sobre o olho com dois parafusos.
- A câmara é então preenchido com solução salina e tampado com a tampa.
- Depois de penhora câmara o caranguejo é colocado em uma gaiola à prova de luz em um tanque cheio de água do mar sobre as brânquias.
- O cabo de LED é inserida na tampa de câmara.
- A liderança do sinal é cortada ao fio, cloreto e o eletrodo referência é cortada para um dos parafusos implantados.
- Ambos os terminais estão conectados ao palco cabeça de um amplificador diferencial de alta impedância (X células 3x4, FHC Inc) para amplificação de sinal e amplificador de o filtro está definido para passar freqüências abaixo de 10Hz.
- A saída do amplificador é alimentado a um osciloscópio para visualização e uma placa de aquisição de dados para análise e armazenamento de computador.
- Após a instalação a porta da gaiola está fechada para bloquear a luz da sala de atingir o animal.
- Os dados são coletados com um programa personalizado escrito em LabView. O programa pisca o LED, registra o evocado ERG sinal, e mede a amplitude da resposta pico a pico. A escolha do paradigma de flash depende do objetivo experimental. Por exemplo, uma breve (100ms) pulso de 5V aplicada a cada 10 minutos para o LED evita efeitos de adaptação luz quando o monitoramento de mudanças circadiano na sensibilidade dos olhos.
Parte 4: gravação do nervo óptico
Ferramentas necessárias para este procedimento incluem uma chave de fenda, fio, um trépano, solução de Ringer, fórceps, tesouras Vannas, uma câmara de gravação, uma pinça curva, sondas agulha fina, um maçante bisturi, tesouras cirúrgicas, e um eletrodo de sucção.
- Uma câmara à mão é usado para gravar as respostas do nervo óptico (Figura 1B). O interior da câmara é dois centímetros de diâmetro, bem aberto que tem uma abertura semicircular fina fenda na parede inferior para acomodar o nervo e isolá-lo do tecido circundante.
- Antes de penhora câmara de uma agulha de calibre 16 é inserido entre os músculos da dobradiça para o coração e ~ 20cc de sangue é drenado do animal. Exsanguination não é necessária, mas torna a dissecção do nervo óptico mais fácil.
- A localização do nervo óptico é estimado pelo desenho na carapaça de uma linha ligeiramente curva entre os olhos laterais e mediana.
- Um buraco circular é então cortada na carapaça com uma trefina. O buraco é o mesmo diâmetro que a câmara também. O centro do buraco está localizado 2-3 cm anterior ao olho lateral e ligeiramente dorsal à linha para que o nervo percorre a porção ventral do poço.
- Tecido conjuntivo é liberado até que o nervo é totalmente visível e livre de torno e subjacentes do tecido.
- Um fio de linha é enrolada ao redor do nervo e puxou para dentro da câmara através da ranhura na parte inferior. Através desta mesma abertura do nervo é suavemente guiado para a câmara, puxando a corda. Ao mesmo tempo, a câmara também é inserido no furo. A câmara é então aposta a carapaçacom parafusos eo poço é preenchido com solução de Ringer.
- Depois de penhora câmara o animal é colocado em uma gaiola à prova de luz em um tanque cheio de água do mar sobre as brânquias.
- O bem é visualizado sob um estereoscópio (SMZ-168, Jed Pella Inc) e algodão é preenchido em torno da abertura no fundo para evitar fugas de sangue e soro fisiológico para fora da câmara.
- Tecido conjuntivo residual ao redor do nervo é removida com tesoura fina e pinça, ea câmara é abastecido com solução de Ringer fresco é.
- Um nick é feita no vaso sanguíneo que encapsula o nervo e, através desta abertura que o nervo é cuidadosamente desheathed longo de seu comprimento com uma tesoura fina, pinças, sondas e agulhas.
- Um feixe de fibras minúsculas é separado do nervo utilizando a sonda e corte no final mais afastada do olho para a gravação de fibras aferentes e no final mais próximo ao olho para a gravação de fibras eferentes. No vídeo o fim das gravações de fibra aferente é cortado.
- Um eletrodo microsuction (AM Systems Inc) preenchidas com solução de Ringer é usado para a gravação do nervo óptico. A ponta do eletrodo é montado no feixe de nervos pelo fogo polimento final de um vidro de borosilicato 1 milímetro de diâmetro capilar.
- A ponta do eletrodo é rebaixada para a câmara de bem com um manipulador manual (WPI Inc), eo feixe de fibras cortadas é sugado para a ponta. Sucção é fornecido por uma seringa Gilmont conectados ao eletrodo por meio de tubulação.
- Uma conexão BNC fornece a liderança de sinal e um fio de cloreto de prata enrolada em torno do eletrodo para reduzir o ruído fornece a liderança de referência. Os dois terminais estão conectados ao palco cabeça de um amplificador diferencial para a amplificação do sinal e filtragem de ruído (X células 3x4, FHC Inc). A saída do amplificador é enviado a um osciloscópio para visualização e uma placa de aquisição de dados para análise e armazenamento de computador.
