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Biology

Heme Oxygenase 1 upregulation के गुआ शा प्रक्रिया में bioluminescence इमेजिंग

Published: August 28, 2009 doi: 10.3791/1385
Automatic Translation
1,2, 1,2,3,4, 5,6, 1,2, 1,2,3,4, 7, 1,2, 1,2,8, 9, 5,6
1Department of Radiology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Athinoula A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 3Gastrointestinal Unit, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 4Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 5Center for biotechnology and Informatics, The Methodist Hospital Research Institute, 6Department of Radiology, The Methodist Hospital, Weill Cornell Medical College, 7Bejing University of Chinese Medicine, 8Department of Health Technology and Informatics, The Hong Kong Polytechnic University, 9Department of Radiology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

Summary

गुआ शा, पारंपरिक चीनी चिकित्सकीय त्वचा scraping, चमड़े के नीचे microvascular रक्त extravasation का कारण बनता है. हम रिपोर्ट के bioluminescence इमेजिंग के एक प्रोटोकॉल हो-1-

Abstract

गुआ शा एक पारंपरिक चीनी लोक चिकित्सा है कि त्वचा को रोजगार उपचर्म microvascular रक्त extravasation और चोट के निशान के कारण scraping है. हो-1 प्रोटोकॉल के bioluminescent ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए

