Summary
نقترح نهجا ولد لتطبيع التصوير المقطعي الإسقاط الضوئية (BnOPT) التي تمثل خصائص امتصاص عينات تصوير دقيقة للحصول على الكمية ومضان اعادة البناء تصوير الشعاعي الطبقي. نستخدم الخوارزمية المقترحة لإعادة توزيع ومضان المسبار الجزيئي داخل أجهزة الحيوانات الصغيرة.
Abstract
الإسقاط الضوئية التصوير المقطعي هو تقنية التصوير ثلاثي الأبعاد الذي تم عرضه مؤخرا بوصفها أداة التصوير في المقام الأول في البيولوجيا التطورية ودراسات التعبير الجيني. هذه التقنية تجعل عينة بيولوجية شفافة بصريا من خلال التجفيف أولا وبعد ذلك وضع في خليط من الكحول وبنزيل بنزوات البنزيل في نسبة 2:1 (BABB موراي أو محلول واضح). هذه التقنية تجعل العينات البيولوجية شفافة بصريا بواسطة التجفيف الأولى هم في وضع حلول متدرجة الايثانول بعد ذلك في خليط من الكحول وبنزيل بنزوات البنزيل في نسبة 2:1 (BABB أو حل واضح ليالي موراي) واضحة. ويمكن بعد عملية المقاصة تكون مساهمة تناثر في العينة وجعل انخفاض كبير يكاد يذكر في حين لا يمكن أن تكون مساهمة امتصاص القضاء عليها كليا. عندما تحاول إعادة توزيع مضان داخل العينة قيد التحقيق ، وهذا يؤثر على عمليات إعادة البناء مساهمة ويؤدي ، لا محالة ، إلى التحف والصور أخطاء الكمي.. في حين يمكن خفض امتصاص مزيد مع بقاء أسابيع أو شهور في وسائل الإعلام تبادل المعلومات ، وهذا يؤدي إلى الفقدان التدريجي لمضان وإلى وقت طويل تجهيز العينة غير واقعي. هذا هو الصحيح عند إعادة بناء كل من عوامل التباين الخارجية (عوامل التباين الجزيئية) ، فضلا عن التباين الذاتية (على سبيل المثال إعادة بناء البروتينات الفلورية وأعرب وراثيا).
Protocol
التصوير الداخلي
يظهر الإعداد التجريبية بالتفصيل في الشكل 1. ألف ليرة سورية مصدر الضوء يخدم على حد سواء كما الإضاءة لقياس الاستيعاب والإثارة كمصدر للقياسات مضان وتصفيتها مع تمريرة نطاق ضيق BPF تصفية تدخل. مجموعة من ثابت ومتغير محايدة مرشحات الكثافة ND جنبا إلى جنب مع وجود آلية مصراع S تسمح للتحكم في كمية الضوء على عينة ويبقيه منخفضة بما فيه الكفاية لمنع أي photobleaching. تحقيق نموذج موحد الإضاءة باستخدام المتوسع شعاع تكون مع تلسكوب مجتمعة العدسات اثنين الجليل والناشر ملف. وغمس S عينة في حل المقاصة والذي عقد في مكان على حامل وتناوب على طول محورها العمودي عن طريق لمرحلة سرعة دوران عالية (نيوبورت ، PR50) مع دقة مطلقة 0.05 درجة. ثلاث وحدات التحكم اليدوي متميزة تسمح للمحور عمودي العينة أن تكون مائلة وتعديلها في طائرتها المتعامدة. تم الكشف عن إشارة مباشرة تضوء بواسطة الكاميرا CCD ، يتم تصفية إشارة مضان من خلال مرشح الضيقة تدخل الفرقة تمرير مقرونا تصفية longpass (Omega. البصرية ، براتلبورو ، VT) ، ثم جمعها مع عدسة telecentric TL. العدسات Telecentric تقدم ميزة توفير المميزات الفريدة التي تجعل منها مثالية لالمقطعي الإسقاط الضوئية. في الواقع وجود فتحة وقف تقع داخل التجمع العدسة عند النقطة البؤرية للعدسة يؤكد أن الأشعة ، والتي تجعل صورة وقف الفتحة ، سيتوجه موازية للمحور البصري القضاء عمليا أي تحريف ، وتقديم منظور التكبير نفسه للطائرات متعددة داخل عمق telecentric.
تحضير العينة
ويتبع الإجراء التالي من أجل إصلاح الأنسجة / الأجهزة
- يتم إصلاح العينات في منهاج العمل لمدة 8 ساعات في 4C.
- ثم يتم غسل عينة في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة
- تم تضمين نموذج في كتلة Agarose 0.8 ٪
- Agarose كتلة المجففة من خلال سلسلة من 20 ٪ الى 100 ٪ من الحلول الايثانول. هذه السلسلة الايثانول التجفيف الداخلي يساعد في تجنب أي انكماش غير متماثلة من العينة.
- أخيرا هو المحتضنة العينة 10 ساعة في الإيثانول بنسبة 100 ٪ من أجل إزالة أي محتوى الماء من العينة.
