Summary
Gua Sha, raspagem de pele tradicional chinesa terapêutica, causa extravasamento de sangue por via subcutânea microvascular. Relatamos um protocolo de imagem de bioluminescência de HO-1-
Abstract
Gua Sha é uma terapia popular tradicional chinesa que emprega raspagem da pele para causar subcutânea extravasamento de sangue microvascular e contusões. O protocolo de imagem óptica bioluminescente da HO-1-
Protocol
- Feminino HO-1-luciferase camundongos transgênicos (idade de 4-6 semanas) pode ser comprado de Taconic Farms, Inc. Após a chegada, os ratos são colocados em uma instalação de alojamento dos animais durante pelo menos 4 dias para permitir acomodação.
- Preparação para a imagem de bioluminescência:
- Pesar cada rato HO-1. Peso do animal é necessário para calcular a dosagem de luciferina.
- Depilação: Use um cotonete para aplicar removedor de pêlos Nair ® sobre o abdome e / ou traseira do animal. À espera de 5 a 10 segundos. Utilize um cotonete limpo para limpar o cabelo. Mergulhe um pedaço de tecido em água destilada para limpar o cabelo restante limpo.
- Coloque um papel não-fluorescente preto (Strathmore Artagain ® papel preto) na plataforma de imagem de uma estação de 100 IVIS para reduzir o ruído de fundo.
- Prepare luciferina (de Xenogen Corporation) solução na concentração de 7,5 mg / ml (dissolvida em estéril H 2 O). A dose de luciferina é o peso corporal 65,5 mg / kg. Assim, um mouse de 20 gramas requer injeção intraperitoneal de solução de luciferina 0,175 ml. Para conseguir isso, um volume de injeção única de luciferina solução (0.175ml) é pré-carregado a uma seringa com uma agulha de calibre 26
- Gua Sha procedimento: Gua Sha é aplicado apenas uma vez antes de executar o protocolo de imagem de bioluminescência. Desde Gua Sha não é doloroso, o rato só precisa ser brevemente anestesiados com isoflurano para manter a calma. Gua Sha processo inclui as seguintes etapas:
- Aplicar óleo de cozinha ou água destilada para lubrificar áreas da pele alvo de Gua Sha algumas vezes durante o procedimento de Sha Gua.
- Repetidamente raspar o cabelo região livre da parte traseira do mouse em vigor suave, mas firme com uma colher de sopa de cerâmica ou uma colher de plástico.
- A raspagem continua até que a pele fica vermelha de volta, que é um sinal de extravasamento de sangue por via subcutânea, geralmente atingida dentro de 2 a 3 minutos.
- Imagem de bioluminescência pode ser iniciado imediatamente ou várias horas após Gua Sha como HO-1 upregulation é construída lentamente ao longo de algumas horas. O procedimento para a imagem latente da bioluminescência é:
- Anestesiar o rato em uma câmara de indução da anestesia preenchido com uma mistura de ar grade isoflurano (1,5%) e médicos.
- Uma vez que o mouse está anestesiado, mova o mouse para a câmara de imagem na estação de imagem óptico IVIS 100. Posicione o mouse em decúbito dorsal (barriga para cima). A câmara de imagem é continuamente infundidos com 1,5% de isoflurano. A plataforma de imagem é aquecida a 37 ° C para manter o mouse quente.
- Definir a aquisição de imagens em "binning médio" e tempo de exposição definido para ser 30 segundos. Começar a adquirir imagens. Configurar a máquina para repetir a aquisição de imagem a cada três minutos, manual ou automaticamente. Após a aquisição da primeira imagem, uma região de interesse (ROI) é desenhada para cobrir o tórax, abdominal, e região da cabeça. Este ROI é então copiado e colado às imagens a seguir usando "Living Imagem ®", software que acompanha o IVIS 100 estação.
- Intensidade do sinal é medido em fótons por segundo. Tempo para marcar a intensidade do sinal para chegar ao seu valor de pico e manter a imagem o mouse por cerca de 5 a 10 minutos após o horário de pico.
- Quando a aquisição de imagens na posição supina é feito, flip o mouse e colocá-lo na posição prona (back up). Continue imagem do animal de 5 a 10 minutos com o ROI agora desenhadas para cobrir as costas ea região da cabeça no uso do "imagem viva ®" software. A escolha da imagem na posição prona, após a posição supina é arbitrária. Pode-se optar por começar com a posição prona, dependendo de os principais órgãos de interesse. Outra opção é a imagem posições supina e propenso a experimentos separados.