- Os dados são coletados com um programa personalizado escrito em LabView. O programa controla os estímulos de luz através de um processador de vídeo digital (Bits + +, Cambridge Research Systems Inc) e interfaces digitais com um pico discriminador (APM, FHC Inc) que os registros de trens de pico. A luz pode ser entregue a uma única célula no olho através de um tubo de luz de fibra óptica ou para todo o olho através de um display de vídeo controlado por computador.
Parte 5: gravação intra
Ferramentas necessárias para este procedimento incluem uma chave de fenda, uma em forma de L plataforma de acrílico com furos roscados, um suporte de microeletrodos com uma pipeta de vidro, parafusos de aço inoxidável, pinças e um bisturi fino.
- Uma placa de acrílico artesanais com furos pré-é usado para gravar as respostas intracelulares. Os furos são espaçados para a montagem de um micromanipulador motorizado (PPM5000, WPI Inc). A placa é anexado ao animal com dois parafusos na lateral e um na parte superior.
- Após fixação da placa o animal é colocado em uma gaiola à prova de luz em um tanque cheio de água do mar sobre as brânquias.
- O microposicionador é parafusada na placa, com o seu braço móvel alinhado sobre o olho.
- Um lote de micropipetas de vidro são puxados a partir de 1 mm OD vidro borossilicato e as pontas são backfilled via ação capilar, colocando o micropipetas em um pequeno frasco de solução de KCl 3M.
- O resto das pipetas são preenchidos manualmente com a solução de sal e inserido em um suporte do eletrodo.
- O suporte do eletrodo é conectado ao palco a cabeça de um amplificador intracelular (IR-283, Cygnus Technology Inc) aposta no braço microposicionador.
- Uma seção pequena da retina (~ 1mm2) é exposto pelo corte de distância da interface córnea com uma lâmina de barbear.
- Uma gota de solução de Ringer é colocado na retina exposta para evitar a secagem ea ponta micropipeta é avançada através da abertura no tecido da retina.
- Quando a ponta entra na solução, o modo de injeção de corrente do amplificador intracelular está envolvido e impedância de eletrodo é medido. Micropipetas com impedância fora do intervalo de 20-70 MW são descartados. Aqueles nesta faixa são avançados em passos micron e empalado em células vibrando a ponta da pipeta eletronicamente ou mecanicamente.
- Três tipos de células podem ser encontradas no olho. Retinular células apresentam apenas uma resposta despolarizante à luz, as células excêntrico mostram um trem de potenciais de ação montado em uma resposta despolarizante, e as células de pigmento não mostram nenhuma resposta clara a todos.
- Os dados são coletados com um programa personalizado escrito em Labview. O programa controla os estímulos de luz através de um processador de vídeo digital (Bits + +, Sistemas de Cambridge Research). Os estímulos são entregues às células empalado com um tubo de fibra óptica ou exibição de vídeo. Respostas de tensão são observados no osciloscópio e digitalizados pelo programa para computador.
Parte 6: Resultados Representante
A ERG representativa é mostrado na Figura 2A. A forma de onda representa a elétrica resumiuresposta à luz dos principalmente a células fotorreceptoras retinular, uma vez que em muito ultrapassam as células excêntrico e são eletricamente acoplados a eles. Não há forma de onda componentes múltiplos de diferentes tipos de células da retina como com o ERG de mamíferos. Retorno de um relógio circadiano no cérebro Limulus modula as propriedades fisiológicas das células da retina em uma base diária, fazendo com que o curso amplitude e tempo do ERG para variar ao longo do tempo (1). Conforme mostrado na Figura 2B, ERG amplitude é maior durante a noite subjetiva do animal menor e durante o dia subjetiva.
Um traço de representante de uma resposta de fibra do nervo óptico único para a luz é mostrado na Figura 3. Células excêntricas todos se comportam da mesma ordem, mostrando um aumento transitório na taxa de descarga pico seguido de uma decadência a um nível sustentado. A decadência taxa reflete a ação combinada de adaptação luz e aumento dependente da auto-inibição em células excêntricas (2). Outros padrões espiga, como a luz-dependente diminui na taxa, são vistos no cérebro Limulus, mas não o olho (3).
Traços representativos da resposta de tensão de uma célula de células de pigmento, células retinular, e excêntrico à luz são mostrados na Figura 4. Apenas os dois últimos tipos de células da retina são visuais. O curso de amplitude e tempo de sua resposta depende da qualidade da gravação e da localização do eletrodo no interior da célula. Geralmente, o eletrodo penetra nas células de pigmento ou células retinular por causa de seu grande tamanho e número. Neste último caso, uma despolarização transitória que decai a um nível sustentado é gravado. A decadência é devido à adaptação de luz por células retinular (2). Se o eletrodo entra em uma célula excêntrico, grandes potenciais de ação são registrados no axônio (40-70mV) e potenciais de ação pequeno montado em uma forma de onda despolarizante (<25mV) perto da soma.
Figura 1. Diagramas esquemático das câmaras utilizadas para a gravação eletrorretinograma (A) e gravação de nervo óptico (B). Bar é igual a 7mm de A e 5mm de B.
