Summary
אנו מציעים גישה מנורמל נולד עבור טומוגרפיה הקרנה אופטי (BnOPT) אשר מהווה את מאפייני הקליטה של דגימות צילמו להשיג מדויק כמותי שחזורים הקרינה טומוגרפית. אנו משתמשים באלגוריתם המוצע לשחזר את התפלגות הקרינה בדיקה מולקולרית בתוך איברי חיה קטנה.
Abstract
טומוגרפיה הקרנה אופטית היא טכניקת הדמיה תלת ממדית, כי כבר הציג לאחרונה ככלי הדמיה בעיקר בביולוגיה התפתחותית והבעה מחקרים הגן. הטכניקה מעבד מדגם הביולוגי שקוף אופטית ידי הראשון dehydrating אותם ולאחר מכן הצבת בתערובת של בנזיל אלכוהול ו בנזיל בנזואט ביחס של 2:1 (באב או מוריי פתרון של נקה). הטכניקה הופכת דגימות ביולוגיות שקוף אופטית ידי הראשון dehydrating אותם פתרונות אתנול מדורגים ואז למקם אותם בתערובת של בנזיל אלכוהול ו בנזיל בנזואט ביחס של 2:1 (באב או פתרון ברור של מוריי) כדי לנקות. לאחר תהליך ניקוי תרומת פיזור במדגם, ניתן להפחית באופן משמעותי ועשה כמעט זניח ואילו תרומתו הקליטה לא ניתן למנוע לחלוטין. כאשר מנסים לשחזר את התפלגות הקרינה בתוך המדגם תחת חקירה, תרומה זו משפיעה על שחזורים מוביל, בהכרח, על חפצים התמונה שגיאות כימות .. אמנם הקליטה יכול להיות מופחת נוסף עם קביעות של שבועות או חודשים בתקשורת ניקוי, זה יוביל לאובדן הדרגתי של הקרינה ואת זמן ריאלית עיבוד המדגם. הדבר נכון כאשר הן בשחזור סוכנים בניגוד אקסוגניים (סוכנים בניגוד מולקולרית), כמו גם בניגוד אנדוגני (למשל שחזורים של חלבוני ניאון הביע גנטית).
Protocol
הדמיה נוהל
הגדרת הניסוי מוצג בפירוט באיור 1. LS מקור אור משמש הן תאורה עבור מדידות הקליטה כמקור עירור עבור מדידות הקרינה והוא מסונן עם במעבר צר הלהקה התערבות מסנן BPF. קבוצת קבועות ומשתנות ND מסננים צפיפות ניטרלי בשילוב עם נוכחות של תריס אוטומטי S מאפשרים לשלוט על כמות האור על המדגם לשמור אותו נמוך מספיק כדי למנוע כל photobleaching. תאורה מדגם אחיד מושגת באמצעות ההרחבה הקורה להיות עם טלסקופ עדשות בשילוב שני גלילי ו מפזר. המדגם S הוא שקוע בפתרון ניקוי מוחזק במקום על בעל וסובב לאורך הציר האנכי שלה בדרך לשלב הסיבוב במהירות גבוהה (ניופורט, PR50), עם דיוק מוחלט של 0.05 מעלות. שלושה בקרים ידני מובהק לאפשר ציר מדגם אנכי להיות מוטה ומותאמים במישור אורתוגונלי שלה. האות שקוף מזוהה ישירות על ידי המצלמה CCD; האות הקרינה מסוננת דרך מסנן פס צר לעבור התערבות יחד עם מסנן longpass (Omega. אופטי, Brattleboro, VT) ולאחר מכן אספו עם telecentric העדשה TL. עדשות telecentric להציע את היתרון של מתן מאפיינים ייחודיים ההופכים אותם אידיאליים עבור טומוגרפיה הקרנה אופטית. למעשה, הנוכחות של הפתח להפסיק הממוקם בתוך מכלול העדשה בנקודת המוקד של העדשה מבטיח כי קרני, שהופכים את התמונה של להפסיק את הצמצם, תטייל מקביל לציר האופטי כמעט ביטול כל עיוות פרספקטיבה ומתן ההגדלה זהה למטוסים מרובים בתוך עומק telecentric.
לדוגמא הכנה
ההליך הבא אחריו על מנת לתקן את רקמות / איברים
- דוגמאות שתוקנו ב-PFA עבור 8 שעות 4C.
- לדוגמה נשטף אז במשך 15 דקות ב PBS
- המדגם מוטבע בתוך גוש agarose 0.8%
- Agarose לחסום הוא מיובש באמצעות סדרה של 20% עד 100% של פתרונות אתנול. סדרה זו dehydrating הליך אתנול מסייעת להימנע מכל התכווצות סימטרית של המדגם.
