Summary
Gua Sha, traditionell kinesisk terapeutisk hud skrapa orsakar subkutan mikrovaskulära blod extravasering. Vi rapporterar ett protokoll för mareld avbildning av HO-1-
Abstract
Gua Sha är en traditionell kinesisk folkmusik terapi som sysselsätter huden skrapas för att orsaka subkutan mikrovaskulära blod extravasation och blåmärken. Protokollet för självlysande optisk avbildning av HO-1-
Protocol
- Kvinna HO-1-luciferas transgena möss (ålder 4-6 veckor) kan köpas från Taconic Farms, Inc. Vid ankomsten är möss placeras i ett djurstall anläggning för minst 4 dagar för att möjliggöra boende.
- Förberedelse för bioluminescence avbildning:
- Väg varje HO-1 mus. Djurens vikt krävs för att beräkna doseringen av luciferin.
- Hårborttagning: Använd en bomullstuss swap att tillämpa hårborttagare Nair ® över buken och / eller baksidan av djuret. Väntar på 5 till 10 sekunder. Använd en ren bomull swap för att torka bort hår. Doppa en bit vävnad i destillerat vatten för att torka rent resterande hår.
- Placera ett icke-fluorescerande svart papper (Strathmore Artagain ® svart papper) på avbildning plattform av en IVIS 100 station för att minska bakgrundsljud.
- Förbered luciferin (från Xenogen Corporation) lösning vid koncentration av 7,5 mg / ml (löst i sterilt H 2 O). Dosen av luciferin är 65,5 mg / kg kroppsvikt. Således kräver en 20 gram mus intraperitoneal injektion av 0,175 ml luciferin lösning. För att uppnå detta är en enda injektion volym luciferin lösning (0.175ml) förinstallerad med en spruta med en 26-gauge nål
- Gua Sha förfarande: Gua Sha används bara en gång innan du kör protokollet bioluminescence avbildning. Eftersom Gua Sha är inte smärtsam, behöver musen bara för att kort bedövas med isofluran att vara lugn. Gua Sha förfarande omfattar följande steg:
- Applicera matolja eller destillerat vatten för att smörja huden områden som omfattas av Gua Sha ett par gånger under Gua Sha förfarande.
- Upprepade skrapa hårfri regionen baksidan av musen i mjuka men bestämda kraft med hjälp av en keramisk soppa sked eller en plastsked.
- Den skrapning fortsätter tills ryggen huden blir röd, vilket är ett tecken på subkutan blod extravasering, uppnås vanligen inom 2 till 3 minuter.
- Bioluminescence avbildning kan startas omedelbart eller flera timmar efter Gua Sha som HO-1 är uppreglering byggts upp långsamt under några timmar. Förfarandet för bioluminescens avbildning är:
- Bedöva musen i en anestesi induktion kammare fylld med en blandning av isofluran (1,5%) och medicinsk kvalitet luft.
- När musen är sövda, flytta musen till den avbildning kammare på IVIS 100 optisk avbildning station. Placera musen i ryggläge (buken uppåt). Den avbildning kammaren är ständigt infunderas med 1,5% av isofluran. Den avbildning plattform är uppvärmd till 37 ° C för att hålla musen varm.
- Ställ Bildtagning på "medium binning" och ställa in exponering tid att vara 30 sekunder. Börja med att skaffa bilder. Ställa in maskinen att upprepa Bildtagning var tredje minut, antingen manuellt eller automatiskt. Efter förvärvet av den första bilden, är en region av intresse (ROI) dras för att täcka buken, bröstkorgen och huvudet området. Detta ROI är sedan kopieras och klistras in i följande bilder med hjälp av "® levande bild", programvara medföljer IVIS 100 stationen.
- Signalstyrka mäts i fotoner per sekund. Markera dags för signalstyrkan för att nå sin topp värde och hålla på bildbehandling musen för cirka 5 till 10 minuter efter rusningstid.