- Quando a aquisição de imagem na posição prona é terminado, desligue o isoflurano eo movimento do mouse da câmara de imagem para a câmara de indução para se recuperar. A câmara de indução é agora infundido com ar médica e só o mouse normalmente acorda em menos de um minuto.
- Salvar dados de imagem para pós-processamento.
- Após o estudo de imagem inicial, aquisições de imagem adicionais são realizadas por vários dias após Gua Sha. Uma agenda de amostra é repetida imagem na hora 12 ª, 24 ª hora, 36 ª hora, 48 ª hora, 72 horas nd e 120 ª hora, mas o momento exato do calendário de imagem é flexível. Sessões de imagem adicionais podem ser adicionados se um longo acompanhamento é necessário. Antes de imagem, repita o procedimento de remoção do cabelo se o cabelo tem crescido de volta.
- Para o grupo controle, repita todo o procedimento, mas ignorar Gua Sha (passo 3). Se o mesmo grupo de ratos é utilizado tanto para controle e Gua Sha, o controle de experiment deve ser realizada preferencialmente antes do procedimento sha Gua ou, pelo menos, um mês depois.
Resultados representativos:
As imagens mostram a bioluminescência na figura 1 em upregulation vivo da HO-1 em resposta a Gua Sha. O gráfico da Figura 2 mostra a mudança quantitativa temporal sobre 120 horas em fluxo óptico (fótons / seg) de todo o corpo do mouse mesmo relacionadas com Gua Sha ...
Figura 1. Da esquerda para a direita, as imagens representativas da vista frontal (supino) do mouse mesmo antes de Gua Sha, às 18 horas, 36 horas e 120 horas após a Gua Sha, respectivamente. Depois de Gua Sha, observa-se o progresso do aumento significativo intensidade de sinal em múltiplos órgãos, que abrangem as regiões do trato gastrointestinal, o trato genital, o fígado, rins (do ponto de vista de volta, não mostrado), e outros. Por favor, clique aqui para uma versão ampliada da figura 1.
Figura 2. Mudança quantitativa do fluxo (fótons / seg) de todo o corpo rastreadas mais de 120 horas após Gua Sha no mouse mesmo da Figura 1. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 2.
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Discussion
Transcrição de HO-1, uma forma induzível da heme oxigenase, é regulada por vários fatores, incluindo heme, peróxido de hidrogênio, radiação UV, hipóxia e stress físico. Imagens de corpo inteiro, como o relatado HO-1 protocolo de bioluminescência fornece uma visão rápida de expressão de HO-1 sistêmica em múltiplos órgãos. Em pequenos animais, imagem de bioluminescência permite alta sensibilidade in vivo em tempo real avaliação quantitativa longitudinal óptico de alterações na expressão genética sistêmica, como mostrado. Imagem de bioluminescência molecular reduz o custo e aumenta a taxa de transferência de ensaios de expressão gênica em animais de pequeno porte, tornando-o prático para rapidamente atingir o poder estatístico necessário para a investigação de hipótese de complexos sistemas de biologia, para avaliar os efeitos sistémicos da proposta farmacêuticas e outras intervenções terapêuticas. Uma limitação é baixa resolução espacial da anatomia. Novos sistemas de imagem óptico que têm capacidade tomográfica iria aliviar o problema. Aquisição de imagens e registro de micro-CT ou MRI pequenos animais ajudaria a identificar corretamente a anatomia. Outras limitações são a penetração da luz baixa através do tecido e da necessidade de animais transgênicos. Estes essencialmente impede tradução para animais de maior porte ou uso humano, mas não são uma desvantagem significativa para pequenos animais biologia de sistemas e testes de hipóteses pré-clínicos terapêuticos.
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Acknowledgments
K. Wong, Wong STC são suportados pelo financiamento do Funcional e Molecular Imaging Center, Brigham e hospital das mulheres
K. Wong, Wong STC são suportados pelo Centro de Biotecnologia e Informática, The Methodist Hospital Research Institute, Weill Cornell Medical College.
KK Kwong, I. Chen, JQ Ren são suportados pelo financiamento do A. Athinoula Martinos Center for Biomedical Imaging, Massachusetts General Hospital.
Lenuta Kloetzer, Braden Kuo são suportados por fundos do Centro de Pesquisa neuroentérico, Massachusetts General Hospital
Os autores agradecem os drs. Q. Xu X. Zeng e de imagem Optical Lab, Brigham e do Hospital da Mulher para ajuda técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luciferin | Caliper Life Sciences | P/N 122796 | Previously Xenogen |
| IVIS 100 | Caliper Life Sciences | Previously Xenogen |
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