Protocol

  1. स्त्री हो-1-luciferase ट्रांसजेनिक चूहों (4-6 सप्ताह की आयु) के आगमन पर, Inc Taconic फार्म से खरीदा जा सकता है है, चूहों एक जानवर आवास की सुविधा में कम से कम 4 दिनों के लिए रखा जाता है के लिए आवास की अनुमति.
  2. Bioluminescence इमेजिंग के लिए तैयार:
    1. प्रत्येक HO-1 माउस वजन. पशु वजन luciferin की खुराक की गणना के लिए आवश्यक है.
    2. बालों को हटाने: एक कपास स्वैप का उपयोग करें और या जानवर की पीठ पेट / पर बाल हटानेवाला नायर ® लागू. 5 से 10 सेकंड के लिए प्रतीक्षा कर रहा है. एक साफ सूती स्वैप का प्रयोग बंद बाल पोंछ. आसुत जल में ऊतक का एक टुकड़ा डुबकी साफ शेष बाल पोंछ.
    3. एक IVIS 100 स्टेशन पृष्ठभूमि शोर को कम करने के इमेजिंग मंच पर एक गैर फ्लोरोसेंट काले कागज (Strathmore Artagain ® काले कागज) रखें.
    4. Luciferin (Xenogen निगम से) 7.5 मिलीग्राम / एमएल (बाँझ एच 2 हे में भंग) की एकाग्रता पर समाधान तैयार करें. luciferin की खुराक 65.5 शरीर मिलीग्राम / किग्रा वजन है. इस प्रकार, एक 20 ग्राम माउस 0.175 मिलीलीटर luciferin समाधान की intraperitoneal इंजेक्शन की आवश्यकता है. इस लक्ष्य को हासिल करने के luciferin समाधान (0.175ml) का एक इंजेक्शन की मात्रा एक 26 गेज सुई के साथ एक सिरिंज के लिए preloaded है
  3. गुआ शा प्रक्रिया: गुआ शा केवल एक बार bioluminescence इमेजिंग प्रोटोकॉल चलाने से पहले लागू किया जाता है. चूंकि गुआ शा दर्दनाक नहीं है, माउस केवल संक्षिप्त anesthetized शांत रहने isoflurane द्वारा की जरूरत है. गुआ शा प्रक्रिया के बाद कदम शामिल हैं:
    1. खाना पकाने के तेल या आसुत जल त्वचा गुआ शा द्वारा गुआ शा प्रक्रिया के दौरान कुछ समय लक्षित क्षेत्रों चिकना लागू करें.
    2. Repetitively एक चीनी मिट्टी सूप चम्मच या एक प्लास्टिक के चम्मच का उपयोग कोमल, लेकिन फर्म बल में माउस के पीछे के बाल मुक्त क्षेत्र परिमार्जन.
    3. scraping जारी रहता है जब तक वापस त्वचा लाल हो जाता है, जो उपचर्म रक्त extravasation का एक संकेत है, आम तौर पर 2 से 3 मिनट के भीतर हासिल है.
  4. Bioluminescence इमेजिंग गुआ शा के बाद तुरंत या कई घंटे शुरू हो सकता है के रूप में हो एक upregulation बनाया गया है धीरे धीरे कुछ घंटे से अधिक है. bioluminescence इमेजिंग के लिए प्रक्रिया है:
    1. एक संज्ञाहरण प्रेरण isoflurane (1.5%) और चिकित्सा ग्रेड हवा का एक मिश्रण से भरा कक्ष में माउस anesthetize.
    2. एक बार माउस anesthetized है, IVIS 100 ऑप्टिकल इमेजिंग स्टेशन पर इमेजिंग चैम्बर के लिए माउस हिलना. एक लापरवाह स्थिति (अप पेट) में माउस की स्थिति. इमेजिंग चैम्बर लगातार isoflurane के 1.5% के साथ संचार होता है. इमेजिंग मंच 37 पर गरम किया जाता है ° सी माउस गर्म रखने के लिए.
    3. "मध्यम binning" इमेजिंग के अधिग्रहण और सेट जोखिम के लिए 30 सेकंड का समय सेट करें. प्रारंभ के लिए छवियों को प्राप्त. सेट मशीन इमेजिंग अधिग्रहण हर तीन मिनट में दोहराने के लिए, या तो स्वयं या स्वतः. पहली छवि के अधिग्रहण के बाद, ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र के पेट, छाती और सिर क्षेत्र को कवर करने के लिए तैयार है. इस रॉय तो नकल की है और निम्नलिखित "लिविंग छवि ®" IVIS 100 स्टेशन के साथ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों के लिए चिपकाया.
    4. सिग्नल तीव्रता प्रति सेकंड photons में मापा जाता है. मार्क समय संकेत तीव्रता के लिए अपने चरम मूल्य तक पहुँचने के लिए और के बारे में पीक समय के बाद 5 से 10 मिनट के लिए माउस इमेजिंग पर रखने.
    5. ढालुआं स्थिति में इमेजिंग अधिग्रहण किया है, जब माउस फ्लिप पर और यह प्रवण की स्थिति (वापस ऊपर) में निहित है. अब वापस और सॉफ्टवेयर "लिविंग छवि ®" के उपयोग में सिर क्षेत्र को कवर करने के लिए तैयार रॉय के साथ 5 से 10 मिनट के लिए पशु इमेजिंग जारी रखें. इमेजिंग की पसंद लापरवाह स्थिति के बाद प्रवण स्थिति मनमाना है. एक प्रवण की स्थिति के साथ शुरू करने के लिए, ब्याज की प्राथमिक अंगों पर निर्भर करता है चुन सकते हैं. एक अन्य विकल्प अलग प्रयोगों में लापरवाह और प्रवण पदों छवि है.
    6. जब प्रवण की स्थिति में इमेजिंग अधिग्रहण समाप्त हो गया है, बंद isoflurane और इमेजिंग कक्ष से प्रेरण चैम्बर के लिए माउस ठीक करने के लिए कदम. प्रेरण चैम्बर अब चिकित्सा केवल हवा और माउस आम तौर पर कम से कम एक मिनट में जाग के साथ संचार होता है.
    7. पोस्ट प्रोसेसिंग के लिए इमेजिंग डेटा सहेजें.
    8. प्रारंभिक इमेजिंग अध्ययन के बाद, अतिरिक्त इमेजिंग अधिग्रहण गुआ शा के बाद कई दिनों के लिए किया जाता है. एक नमूना अनुसूची 12 वीं घंटे, 24 वें घंटे, 36 वें घंटे, 48 वें घंटे, 72 एन डी घंटे और 120 वें घंटे में इमेजिंग दोहराया है, लेकिन इमेजिंग अनुसूची की सटीक समय लचीला है . अतिरिक्त इमेजिंग सत्र अगर एक लंबे समय तक का पालन करें अप की जरूरत है जोड़ा जा सकता है है. इमेजिंग से पहले, बाल हटाने प्रक्रिया अगर बाल वापस हो गया है दोहराएँ.
  5. नियंत्रण समूह के लिए सभी प्रक्रिया दोहराने लेकिन गुआ शा (कदम 3) को छोड़. यदि चूहों के एक ही समूह दोनों नियंत्रण और गुआ शा, नियंत्रण ऍक्स्प के लिए प्रयोग किया जाता हैeriment बाहर किया जाना चाहिए अधिमानतः गुआ शा प्रक्रिया से पहले या कम से कम एक महीने के बाद.

प्रतिनिधि परिणाम:

bioluminescence छवियों में यह आंकड़ा 1 गुआ शा करने के लिए प्रतिक्रिया में हो-1 के vivo upregulation में शो. चित्रा 2 में ग्राफ ही गुआ शा से संबंधित माउस के पूरे शरीर से ऑप्टिकल प्रवाह (/ फोटॉनों सेकंड) मात्रात्मक 120 घंटे से अधिक अस्थायी परिवर्तन से पता चलता है ...