- När Bildtagning i ryggläge är klar, vänd på musen och lägg det i liggande läge (backup). Fortsätt avbildning av djuret för 5 till 10 minuter med ROI nu dras för att täcka ryggen och huvudet området i användning av programvaran "Living Image ®". Valet av bildbehandling i liggande ställning efter att ryggläge är godtyckligt. Man kan välja att börja med liggande, beroende på de primära organen av intresse. Ett annat alternativ är att bilden liggande och benägna befattningar på olika experiment.
- När Bildtagning i liggande är klar, stäng av isofluran och flytta musen från avbildning kammaren till induktionskammare att återhämta sig. Den induktionskammare är nu infunderas med medicinsk luft bara och musen oftast vaknar upp på mindre än en minut.
- Spara bilddata för efterbehandling.
- Efter den första Imaging studien är ytterligare avbildning förvärv genomförs i flera dagar efter Gua Sha. Ett prov schema upprepas bildhantering på 12: e timme, 24: e timme, 36: e timme, 48: e timme, 72: a timme och 120: e timme men den exakta tidpunkten för bildbehandling schemat är flexibelt. Ytterligare avbildning sessioner kan läggas till om en längre uppföljning behövs. Innan avbildning, upprepa håret bort procedur om hår har växt tillbaka.
- För kontrollgruppen, upprepa alla förfarandet men hoppa Gua Sha (steg 3). Om samma grupp möss används för både kontroll och Gua Sha, kontroll experiment bör genomföras helst före Gua sha förfarande eller minst en månad efteråt.
Representativa resultat:
Den mareld bilderna i figur 1 visar in vivo uppreglering av HO-1 som svar på Gua Sha. Diagrammet i Figur 2 visar den kvantitativa tidsmässiga förändringen över 120 timmar på optisk flux (fotoner / sek) från hela kroppen av samma musen rör Gua Sha ...
Figur 1. Från vänster till höger, representativa bilder av framifrån (liggande) av samma musen innan Gua Sha, på 18 timmar, 36 timmar och 120 timmar efter Gua Sha, respektive. Efter Gua Sha konstaterar ett framsteg av betydande signalstyrka ökning av flera organ som omfattar regioner i mag-tarmkanalen, könsorganen, lever, njurar (från baksidan vyn visas inte), och andra. Vänligen klicka här för en större version av figur 1.
Figur 2. Kvantitativ förändring av flussmedel (fotoner / sek) från hela kroppen spårade över 120 timmar efter Gua Sha i samma mus i figur 1. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transkription av HO-1, en inducerbara formen av heme oxygenas är uppregleras av många faktorer, inklusive heme, väteperoxid, UV-bestrålning, hypoxi och fysiska påfrestningar. Hela kroppen avbildning som rapporterade HO-1 mareld protokollet ger en snabb ögonblicksbild av systemisk HO-1 uttryck i flera organ. I små djur kan bioluminescens bildhantering hög känslighet in vivo i realtid av kvantitativ longitudinell optisk bedömning av förändringar i systemisk genuttryck, som visas. Bioluminescence molekylär bildanalys sänker kostnaderna och ökar genomströmningen av analyser genuttryck i små djur, vilket gör det praktiskt att snabbt uppnå statistisk styrka som behövs för utredning av komplexa system biologi hypotesen och för att bedöma för systemiska effekter av föreslagna läkemedel och andra terapeutiska ingrepp. En begränsning är låg spatial upplösning av anatomin. Nyare optiska bildsystem som har tomografiska kapacitet skulle lindra problemet. Bild förvärv och registrering av mikro-CT eller litet djur MRT skulle bidra till att en korrekt identifiering av anatomin. Andra begränsningar är låga ljuspenetrering genom vävnad och behovet av transgena djur. Dessa utesluter huvudsak översättning till större djur eller människor, men är inte en betydande nackdel för små djur systembiologi eller preklinisk terapeutiska hypotesprövning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
K. Wong, STC Wong stöds av medel från Funktionell och Molecular Imaging Center, Brigham och kvinnors sjukhus
K. Wong, STC Wong stöds av Centrum för bioteknik och informatik, The Methodist Hospital Research Institute, Weill Cornell Medical College.