Figura 2. Traço Exemplo de um ERG Limulus evocado por um pulso de 100ms LED 5V no escuro (A) ea flutuação pico-a-pico em ERG amplitude ao longo do tempo na escuridão constante (B). Escuridão foi iniciado no momento indicado pelo triângulo branco. O crescimento da amplitude do ERG durante o tempo indicado pelo triângulo preto é devido à adaptação de luz, que aumenta a sensibilidade do olho no escuro. A variação cíclica na amplitude do ERG depois disso é devido ao relógio interno do animal circadiano. Pontos no tempo B são cada 5min.
Figura 3. Traço Exemplo de uma resposta do nervo óptico de fibra à luz brilhou em um único receptor ommatidial. Forma de onda acima do rastreamento mostra momento estímulo. Células excêntricas, cujos axônios dão origem a fibras nervosas, todas apresentam um padrão semelhante de disparar como este nas condições de iluminação do experimento (5 segundos o flash no escuro total). Codificação da retina com picos é um Limulus propriedade tem em comum com mamíferos, ao contrário de outros invertebrados.
Figura 4 traços Exemplo da resposta de tensão à luz dos três tipos de células presentes no olho Limulus lateral:. Células de pigmento (A), célula retinular (B), e célula excêntrico (C). A primeira célula é não-visual. Os dois últimos despolarizar em cima de um flash de luz. A despolarização é maior para as células retinular porque transdução da luz e enviar o sinal através de junções para a célula excêntrico, com alguma perda ao longo do caminho. Na célula excêntrico, potenciais de ação disparados pelo axônio são vistos andando sobre a despolarização devido à backpropagation pico na soma. A amplitude dos potenciais de ação tem sido atenuada na figura para melhor visualização do potencial despolarizante. O potencial de repouso das células é-50mV.
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Discussion
Nós ilustramos como realizar gravações ERG, gravações nervo óptico, e gravações de caranguejos-ferradura intra-in vivo. As técnicas de gravação cada fornecer informações diferentes sobre a base neural da visão, e todos eles podem ser usados para estudar a função da retina em animais vivos graças aos olhos grandes do caranguejo e da carapaça dura. Atividade do nervo óptico pode até mesmo ser gravado a partir de animais se comportando livremente no oceano com a construção adequada de eletrodos (4). Essas técnicas também podem ser realizadas nos olhos extirpados, com a modificação da configuração. A relevância de tais experiências à condição natural seria limitada, pois as propriedades fisiológicas da mudança do caranguejo olho quando retirado do animal (5), mas o valor de instrução seria ótimo para um laboratório de ensino, dada a ampla utilização destes métodos em neurociência.
ERG gravação, a gravação do nervo óptico e gravação intra foram apresentados separadamente aqui para maior clareza. Na prática, os métodos de gravação múltipla são muitas vezes combinados dentro de um único experimento para simultaneamente monitorar mudanças na atividade neural e sensibilidade visual em um ou ambos os olhos lateral. A pequena câmara que usamos para gravar ERG é particularmente vantajoso a esse respeito sobre outros projetos (1, 6). Além disso, possui um reservatório de solução salina, que é vedada a partir do ar, eliminando os problemas de estabilidade associados com eletrodos convencionais pavio que pode secar ao longo do tempo. O conjunto de experimentos visão possível com Limulus é ainda maior do que isso, porque os mesmos procedimentos descritos para a gravação do nervo pode ser usado para a estimulação do nervo, ligando o eletrodo conduz a um estimulador elétrico, em vez de um amplificador de sinal.
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Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer o Dr. Werner Birgit por sua ajuda com a produção deste artigo vídeo. Esta pesquisa foi financiada por uma concessão de CARREIRA NSF.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| LED | Light source | Newark Inc | 33C1292 | |
| Suction electrode | Electrode | A-M Systems | 573000 | |
| XCell 3*4-Channel Extracellular Amplifier | Amplifier | FHC, Inc. | 40-40-8B | |
| Intracellular Recording | Amplifier | Cygnus | IR-283A | |
| APM | Neural Spike Discriminator | FHC, Inc. | APM | |
| Bits++ | Video Board | Cambridge Research Systems | Bits++ | |
| Piezopatch Manipulator | Micropositioner | World Precision Instruments, Inc. | PPM5000 | |
| Square Pulse Stimulator | Nerve Stimulator | Grass Technologies | Model S48 | |
| P-97 | Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Borosilicate Glass Capillary | Electrode glass | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Horsesh– crab (Limulus polyphemus) | Animal | Marine Biological Laboratories | ||
| Micropipette Puller | Glass Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Zoom Stereoscope | Microscope | Jed Pella Inc. | SMZ-168 |
References
- Barlow, R. B. Jr Circadian rhythms in the Limulus visual system. J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).
- Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. Cell based model of the Limulus lateral eye. J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).
- Snodderly, D. M. Jr Processing of visual inputs by the brain of Limulus. J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).
- Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. Deciphering a neural code for vision. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).
- Barlow, R. B., Kaplan, E. Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye. Science. 174, 1027-1029 (1971).
- Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye. J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).