- وضعت العينة في محلول البنزيل 01:02 الكحول وبنزوات البنزيل عن الوقت اللازم للعينة واضحة. علما بأن الوقت يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا من عينة لعينة من بضع ساعات إلى عدة أيام.
- يمكن الايثانول في آثار ضئيلة يكون حاضرا في نهاية عملية تبادل المعلومات مما أدى الى قطع التحف في إعادة البناء بسبب الحركة الحرارية من الكحول داخل غرفة حل نفسها. من أجل تجنب هذه المشكلة ، وهي الثانية في دورة مقاصة الموصى بها.
- يجب أن يكون تنفيذ النقطة 4 و 5 في الظلام لتجنب أي عوامل التباين تبييض الفلورسنت أو البروتينات.
القلب تحضير العينة
ومن المهم لإزالة أي محتوى الدم من أي نوع من الأنسجة قبل أن التقط من أجل تجنب الآثار امتصاص عالية في إعادة البناء. يمكن أن يتبع الإجراء التالي.
- تخدير الفأر مع حقنة (IP) intraperitoneally مزيج من الكيتامين (90 ملغ / كلغ) وزيلازين (10mg/kg).
ملاحظة : "من هذه النقطة إلى الأمام ابقاء العينة محمية من الضوء" - ضخ 50 U الهيبارين (IP) ، وبعد خمس دقائق ، تنفيذ البطن الطولية.
- فتح الوريد الكلوي الأيسر (LRV) ويبث 20ml من محلول ملحي في IVC.
- وينبغي أن تكون كتلة agarose المجففة مع حضانات ، وأربعة ساعة واحدة ، في 20 ٪. 40 ٪ ، 60 ٪ ، والايثانول 80 ٪ ، ثم أخيرا ، وحضنت العينات في الإيثانول بنسبة 100 ٪ لمدة 10 ساعة (بين عشية وضحاها).
- ثم يتم إصلاح القلب بعد إجراء عينة الإعداد العام
ملاحظة : "من هذه النقطة إلى الأمام ابقاء العينة محمية من الضوء"
امتصاص إعادة البناء
تعمير امتصاص البصرية في غياب نثر في العام مماثلة لX - CT ، ويمكن الحصول عليها باستخدام مشترك backprojection الرادون تصفيتها الخوارزمية. ثم أخذت الصور بواسطة كاميرا امتصاص اتفاقية مكافحة التصحر في أكثر من 360 تضوء التوقعات بزاوية 1 درجة على طول المحور العمودي. أنه لأمر مريح لمحاذاة المحور الرأسي للعينة موازية لعمود بكسل اتفاقية مكافحة التصحر.
- مكان كتلة agarose في غرفة مليئة حل المقاصة
- عينة تضيء مع شعاع موازى لكلا الإثارة وقياسات انتقال
- تدوير أكثر من 360 عينة التوقعات بزاوية 1 درجة.
- الحصول على الصور في تضوء في كل من الاستيعاب (الذاتية) وموجات مضان.
- وضع مصراع الكاميرا لتجنب الإضاءة المستمرة وتقليل التبييض.
- استخدام AFiltered الخوارزمية backprojection الرادون لإعادة بناء tomographically العينة
مضان إعادة البناء
الخوارزمية المستخدمة لاستيعاب عمليات إعادة البناء غير صالحة لاعادة اعمار توزيع مضان ، وإذا لم تؤخذ بعين الاعتبار ، ومساهمة سوف يؤدي إلى امتصاص الآثار الشديدة.
- المضي قدما كما هو مبين في المقطع "Absoprtion إعادة البناء".
- في الوقت ذاته الحصول على الاستيعاب وقياسات مضان
- تجمع البيانات في حقل الصور تطبيع ولد
- كتابة المعادلات من نموذج إلى الأمام من انتشار الضوء عن موجات الذاتية ومضان.
- مصفوفة حساب الوزن على شبكة discretized للوظائف الخضراء من طراز الأمام
- عكس المصفوفة الوزن واضربها في مجال الكشف عن تطبيع صور ولد في الحصول على إعادة إعمار توزيع مضان في الكائن
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
جيم Vinegoni يقر بدعم من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) منحة - 1 - RO1 EB006432.
References
- Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sorensen, J., Baldock, R., Davidson, D. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-544 (2002).
- Lee, K., Avondo, J., Morrison, H., Blot, L., Stark, M., Sharpe, J., Bangham, A., Coen, E. Visualizing plant development and gene in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18, 2145-2156 (2006).
- Oldham, M., Sakhalkar, H., Wang, Y. M., Guo, P. Y., Oliver, T., Bentley, R., Vujaskovic, Z., Dewhirst, M. Three-dimensional imaging of whole rodent organs using optical computed and emission tomography. J. Biomed. Opt. 12, 1-10 (2007).
- Ntziachristos, V., Weissleder, R. Experimental three-dimensional fluorescence reconstruction of diffuse media by use of a normalized Born approximation. Opt. Lett. 26, 893-895 (2001).