1 आंकड़ा
चित्रा 1 बाएं से गुआ शा से पहले ही माउस के सामने दृश्य (लापरवाह) के सही प्रतिनिधि छवियों, 18 घंटे, 36 घंटे और 120 घंटे पोस्ट गुआ शा में, क्रमशः के लिए. . गुआ शा के बाद, एक कई अंगों जो जठरांत्र संबंधी मार्ग, जननांग पथ, जिगर, गुर्दे (वापस देखने से नहीं दिखाया गया है), और दूसरों के क्षेत्रों धरना में महत्वपूर्ण संकेत तीव्रता में वृद्धि की प्रगति के अनुसार. कृपया संख्या 1 के एक बड़े संस्करण के लिए यहाँ क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2 प्रवाह की मात्रात्मक परिवर्तन (/ फोटॉनों सेकंड) चित्रा 1 के एक ही माउस में पूरे 120 घंटे से अधिक ट्रैक किए गए शरीर से गुआ शा निम्नलिखित . कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा 2 का एक बड़ा संस्करण देख.

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Discussion

हो-1, heme oxygenase के एक inducible फार्म, के ट्रांसक्रिप्शन heme, हाइड्रोजन पेरोक्साइड, यूवी विकिरण, hypoxia, और शारीरिक तनाव सहित कई कारकों द्वारा upregulated है. रिपोर्ट हो 1 bioluminescence प्रोटोकॉल के रूप में पूरे शरीर इमेजिंग कई अंगों में प्रणालीगत हो-1 अभिव्यक्ति की एक त्वरित स्नैपशॉट प्रदान करता है. छोटे जानवरों में bioluminescence इमेजिंग में vivo उच्च संवेदनशीलता वास्तविक समय मात्रात्मक प्रणालीगत जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के अनुदैर्ध्य ऑप्टिकल मूल्यांकन, के रूप में दिखाया गया की अनुमति देता है. Bioluminescence आणविक इमेजिंग लागत को कम करती है और छोटे जानवरों में जीन अभिव्यक्ति assays के throughput बढ़ जाती है, यह व्यावहारिक तेजी से सांख्यिकीय जटिल प्रणालियों जीव विज्ञान परिकल्पना की जांच के लिए की जरूरत शक्ति प्राप्त करने के लिए और प्रस्तावित दवा और अन्य उपचारात्मक उपायों के प्रणालीगत प्रभाव के लिए आकलन कर रही है. शरीर रचना की एक सीमा कम स्थानिक संकल्प है. नई ऑप्टिकल इमेजिंग प्रणाली है कि tomographic क्षमता है समस्या को कम होगा. छवि और सूक्ष्म सीटी या छोटे जानवर एमआरआई द्वारा अधिग्रहण पंजीकरण करने के लिए ठीक से शरीर रचना की पहचान में मदद मिलेगी. अन्य सीमाओं ऊतकों के माध्यम से कम प्रकाश पैठ और ट्रांसजेनिक जानवरों के लिए जरूरत है. ये अनिवार्य रूप से बड़े जानवरों या मानव उपयोग के लिए अनुवाद रोकता है, लेकिन छोटे जानवर सिस्टम जीव विज्ञान या preclinical चिकित्सीय परिकल्पना परीक्षण के लिए एक महत्वपूर्ण दोष नहीं हैं.

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Acknowledgments

लालकृष्ण वाँग, एसटीसी वाँग कार्यात्मक और आण्विक इमेजिंग सेंटर, ब्रिघम और महिला अस्पताल से धन के द्वारा समर्थित हैं
लालकृष्ण वाँग, एसटीसी वाँग जैव प्रौद्योगिकी और सूचना, मेथोडिस्ट अस्पताल रिसर्च इंस्टिट्यूट, वेल कॉर्नेल मेडिकल कॉलेज के लिए केंद्र द्वारा समर्थित हैं.
के.के. Kwong, मैं चेन, JQ रेन बायोमेडिकल इमेजिंग, मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल के लिए Athinoula ए Martinos केंद्र से धन के द्वारा समर्थित हैं.
Lenuta Kloetzer, Braden कू Neuroenteric रिसर्च सेंटर, मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल से धन के द्वारा समर्थित हैं
लेखकों डीआरएस धन्यवाद. अतारांकित ज़ेंग और ऑप्टिकल इमेजिंग लैब, ब्रिघम और तकनीकी मदद के लिए महिला अस्पताल के एक्स जू.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Luciferin Caliper Life Sciences P/N 122796 Previously Xenogen
IVIS 100 Caliper Life Sciences Previously Xenogen

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References

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Kwong, K. K., Kloetzer, L., Wong, K. … More

Kwong, K. K., Kloetzer, L., Wong, K. K., Ren, J., Kuo, B., Jiang, Y., Chen, Y. I., Chan, S., Young, G. S., Wong, S. T. Bioluminescence Imaging of Heme Oxygenase-1 Upregulation in the Gua Sha Procedure. J. Vis. Exp. (30), e1385, doi:10.3791/1385 (2009).

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