- לבסוף המדגם הוא מודגרות 10 שעות אתנול 100% על מנת להסיר כל תוכן מים מן המדגם.
- שים את המדגם בפתרון 01:02 אלכוהול בנזיל בנזואט ו בנזיל בפעם הכרחי המדגם כדי לנקות. שים לב כי הזמן יכול להשתנות במידה ניכרת מן המדגם מדגם מתוך כמה שעות עד מספר ימים.
- אתנול עקבות מינימלי יכול להיות נוכח בסוף תהליך ניקוי והוליד לנתק את החפצים של שחזורים עקב תנועה תרמית של אלכוהול בתוך פתרון הסליקה עצמו. על מנת להימנע מבעיה זו, מחזור הסליקה השני מומלץ.
- נקודה 4 ו -5, יש לבצעו בחושך כדי למנוע הלבנת של סוכנים בניגוד או חלבוני ניאון.
לדוגמה הלב הכנה
חשוב להסיר כל תוכן דם מרקמות מוקדמת להיות צילמו כדי למנוע חפצים קליטה גבוהה שחזורים. ההליך הבא יכול להיות אחריו.
- להרדים את העכבר עם זריקה intraperitoneally (IP) של תערובת של קטמין (90 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10mg/kg).
הערה: ". מכאן ואילך להשאיר את המדגם מוגן מפני האור" - הזרק 50 U של הפרין (IP), ואחרי חמש דקות, לבצע laparotomy האורך.
- פתח את עורק הכליה השמאלית (LRV) ו להחדיר 20ml של תמיסת מלח לתוך IVC.
- הבלוק agarose צריך להיות מיובש עם ארבעה, incubations שעה אחת, 20%. 40%, 60% ו 80% אתנול, ולבסוף, דגימות מודגרת באתנול 100% במשך 10 שעות (לילה).
- הלב הוא קבוע אז בעקבות הליך המדגם הכללי הכנה
הערה: ". מכאן ואילך להשאיר את המדגם מוגן מפני האור"
הקליטה שחזורים
שחזור קליטה אופטית בהיעדר פיזור הם בכלל מקביל X-CT ו ניתן להשיג באמצעות backprojection משותף מסוננים אלגוריתם ראדון. התמונות הקליטה נלקחים אז שקוף על ידי מצלמה CCD מעל 360 תחזיות עם זווית 1 תואר לאורך הציר האנכי. זה נוח ליישר את הציר האנכי של המדגם במקביל לטור של פיקסלים של CCD.
- מניחים את גוש agarose לחדר מלא פתרון סליקה
- להאיר את המדגם עם קרן collimated עבור עירור והן מדידות הילוכים
- סובב מדגם מעל 360 תחזיות עם זווית תואר 1.
- רכישת תמונות שקוף על ספיגת שני (פנימי) ו אורכי גל הקרינה.
- המקום תריס להימנע תאורה רציפה להפחית הלבנה.
- השתמש afאלגוריתם iltered backprojection ראדון tomographically כדי לשחזר את המדגם
Fluorescence שחזורים
האלגוריתם המשמש שחזורים הקליטה אינו תקף עבור הפצה מחדש של הקרינה, ואם לא לקחת בחשבון את התרומה הקליטה יוביל ממצאים חמורים.
- המשך כמצוין בסעיף "שחזורים Absoprtion".
- רוכשת את שניהם בו זמנית הקליטה מדידות הקרינה
- מערבבים את הנתונים לתוך התמונות מנורמל שדה נולד
- רשום את המשוואות של המודל קדימה של התפשטות האור באורכי גל פנימי פלואורסצנטי.
- חישוב מטריצת משקל על רשת discretized עבור פונקציות גרין של המודל קדימה
- היפוך המטריצה במשקל הכפל אותו ב התמונות מנורמל זוהה שדה נולד כדי להשיג מחדש של חלוקת הקרינה באובייקט
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ג Vinegoni מודה תמיכה של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענק 1-RO1-EB006432.
References
- Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sorensen, J., Baldock, R., Davidson, D. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-544 (2002).
- Lee, K., Avondo, J., Morrison, H., Blot, L., Stark, M., Sharpe, J., Bangham, A., Coen, E. Visualizing plant development and gene in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18, 2145-2156 (2006).
- Oldham, M., Sakhalkar, H., Wang, Y. M., Guo, P. Y., Oliver, T., Bentley, R., Vujaskovic, Z., Dewhirst, M. Three-dimensional imaging of whole rodent organs using optical computed and emission tomography. J. Biomed. Opt. 12, 1-10 (2007).
- Ntziachristos, V., Weissleder, R. Experimental three-dimensional fluorescence reconstruction of diffuse media by use of a normalized Born approximation. Opt. Lett. 26, 893-895 (2001).