KK Kwong, I. Chen, JQ Ren stöds av medel från Athinoula A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Massachusetts General Hospital.
Lenuta Kloetzer, Braden Kuo stöds av medel från Neuroenteric Research Center, Massachusetts General Hospital
Författarna tackar Dr. Q. Zeng och X. Xu av optisk avbildning Lab, Brigham och kvinnors sjukhus för teknisk hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luciferin | Caliper Life Sciences | P/N 122796 | Previously Xenogen |
| IVIS 100 | Caliper Life Sciences | Previously Xenogen |
References
- Zhang, W. Selection of potential therapeutics based on in vivo spatiotemporal transcription patterns of heme oxygenase-1. J Mol Med. 80, 655-6564 (2002).
- Zhang, W. Rapid in vivo functional analysis of transgenes in mice using whole body imaging of luciferase expression. Transgenic Res. 10, 423-434 (2001).
- Contag, C. H., Stevenson, D. K. In vivo patterns of heme oxygenase-1 transcription. J Perinatol. 21, Suppl 1. 119-1124 (2001).
- Nielsen, A., Knoblauch, N. T., Dobos, G. J., Michalsen, A., Kaptchuk, T. J. The effect of Gua Sha treatment on the microcirculation of surface tissue: a pilot study in healthy subjects. Explore (NY). 3, 456-466 (2007).
- Schwickert, M. E., Saha, F. J., Braun, M., Dobos, G. J. Gua Sha for migraine in inpatient withdrawal therapy of headache due to medication overuse. Forsch Komplementmed. 14, 297-300 (2007).
- Tsai, P. S., Lee, P. H., Wang, M. Y. Demographics, training, and practice patterns of practitioners of folk medicine in Taiwan: a survey of the Taipei metropolitan area. J Altern Complement Med. 14, 1243-1248 (2008).
- Nielsen, A. Gua sha research and the language of integrative medicine. J Bodyw Mov Ther. 13, 63-72 (2009).
- Contag, C. H. Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter. Photochem Photobiol. 66, 523-531 (1997).
- Cui, K., Xu, X., Zhao, H., Wong, S. T. A quantitative study of factors affecting in vivo bioluminescence imaging. Luminescence. 23, 292-295 (2008).
- Shibahara, S., Yoshida, T., Kikuchi, G. Mechanism of increase of heme oxygenase activity induced by hemin in cultured pig alveolar macrophages. Arch Biochem Biophys. 197, 607-617 (1979).
- Lee, P. J. Hypoxia-inducible factor-1 mediates transcriptional activation of the heme oxygenase-1 gene in response to hypoxia. J Biol Chem. 272, 5375-5381 (1997).
- Maines, M. D. The heme oxygenase system: a regulator of second messenger gases. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 37, 517-554 (1997).
- Wunder, C., Potter, R. F. The heme oxygenase system: its role in liver inflammation. Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord. 3, 199-208 (2003).
- Hoekstra, K. A., Godin, D. V., Cheng, K. M. Protective role of heme oxygenase in the blood vessel wall during atherogenesis. Biochem Cell Biol. 82, 351-359 (2004).
- Yang, N. C., Lu, L. H., Kao, Y. H., Chau, L. Y. Heme oxygenase-1 attenuates interleukin-1beta-induced nitric oxide synthase expression in vascular smooth muscle cells. J Biomed Sci. 11, 799-809 (2004).
- Morse, D., Choi, A. M. Heme oxygenase-1: from bench to bedside. Am J Respir Crit Care Med. 172, 660-670 (2005).
- Ryter, S. W. Protective functions of heme oxygenase-1 and carbon monoxide in the respiratory system. Antioxid Redox Signal. 9, 2157-2173 (2007).
- Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo bioluminescence reporter gene imaging of human embryonic stem cells. J Vis Exp. , (2008).
- Calabrese, V. Vitagenes, dietary antioxidants and neuroprotection in neurodegenerative diseases. Front Biosci. 14, 376-397 (2009).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nat Med. 4, 245-247 (1998).
