Biology

הדמיה של פליטת אור upregulation הרן-1 Oxygenase בנוהל גואה שא

Published: August 28, 2009 doi: 10.3791/1385

Kenneth K. Kwong^1,2, Lenuta Kloetzer^1,2,3,4, Kelvin K. Wong^5,6, Jia-Qian Ren^1,2, Braden Kuo^1,2,3,4, Yan Jiang⁷, Y. Iris Chen^1,2, Suk-Tak Chan^1,2,8, Geoffrey S. Young⁹, Stephen T.C. Wong^5,6

¹Department of Radiology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, ²Athinoula A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, ³Gastrointestinal Unit, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, ⁴Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, ⁵Center for biotechnology and Informatics, The Methodist Hospital Research Institute, ⁶Department of Radiology, The Methodist Hospital, Weill Cornell Medical College, ⁷Bejing University of Chinese Medicine, ⁸Department of Health Technology and Informatics, The Hong Kong Polytechnic University, ⁹Department of Radiology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

Summary

גואה שא, גירוד הסינית המסורתית לעור טיפולית, גורם תת עורית extravasation כלי הדם דם. אנו מדווחים פרוטוקול של פליטת אור הדמיה של HO-1-

Abstract

גואה שה היא טיפול סינית מסורתית עממית המעסיקה העור מגרד לגרום תת עורית extravasation כלי הדם דם וחבלות. פרוטוקול עבור דימות אופטי bioluminescent של HO-1-

Protocol

נקבה HO-1-בלוציפראז העכברים הטרנסגניים (גיל 4-6 שבועות) ניתן לרכוש חוות Taconic, Inc עם ההגעה, עכברים ממוקמים מתקן דיור חיה לפחות 4 ימים על מנת לאפשר לינה.
הכנה הדמיה פליטת אור:
1. לשקול כל עכבר HO-1. משקל Animal נדרש לחישוב המינון של luciferin.
2. הסרת שיער: השתמש להחליף כותנה ליישם מסיר שיער נאיר ® על הבטן ו / או האחורי של החיה. ההמתנה במשך 5 עד 10 שניות. השתמש להחליף כותנה נקייה לייבש את השיער. טובלים פיסת רקמה במים מזוקקים לייבש את השיער שנותר נקי.
3. מניחים נייר בלתי ניאון שחור (Strathmore Artagain ® נייר שחור) על פלטפורמת הדמיה של תחנת IVIS 100 כדי להפחית את רעשי הרקע.
4. הכן luciferin (מ Xenogen Corporation) פתרון בריכוז של 7.5 מ"ג / מ"ל (מומס סטרילי H ₂ O). המינון של luciferin הוא 65.5 מ"ג / ק"ג משקל גוף. לפיכך, עכבר 20 גרם מחייבת הזרקה intraperitoneal של פתרון 0.175 luciferin מ"ל. כדי להשיג זאת, נפח זריקה אחת של luciferin פתרון (0.175ml) הוא מראש על מזרק עם מחט 26-מד
גואה שא הליך: גואה שא מוחל רק פעם אחת לפני הפעלת פרוטוקול הדמיה פליטת אור. מאז גואה שא אינו כואב, העכבר צריך רק להיות בהרדמה בקצרה על ידי isoflurane להישאר רגוע. הליך גואה שא כולל את השלבים הבאים:
1. החל שמן בישול או מים מזוקקים לשמן העור באזורים ממוקדים על ידי גואה שא כמה פעמים במהלך ההליך גואה שא.
2. שוב ושוב לגרד את האזור ללא שיער האחורי של העכבר בכוח עדין אך תקיף בעזרת כף מרק קרמיקה או כפית פלסטיק.
3. גירוד ממשיך עד שהעור האחורי הופך לאדום, וזה סימן של דם תת עורי extravasation, מושגת בדרך כלל תוך 2 עד 3 דקות.
הדמיה פליטת אור עשויה להיות נכתבו מיד או כמה שעות לאחר גואה שא כמו HO-1 upregulation נבנית באיטיות לאורך מספר שעות. הליך הדמיה פליטת אור היא:
1. להרדים את העכבר בתא הרדמה אינדוקציה ממולא בתערובת של אוויר כיתה isoflurane (1.5%) וציוד רפואי.
2. לאחר העכבר הוא הרדים, להזיז את העכבר אל תא הדמיה בתחנת IVIS 100 הדמיה אופטית. מקם את העכבר במצב שכיבה (עד הבטן). החדר הדמיה הוא החדיר ברציפות עם 1.5% isoflurane. הפלטפורמה הדמיה מחומם על 37 מעלות צלזיוס כדי לשמור על העכבר חם.
3. הגדר את רכישת הדמיה ב "binning בינוני" זמן החשיפה נקבע להיות 30 שניות. התחל לרכוש תמונות. הגדר את מכונת לחזור על רכישת הדמיה כל שלוש דקות, באופן ידני או אוטומטי. לאחר הרכישה של התמונה הראשונה, באזור של עניין (ROI) נמשך על מנת לכסות את החזה הבטן, ובאזור הראש. ההחזר על ההשקעה זה מועתק אז ולהדביק את התמונות הבאות באמצעות "תמונה חיה ®", בתוכנה הנלווית תחנת 100 IVIS.
4. עוצמת האות נמדדת פוטונים בשנייה. זמן סמן עוצמת האות להגיע לשיאו ערך ולשמור על הדמיה את העכבר במשך כ 5 עד 10 דקות אחרי זמן שיא.
5. כאשר הרכישה הדמיה במיקום פרקדן נעשה, להעיף את העכבר מעל ולהניח אותה בעמדה מועדים (לגבות). המשך הדמיה חיה של 5 עד 10 דקות עם ROI נמשך כעת העטיפה האחורית ואזור ראש בשימוש של "תמונה חיה ®" התוכנה. הבחירה של הדמיה את המיקום נוטה לאחר עמדת פרקדן היא שרירותית. אפשר לבחור להתחיל עם עמדת מועדים, בהתאם האיברים העיקריים של עניין. אפשרות נוספת היא התמונה עמדות פרקדן ונוטים על ניסויים נפרדים.
6. כאשר הרכישה הדמיה במיקום נוטה נגמר, כבה isoflurane ו להזיז את העכבר מהאולם הדמיה לתא אינדוקציה להתאושש. החדר אינדוקציה הוא החדיר עכשיו עם האוויר רפואי בלבד העכבר בדרך כלל מתעורר מדקה אחת פחות.
7. שמירת נתונים הדמיה עבור שלאחר עיבוד.
8. לאחר המחקר הראשוני הדמיה, רכישות הדמיה נוספות מתבצעות במשך כמה ימים אחרי גואה שא. אחת לתזמן המדגם הוא חזר הדמיה בשעה ^ה -12, ^ה 24 שעות, 36 שעות ביממה ^{ה, ה} 48 שעות, 72 שעות ביממה ^nd ו 120 שעות ^ה אבל התזמון המדויק של הזמנים הדמיה היא גמישה. הפעלות הדמיה נוספות ניתן להוסיף אם כבר מעקב נדרש. לפני הדמיה, חזור על הליך הסרת שיער אם השיער גדל בחזרה.
עבור קבוצת הביקורת, לחזור על כל התהליך אבל לדלג גואה שא (שלב 3). אם אותה קבוצה של עכברים משמשת עבור שניהם מלאה גואה שא, את השליטה experiment צריך להתבצע רצוי לפני ההליך גואה שה או לפחות חודש אחד לאחר מכן.

נציג תוצאות:

התמונות פליטת אור אצל דמות 1 להראות upregulation vivo של HO-1 בתגובה גואה שא. הגרף באיור 2 ניתן לראות את השינוי הזמני כמותי מעל 120 שעות השטף אופטיים (פוטונים / sec) מן הגוף של עכבר באותו הקשורים גואה שא ...

דמות 1
באיור 1. משמאל, תמונות מייצג של הזכות להציג את הקדמי (פרקדן) של עכבר אותו לפני גואה שא, ב 18 שעות, 36 שעות ו 120 שעות שלאחר גואה שא, בהתאמה. אחרי גואה שא, אחד מציין את ההתקדמות של עלייה משמעותית בעוצמת האות באיברים רבים אשר מקיפים אזורים של מערכת העיכול, מערכת המין, הכבד, הכליות (מתצוגת לאחור, לא מוצג), ואחרים. אנא לחץ כאן עבור גרסה גדולה יותר של דמות 1.

איור 2. שינוי כמותי של השטף (פוטונים / sec) מן הגוף במעקב במשך 120 שעות לאחר גואה שא בעכבר זהה של איור 1. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תמלול של HO-1, ועין מתנהלת בצורה של heme oxygenase, הוא שהוגברו על ידי גורמים רבים, כולל heme, מי חמצן, קרינה UV, היפוקסיה, ומדגיש פיזית. הדמיה הגוף כגון פרוטוקול דיווח HO 1-פליטת אור מספק תמונת מצב מהירה של הביטוי HO-1 מערכתית באיברים רבים. אצל בעלי חיים קטנים, הדמיה פליטת אור מאפשר רגישות גבוהה ב-vivo בזמן אמת הערכה כמותית אופטי האורך של שינויים בביטוי הגנים מערכתית, כפי שמוצג. פליטת אור הדמיה מולקולרית מורידה את העלות ומגדיל את התפוקה של הביטוי מבחני גן חיות קטן, מה שהופך אותו מעשית במהירות להשיג את הכוח הסטטיסטי הדרוש לחקירה של השערה מערכות מורכבות בביולוגיה כדי להעריך את ההשפעות המערכתיות של הצעת התערבויות טיפוליות תרופות אחרות. מגבלה אחת היא ברזולוציה מרחבית נמוכה של האנטומיה. חדש מערכות הדמיה אופטית, כי יש יכולת טומוגרפית יכול להקל את הבעיה. רכישת תמונה אחת על ידי מיקרו CT או MRI חיה קטנה יעזור שצריך לזהות את האנטומיה. מגבלות נוספות הן חדירה אור נמוך דרך רקמות ואת הצורך חיות טרנסגניות. אלה למעשה למנוע התרגום לבעלי חיים גדולים יותר או לשימוש האדם, אבל הם לא חיסרון משמעותי עבור בעלי חיים ביולוגיה מערכות קטנות או השערה פרה בדיקה רפואית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ק 'וונג, וונג STC נתמכים על ידי למימון מתוך פונקציונליים הדמיה מולקולרית מרכז, Brigham and החולים לנשים
ק 'וונג, וונג STC נתמכים על ידי המרכז ביוטכנולוגיה and Informatics, בית החולים המתודיסטית מכון המחקר, Weill Cornell Medical College.
KK קוונג, אני חן, JQ רן נתמכים על ידי מימון של א Athinoula Martinos מרכז ביו הדמיה, בית החולים הכללי במסצ'וסטס.
Lenuta Kloetzer, בריידן קואו נתמכים על ידי מימון מהמרכז לחקר Neuroenteric, בית החולים הכללי במסצ'וסטס
המחברים מודים בני הזוג. ש ו X. זנג שו הדמיה אופטית של המעבדה, בריגהאם ובית החולים לנשים לעזרה טכנית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Luciferin	Caliper Life Sciences	P/N 122796	Previously Xenogen
IVIS 100	Caliper Life Sciences		Previously Xenogen